Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Микробная деструкция маннанов растительного сырья и практическое применение полученных гидролизатов
1.1 Маннаны растительного сырья и их характеристика 9
1.2 Ферментативный гидролиз маннансодержащего сырья 14
1.2.1. Продуценты р-маннаназы 14
1.2.2. Факторы, влияющие на биосинтез маннаназ при культивировании продуцентов 16
1.2.3. Получение очищенных препаратов р-маннаназы и их физико-химические свойства 20
1.3. Функциональные свойства маннозы 29
1.4. Практическое применение препаратов Р-маннаназ 33
1.4.1 Использование Р-маннаназы с целью получения биомодифицированного корма 34
1.4.2. Перепеловодство как перспективное направление применения р-маннаназы 35
Заключение 39
Глава 2. Объекты и методы исследований
2.1. Объекты исследований. 41
2.1.1. Оживление чистой культуры 41
2.1.2. Культивирование микроскопического гриба Trichoderma harzianum F114 42
2.2 Определение активности ферментного препарата 42
2.2.1. Определение активности Р-маннаназы 42
2.2.2. Методы определения активности сопутствующих ферментов 44
2.3. Определение степени гидролиза маннанов 45
2.4. Общие биохимические и микробиологические методы исследования 45
2.5. Выделение и очистка ферментного препарата 46
2.5.1. Получение спиртоосажденного фермента 46
2.5.2. Очистка Р-маннаназы 46
2.6. Определение молекулярной массы 47
2.6.1. Определение молекулярной массы белка методом электрофореза 47
2.6.2. Определение молекулярной массы белка методом гель-фильтрации 48
2.7. Аминокислотный анализ 49
2.8. Оценка биологической ценности продуктов 50
2.9. Определение химического состава мяса 51
2.10. Кормление перепелов и проведение производственной проверки опытов 52
2.11. Статистическая обработка экспериментальных данных 53
Глава 3. Получение ферментного препарата р-маннаназы и исследование его физико химических свойств
3.1. Выбор активного продуцента Р-маннаназы 55
3.2. Влияние различных источников углерода и азота на биосинтез Р-маннаназы 57
3.3. Факторы, влияющие на биосинтез р-маннаназы Trichoderma harzianum F114 61
3.4. Оптимизация условий глубинного культивирования Р-маннаназы Trichoderma harzianum F114 65
3.5. Разработка условий получения очищенного ферментного препарата р-маннаназы 73
3.6. Молекулярная масса и аминокислотный состав молекулы р-маннаназы 77
3.7. Исследование влияния рН и температуры на активность Р-маннаназы 80
3.8. Исследование кинетики кислотной и термической инактивации р-маннаназы 81
3.9. Определение субстратной специфичности р-маннаназы 87
Глава 4. Биодеструкция маннанов растительного сырья
4.1. Исследование ферментативного гидролиза маннанов 89
4.1.1. Выбор оптимальных условий гидролиза маннансодержащего сырья
4.2 Технология получения маннозосодержащих гидролизатов...97
Глава 5 Использование маннозосодержащих гидролизатов в составе комбикорма для перепелов
5.1. Изучение влияния маннозосодержащих гидролизатов на продуктивные показатели перепелов 101
5.2. Оценка химического состава и биологической ценности мяса перепелов 106
5.3. Гистоморфологические исследования печени и мышечной ткани перепелок 110
5.4. Морфометрические характеристики мышечной ткани и печени перепелов 115
5.5. Экономическая эффективность использования гидролизатов при производстве перепелиного мяса и яиц 116
Выводы 122
Список литературы 123
Приложения 139
- Ферментативный гидролиз маннансодержащего сырья
- Культивирование микроскопического гриба Trichoderma harzianum F114
- Влияние различных источников углерода и азота на биосинтез Р-маннаназы
- Выбор оптимальных условий гидролиза маннансодержащего сырья
Введение к работе
Актуальность работы. Для обеспечения здоровья и нормальной жизнедеятельности организма человека необходимо полноценное сбалансированное питание. Одними из продуктов, уникальных по своей питательной ценности, которые способны восполнить и поддерживать в норме уровень необходимых питательных веществ, являются перепелиные яйца и мясо.
Перепеловодство является перспективной отраслью яичного и мясного птицеводства. Эта отрасль позволяет обеспечить население высококачественными продуктами питания в кратчайшие сроки и с минимальными затратами.
Известно, что качество мяса зависит от рациона кормления птицы. Учитывая, что в рецептуру комбикорма для перепелов входит значительная доля растительного сырья, содержащего некрахмалистые полисахариды (маннаны), возникла научно обоснованная необходимость применения ферментных препаратов, гидролизующих эти полисахариды. В то же время известно, что образующаяся под действием Р-маннаназы манноза обладает рядом функциональных свойств: участвует в синтезе гликопротеидов и гли-колипидов, иммунных тел, относится к витаминоподобным сахарам.
Вопросам применения Р-маннаназы в птицеводстве и изучению влияния маннозы на биохимические процессы в живом организме, а также на качество получаемых продуктов питания посвящены работы зарубежных ученых.
Однако в отечественной практике такие исследования отсутствуют.
В связи с этим поиск активных продуцентов р-маннаназ и применение их в кормопроизводстве с целью повышения выхода и биологической ценности продукции перепеловодства являются актуальными вопросами биотехнологии.
Настоящая работа выполнялась в соответствии с научным направлением кафедры микробиологии и биохимии Воронежской государственной
технологической академии по проблеме «Изыскание оптимальных условий биосинтеза микроорганизмами биологически активных веществ и изучение их физико-химических свойств» (гос. регистр. № 01930004491) и в рамках научно-технической программы «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники». Данная тема включена в координационный план РАН по программе «Микробиологический синтез и научные основы микробиологического получения практически ценных веществ».
Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы заключалась в разработке биомодифицированного корма для перепелов путем использования ферментного препарата Р-маннаназы, позволяющего улучшить биологическую ценность мяса и увеличить мясную и яичную продуктивность перепелов.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
выбор активного продуцента р-маннаназы;
оптимизация условий биосинтеза целевого фермента;
получение очищенного ферментного препарата Р-маннаназы и изучение его физико-химических свойств;
определение рациональных условий гидролиза маннанов растительного сырья;
исследование возможности применения маннозосодержащих гидро-лизатов для кормления перепелов;
сравнительная характеристика продуктивных показателей перепелов, откармливаемых биомодифицированным комбикормом и стандартной кормосмесью, а также гистоморфологические исследования тканей;
определение биологической ценности мяса;
расчет экономической эффективности производства перепелиного мяса и яиц с применением маннозосодержащих гидролизатов.
Научная новизна. В настоящей работе впервые получен ферментный препарат эндо-1,4-Р-маннаназы Trichoderma harzianum Fl 14, способный гидролизовать некрахмалистые полисахариды (маннаны) растительного сырья до маннозы.
На основании результатов исследования гистоморфологических характеристик и биологической ценности мяса перепелов впервые теоретически обоснована и практически подтверждена эффективность применения маннозосодержащих гидролизатов в составе комбикорма.
Практическая значимость работы. Разработана новая технология получения комбикорма, включающая ферментативный гидролиз маннан-содержащего растительного сырья. Применение биомодифицированного комбикорма способствует улучшению переваримости кормов, увеличению мясной и яичной продуктивности перепелов, а также повышению биологической ценности мяса.
Проведена промышленная апробация полученного комбикорма в условиях перепелиного хозяйства ООО «Интерптица», подтвердившая целесообразность и практическую значимость результатов исследования.
Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на конференциях различного уровня. Они были представлены на отчетных научных конференциях ВГТА (2002-2005 гг.), 8-ой 9-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино 2004, 2005); Московском Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2004, 2005 гг.); II Международной научно технической конференции «Прогрессивные технологии и оборудование для пищевой промышленности», посвященной 100-летию проф. Попова В.И. (г. Воронеж, 2004 г.); Международном форуме «Биотехнология и современность» (г.Санкт-Петербург, 2004, 2005 гг.)
Данная работа была представлена на конкурс молодых ученых, проходивший в рамках Третьего Московского международного конгресса
«Биотехнология: состояние и перспективы развития», отмечена дипломом за хорошую научно-исследовательскую работу.
Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 15 работ.
Структура И объем работы Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов (3 главы), заключения, выводов, списка использованных источников, приложений и представлена на 149 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал включает 36 рисунков и 28 таблиц. Библиография включает 142 наименований, в т. ч. 74 иностранных.
ЛИТЕРА ТУРНЫЙ ОБЗОР
Ферментативный гидролиз маннансодержащего сырья
Номенклатура ферментов описывает ниже указанные энзимы, катализирующие расщепление Р-маннанов, галактоманнанов и глюкоманнанов: 1. Эндо-1,4-р-глюканаза (К.Ф. 3.2.1.4) (1,4-p-D-niюкан-4-глюкан 4-глюканогидролаза), катализирует гидролиз 1,4-Р-гликозидных связей в целлюлозе, лихенине, Р-глюканах и в родственных олигосахаридах. 2. Р-Маннозидаза (К.Ф. 3.2.1.25) (маннаназа, манназа, P-D маннозид манногидролаза), катализирует гидролиз концевых невосстанав ливающих P-D-маннозных остатков в P-D-маннозидах; 3. Маннан 1,4-Р-маннобиозидаза (К.Ф. 3.2.1.100) (экзо-1,4-Р-маннобиогидролаза, 1,4-Р-О-маннан маннобиогидролаза) воздействует на (1— 4)-р-0-маннозидные связи в Р-маннанах с отщеплением маннобиозных остатков от невосстановливающего конца цепи; 4. а-Галактозидаза (К.Ф. 3.2.1.22) (мелибиаза, a-D-галактозид га-лактогидролаза) осуществляет гидролиз концевых невосстанавливающих a-галактозных остатков в галактанах и галактоманнанах; 5. р-Маннаназа (К.Ф. 3.2.1.78) (эндо-1,4- р-маннаназа, 1,4-p-D-маннан маннаногидролаза) неупорядоченно гидролизует (1—»4)-Р-маннозидные связи в маннанах, галактоманнанах, глюкоманнанах. В настоящее время вопросы поиска продуцентов р-маннаназы являются актуальными как для отечественных, так и зарубежных ученых. Р-Маннаназы широко распространены в природе, они обнаружены в созревающих плодах помидоров сорта Walter, а также в семенах Heinz 1439, продуцирующих активный энзим особенно на стадии прорастания [89]. Также Р-маннаназы были выделены из жаберной ткани голубой мидии Mytilus edulis и пищеварительного тракта моллюска Littorina brevicula [135, 136, 137]. Рядом ученых был выделен и очищен фермент из анаэробной бактерии кишечника человека Clostridium butyricum [140]. Из литературных данных известно, что способность к биосинтезу данного фермента проявляют многочисленные микроскопические грибы и бактерии, а также дрожжи. Р-Маннаназа синтезируется в основном микроскопическими грибами рода Aspergillus или Penicillium: Asp. aculeatus [84], Asp. awamori K4 [110], Asp. niger [140, 115, 69], Asp. oryzae NRRL 3488 [115], Asp. giganteus [123], Pen. purpurogenum [118], Pen. wortmanni [123]. Per Hagglund с соавторами обнаружили Р-маннаназу из Trichoderma reesei [101]. Способностью синтезировать данный фермент обладают термофильные грибы Thermoascus aurantiacus [87]. В литературе приводятся также данные о ряде бактерий - продуцентов Р-маннаназы. Китайскими авторами Li W., Dong Z. и др. [112] была выделена р-маннаназа из Bacillus subtilis ВМ 9602. Бактерии Bacillus licheniformis являются перспективным продуцентом бактериальной р-маннаназы [136]. Способность к биосинтезу активного фермента обнаружена у термофильных бактерий Thermotoga пеароШапа 5068 [90]. Работа О. Politz и др. посвящена термостабильной Р-маннаназе из морских бактерий Rhodothermus marinus [121].
Также к продуцентам указанного фермента можно отнести актиноми-цеты, однако они являются малоизученной группой микроорганизмов в отношении образования фермента. Показана способность синтезировать р-маннаназу актиномицетами Streptomyces ipomoea СЕСТ 3341 [115]. Arcand N., Shareck F. отмечено наличие маннаназы у Streptomyces lividans 66 [73].
Некоторыми авторами отмечается возможность получения реком-бинантного фермента. В частности, Sctati М.Е., Adermark Р. считают, что одним из возможных источников Р-маннаназы могут быть дрожжи Sac-charomyces cerevisiae [125]. Австрийские ученые Gibbs M.D., Reeves R.A. и др., выделили рекомбинантную Р-маннаназу из гипертермофильных бактерий Dictyoglomus thermophilum [98].
Анализ литературных данных показал, что в качестве источников получения активной Р-маннаназы могут быть выбраны культуры микроорганизмов из различных таксономических групп. Используя разные виды микроорганизмов, и даже штаммы одного вида, можно получить ферменты с различными свойствами.
Как известно, культивировать микроорганизмы с целью получения ферментов можно поверхностным твердофазным и глубинным жидкофаз-ным способами. Выбор способа зависит главным образом от аэрофилыю-сти микроорганизма, а также определяется природой образуемого целевого продукта. Биосинтез ферментов, по мнению ряда авторов, зависит от основных факторов: правильно выбранного микроорганизма - продуцента заданного фермента, рациональной питательной среды и оптимального режима культивирования отобранного штамма на специально разработанной среде.
При культивировании микроорганизмов для успешного роста и развития микробная клетка должна быть обеспечена всеми питательными веществами, необходимыми как для синтеза клеточных веществ, так и для получения энергии, затрачиваемой на осуществление этого синтеза и других процессов жизнедеятельности клетки.
Изучение процесса биосинтеза ферментов дает возможность повышать выход ферментов с помощью методов физиологического воздействия. Природа биосинтеза ферментов зависит от вида продуцента, наличия в них транспортных систем, потребления тех или иных питательных веществ.
Питательные среды, используемые при выращивании микроорганизмов, определяют синтез ферментов. Изучение физиолого-биохимических особенностей роста продуцента, а также условий, стимулирующих биосинтез фермента, позволяет выбрать питательные среды для промышленного применения.
Источники углеродного и азотного питания в биосинтезе ферментов крайне необходимы. Биологическая роль углеродных источников питания связана с энергетической функцией, а также определяет основные метаболические пути любого организма. Без азота невозможно формирование аминокислот, а, следовательно, белковых веществ и нуклеотидов. Микроорганизмы способны усваивать азот минеральных соединений и органический азот.
Исследования различных источников углерода на биосинтез Р-маннаназы Sclerotium rolfsii [124] показали, что уровень активности значительно варьирует в зависимости от источника углерода. Так, целлюлоза была наиболее эффективным стимулятором синтеза внеклеточной Р-маннаназы, обеспечивая активность 240 ед/мл. Питательные среды с глюкозой или маннозой обеспечивали достаточно высокую активность фермента, а использование галактоманнана способствовало значительному снижению ферментативной активности.
Культивирование микроскопического гриба Trichoderma harzianum F114
Для определения маннаназной активности использовали метод Со-моджи-Нельсона [126]. Данный метод основан на определении скорости ферментативной реакции, которая устанавливается по количеству редуцирующих Сахаров. Содержание редуцирующих веществ, освобождающихся в процессе гидролиза маннансодержащих субстратов под действием фермента, находят колориметрическим методом с применением реактивов Сомоджи и Нельсона. В результате реакции этих Сахаров с данными реактивами образуется окрашенное соединение голубого цвета. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию редуцирующих Сахаров,
За единицу активности р-маннаназы принимали такое количество фермента, которое гидролизует 1 мкмоль маннансодержащие субстраты за 1 мин в стандартных условиях. Для определения активности Р-маннаназы реакционную смесь, состоящую из 200 мкл раствора субстрата с массовой долей 1 % в 0,1 М ацетатном буфере рН 4,5 и 100 мкл раствора фермента, инкубировали в течение 40 минут при 60 С. Одновременно проводили контрольный эксперимент: к 200 мкл раствора субстрата с массовой долей 1 % добавляли 100 мкл раствора инактивированного фермента. По истечении времени гидролиза в опытную и контрольную пробы добавляли 1 см реактив Сомоджи. Затем пробирки с содержимым взбалтывали и помещали на кипящую водяную баню на 20 мин, потом охлаждали и вносили 1 см реактив Нельсона. Определяли оптическую плотность при 490 нм, толщина кювет - 1 см. Активность Р-маннаназы рассчитывали по формуле (2.1): -У где А - активностьфермента, ед/г или ед/см ; Ао - количество редуцирующих веществ, образовавшихся в результате гидролиза маннанасодержащих субстратов, мкг; М — молекулярная масса маннозы; п — количество ферментного препарата (г) или культуралыюй жидкости (см3); т — время гидролиза, мин; Для определения активности фермента по отношению к п-нитрофенилгликозидам реакционную смесь, содержащую 0,5 мл раствора субстрата в 0,1 М ацетатном буфере рН 4,5 и 0,5 мл раствора фермента инкубировали при 40 С в течение 30 мин. Реакцию останавливали добавлением 5 % раствора Ыа2СОз. Интенсивность окраски измеряли спектрометрически при длине волны 400 нм. Количество образовавшегося пара-нитрофенола в реакционной смеси определяли по калибровочному графику. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое катализирует расщепление 1 мкмоля субстрата в данных условиях.
Для определения целлюлазной активности по отношению к фильтровальной бумаге инкубационную смесь, содержащую 50 мг фильтровальной бумаги, 2,75 мл раствора 0,1 М ацетатного буфера, рН 4,5 и 0,25 мл раствора фермента инкубировали в течение 60 мин при 40 С и определяли восстанавливающие сахара, используя калибровочную кривую, построенную по глюкозе [52].
Активность ксиланазы определяли аналогичным образом, используя в качестве субстрата ксилан, определяя количество образовавшейся ксилозы.
Протеолитическую активность определяли модифицированным методом Ансона [52]. Реакционную смесь, содержащую 2 мл 2 % казеината натрия, растворенного в буфере и 2 мл раствора фермента инкубировали при 30 С в течение 10 мин. Затем реакцию останавливали добавлением 4 мл 0,3 М раствора трихлоруксусной кислоты. Осадок отфильтровывали. В супернатанте определяли количество тирозиновых остатков по методу Лоури [113].
За единицу протеолитической активности принимали такое количество фермента, которое за 1 мин при 30 С превращает в неосаждаемое ТХУ количество казеината натрия, эквивалентное 1 мкмоль тирозина. 2.3. Определение степени гидролиза маннанов
Для определения степени гидролиза маннанасодержащих компонентов реакционную смесь, содержащую 200 мкл субстрата, 1 мл 0,1 М ацетатного буфера рН 4,5 и 100 мкл фермента выдерживали при 60 С в течение 7 часов. Затем определяли восстанавливающие сахара, используя при этом калибровочную кривую, построенную по маннозе. Исходя из количества образовавшихся восстанавливающих Сахаров, рассчитывали степень гидролиза. 1. Микроскопирование культур проводили с помощью светового мик роскопа МБИ-3. 2. Величину рН определяли на потенциометре рН - 150 МА. 3. Определение редуцирующих веществ проводили микрометодом Со-моджи-Нельсона [126]. 4. Содержание белка в пробах определяли по методу Лоури [113], используя калибровочный график, построенный по бычьему сывороточному альбумину («Sigma», США) и спектрофотометрическому методу, основанному на различии в адсорбции при 280 нм [105]. Для снятия профиля эл-люции при хроматографии белок во фракциях определяли спектрофото-метрически на приборе UV-cord («LKB», Швеция). 5. Кинетические характеристики Р-маннаназы изучали на высокоочи-щенном препарате. Определение константы Михаэлиса, расчет термодинамических параметров осуществляли по Диксону и Уэббу [16]. 6. Инактивацию фермента проводили в интервале рН 2,0-8,0. Раствор фермента инкубировали при температуре 40-80 С и через определенные промежутки времени определяли остаточную активность. 2.5. Выделение и очистка ферментного препарата
Осаждение ферментного препарата проводили различными органическими растворителями (96 %-ным этанолом, изопропанолом и химически чистым ацетоном) при температуре 2 - 4 С. Для формирования осадка смесь выдерживали 30 мин. Осадок отделяли на рефрижераторной центрифуге при 5000 об/мин и высушивали при комнатной температуре.
Исследование влияния концентрации Н - ионов на полноту осаждения фермента проводили при концентрации спирта 60 %, величину рН культуральной жидкости доводили 1 М растворами НС1 или NaOH до нужного значения. В полученных препаратах определяли активность осажденного фермента и содержание белка.
Влияние различных источников углерода и азота на биосинтез Р-маннаназы
Глубинное культивирование микроорганизмов на жидких питательных средах находит широкое применение при получении ферментов. Питательные среды должны содержать все вещества и элементы, необходимые для биосинтеза биологически активных веществ.
При этом отправной точкой является выбор источников углеродного и азотного питания, необходимых для успешного роста и развития микроорганизмов.
Выбор источников углеродного питания. Биологическая роль углеродных источников питания связана с энергической функцией организма. Степень усвояемости того или иного соединения углерода часто зависит от его концентрации [11]. Источниками углерода могут быть различные органические соединения, их выбор зависит от физиологии продуцента и вида фермента, поэтому оптимальная дозировка источника определяется индивидуально для каждого микроорганизма. При биосинтезе ферментов источникам углерода придается особое значение, так как он часто выступает индуктором синтеза.
Исследования по подбору химического состава синтетической питательной среды проводили на фоне солевого раствора среды Чапека, поочередно варьируя качественный состав источников углерода [46]. Изучение биосинтеза Р-маннаназы при росте продуцента Tr. harzianum F114 на различных источниках углерода показало (рис. 3.1), что хороший рост гриба обеспечивали такие углеродные субстраты, как мальтоза, лактоза и раффиноза, что объясняется физиологическими потребностями продуцента, но значительный синтез Р-маннаназы был обнаружен при введении в состав питательной среды маннозы, глюкозы и фруктозы. Полученные данные свидетельствуют о том, что указанные источники углерода выступают в роли факторов, индуцирующих синтез Р-маннаназы. На среде с крахмалом и дульци том накапливалось минимальное количество биомассы гриба, что сопровождалось минимальным уровнем активности Р-маннаназы.
Учитывая, что манноза (эгшмер глюкозы), обеспечивающая наиболее высокий уровень биосинтеза р-маннаназы (162,8 ед/см ), является дорогостоящим и дефицитным углеводом, направленный биосинтез фермента можно осуществлять и на среде с глюкозой, использование которой в составе питательной среды также способствовало биосинтезу активной р-маннаназы (149,8 ед/см3).
При изучении влияния источников азота на биосинтез Р-маннаназы использовали различные минеральные соли. Источники азота вносили в питательную среду в количестве 0,1 % по азоту. Источником углерода при этом служила глюкоза концентрацией 4 % к массе среды. Данные, представленные на рис. 3.3, получены на 72-м ч роста, когда наблюдалась максимальная ферментативная активность в культуральной жидкости.
Проведенные опыты показали, что гриб хорошо растет на всех испытанных вариантах сред, однако внесение того или иного азотного источника ока зывает различное влияние на уровень маннаназной активности. Наилучшее в-лияние на накопление маннаназной активности оказывал нитрат натрия. Из всех прочих солей высокий уровень биосинтеза фермента обеспечивали аммонийные соли фосфорной кислоты. Интенсивный синтез фермента в присутствии этих солей можно объяснить тем, что они являются как источником азота, так и источником фосфора, который участвует в биоэнергетических процессах, протекающих в микробной клетке.
Интенсивному образованию ферментов способствует ряд условий, среди которых величина рН, температура культивирования и аэрация процесса занимают важное место. Активная кислотность среды. рН среды играет особенно большое значение при глубинном культивировании продуцента. Активная кислотность оказывает существенное влияние на морфологию продуцента, скорость роста и биохимию фермента.
Исследование влияния исходного значения рН среды на рост гриба Тг. harzianum F114 и биосинтез Р-маннаназы показало, что данный продуцент проявляет способность к росту в широком диапозоне значений рН от 2,0 до 8,0. Было установлено, что максимальный биосинтез фермента наблюдался при рН 4,0. Отклонение рН питательной среды от оптимальных для синтеза фер 0 мента значений как в кислую, так и в щелочную сторону влечет за собой снижение активности В-маннаназы (рис. 3.5).
Температура культивирования. Температура оказывает большое влияние на скорость биосинтеза ферментов при выращивании различных микроорганизмов.
На рис. 3.6 показано влияние температуры на биосинтез Р-маннаназы Tr. harzianum F114. Культивирование проводили при начальном значении активной кислотности питательной среды, равном 4,0.
Снижение температуры культивирования до 30 С приводило к уменьшению активности р-маннаназы на 26,5%, а повышение температуры до 40 С в значительной степени угнетало синтез фермента, активность которого достигала лишь 17,6% от максимальной величины. При дальнейшем увеличение температуры рост культуры отсутствовал. Температура 35 С обеспечивала наибольшее значение ферментативной активности.
Аэрация процесса. Аэробные условия культивирования создавали, помещая колбы на круговую качалку со скоростью вращения 220 об/мин. Интенсивность аэрации культивирования 7 . harzianum F114 варьировали изменением объема питательной среды в качалочных колбах емкостью 750 см3 от 100 до 500 см (с интервалом 100 см ).
Выбор оптимальных условий гидролиза маннансодержащего сырья
Действие ферментного препарата зависит от ряда факторов, важными из которых являются рН реакционной среды, дозировка ферментного препарата, температура, при которой протекает процесс гидролиза, а также его продолжительность. Эти исследования представляют определенный интерес, так как данные показатели являются важной характеристикой в разработке методов эффективного использования ферментного препарата. Для выбора оптимальных условий гидролизу подвергалась 25 %-ная смесь, состоящая из кукурузы, гороха и пшеницы. На рис. 4.3 представлена зависимость степени гидролиза маннанов от дозировки ферментного препарата Р-маннаназы. Фермент вносили в количестве 5-25 ед/г маннанов. Внесение фермента в концентрации 5 ед/г маннанов обеспечивало гидролиз на 57 % за 4 ч. При увеличении дозировки препарата до 10 ед/г степень гидролиза за это время составила около 70 %. Дозировка 15 ед/г обеспечивала максимальную степень деструкции маннанов - 95,0 %. Более высокая концентрация фермента не способствовала значительному увеличению степени гидролиза.
Далее исследовали влияние температуры в интервале 40-70 С на степень гидролиза маннанов. Как видно из табл. 4.2, при увеличении температуры от 40 до 70 С степень гидролиза возрастала. Если при температуре 40 С степень гидролиза составляла 40,4 %, то при температуре 50 С она достигала 62,3 %. Максимальная степень деструкции маннанов наблюдалась при температуре 60 С. Дальнейшее увеличение температуры приводило к снижению степени гидролиза, что, по всей видимости, связано с термической инактивацией белковой глобулы фермента.
Данные зависимости степени гидролиза маннансодержащих субстратов от рН реакционной среды (табл. 4.3) показали, что, при значении рН 3,0 за 6 ч степень гидролиза составила 65 %. Наибольшая степень гидролиза 96,0 % наблюдалась при рН 4,5. Данное значение рН соответствует оптимальному значению рН, при котором р-маннаназа проявляется максимальную ферментативную активность.
По результатам проведенных экспериментов были построены диаграммы влияния параметров процесса на степень гидролиза маннансодержащих субстратов (рис. 4.4). Таким образом, проведенные исследования позволили установить, что рациональными параметрами процесса гидролиза являются: дозировка ферментного препарата 15 ед/г, температура 60 С, продолжительность 3,5-4 часа.
Сухие компоненты среды поступают на автоматические весы. После взвешивания все твердые компоненты поступают в смеситель для приготовления производственной питательной среды. Сюда же подается вода через дозирующие устройства. При приготовлении питательной среды строго учитывается очередность внесения компонентов. Приготовление среды ведут при перемешивании и с подогревом, обеспечивающим растворение солей.
Подготовленная прогретая среда с помощью насоса поступает в нагреватель системы непрерывной стерилизации питательной среды для выдерживания при температуре 140 С с целью стерилизации. Охлажденная стерильная питательная среда направляется в чистый стерильный ферментатор, который заполняют на 65-75 % емкости.
Посевной материал подготавливают в посевном отделении. Исходная культура в виде суспензии пересевается вначале в колбы на качалки, затем подается в инокулятор. Выращенный посевной материал из инокулятора передается в ферментатор. В процессе культивирования растущая культура аэрируется кондиционированным обеспложенным воздухом. Культивирование проводят при температуре 35 С в течение 72 часов.
Готовая культуральная жидкость самотеком при перемешивании поступает в теплообменник для охлаждения. Необходимость охлаждения вызвана тем, что сразу всю культуральную жидкость обработать невозможно, а при длительном пребывании ее в сборнике может произойти инактивация ферментов. Из сборника охлажденная жидкость по мере необходимости на сосом подается на фильтрующую установку для отделения биомассы от жидкой фазы.
Фильтрат культуральной жидкости поступает в цех очистки и выделения ферментов, где подвергается концентрированию методом ультрафильтрации. Степень концентрирования ферментного раствора достигает величины 50-100 раз. Осаждение фермента органическим растворителем проводят в специальных реакторах-смесителях с антикоррозийным покрытием. Охлажденный раствор фермента через дозатор непрерывным потоком подается в реактор. Растворитель (этиловый спирт), предварительно охлажденный, в соответствующей дозировке подается в смеситель. После заполнения смесителя вод-носпиртовая смесь перемешивается в течение 5-10 мини остается в покое на 5-10 мин, за это время осадок формируется, хлопья укрупняются и опускаются на дно смесителя. Часть водноспиртовая смеси (надосадочной жидкости) удаляется декантацией, а оставшуюся суспензию направляют на сепаратор или центрифугу для отделения осадка. Сушку ферментного препарата проводят сублимационным способом при глубоком вакууме. Процесс высушивания включает три стадии: замораживание осадка, возгонка льда и удаление остаточной влаги. В первый период удаляется 12-18 % от общего содержания влаги, во второй - 50-65 % и в последний при температуре 32-35 С удаляется оставшаяся влага с таким расчетом, чтобы готовый продукт имел влажность 8-10 %. При высушивании в сублимационной сушилке инактивация фермента практически не наблюдается. Высушенный препарат подвергают измельчению. Степень дисперсности готового препарат должна быть 50-100 мкм. У ферментного препарата анализируют активность.
Полученный спиртоосажденный фермент р-маннаназы используется для ферментативного гидролиза зернобобовых компонентов комбикорма для перепелов. Технология получения биомодифицированного комбикорма для перепелов включает следующие стадии.
Зерновые культуры, согласно рецепту комбикормов, поступают в надсепараторный бункер и далее в зерновой сепаратор, где отделяются примеси, отличающиеся от зерна размерами и аэродинамическими свойствами. Частично очищенное зерно направляется в магнитный сепаратор для отделения от него металломагнитной примеси и далее поступает в наддробильный бункер. Из него зерно подается в дробилку, измельчается. Подготовленный продукт смешивается с водой в соотношении 1: 4. Смесь подвергают ферментативной обработке препаратом 3-маннаназы (15 ед/г маннанов) при температуре 60 С в течение 3-4 часов. По истечении процесса гидролиза полученный гидролизат подвергается распылительной сушке. Сухой гидролизат смешивают с остальными компонентами комбикорма.
