Введение к работе
з
Актуальность темы. По современным представлениям актин является одним из эвных универсальных белков не только эукариотическнх, но и прокариотических -ok (Nakamura et al. 1978). Это связано с рядом его уникальных свойств, таких, как юбность к саморегулирующейся сборке и разборке и поддержание динамического ювесия системы мономер-полимер (Wanger et al.. 1985), а также способность к лгию в контрактильном взаимодействии в комплексе с некоторыми актин-ывающими белками (например, миозином).
(ласспческой и достаточно детально изученной моделью такого взаимодействия :ет служить актомиозиновое сокращение мышечной клетки (Энгельгардт, Люби-а 1942).
Іаличие актина во всех типах клеток и высокий структурный и генетический кон-іатизм свидетельствуют об универсальности его функций в живой клетке (Когп, >). Сложный и динамичный актиновый каркас, наряду с тубулиновыми микротрусами, лежит в основе системы, составляющей понятие цитоскелета любой клетки, м числе и клеток растений.
5 последние годы в литературе стали появляться разнообразные сведения об ак-IX из растительных объектов. Изучение актина в растениях попрежнему сопряже-рядом трудностей в связи с низким содержанием его в цитоплазме растительной ки и-высокой лабильностью по отношению к протеазам. Поэтому эти сведения ются весьма отрывочными и неполными по сравнению с традиционными объек-і (мышечное сокращение, амебоидное движение). В связи с этим проблема био-пческой идентификации и пространственной визуализации актиновых компонен-является весьма актуальной. Будучи одним из основных компонентов сложного тлекса цитоскелета растительной клетки, актин принимает участие в осуществле-большинства функций как в цитоплазме: формирование микрокомпартментов і.ментативньїе циклы, биосинтез белка), направленное движение цитоплазмы и нелл. пространственное определение взаиморасположения составляющих клетки, ез клеточной стенки, митоз и мейоз (Schmit, Lambert. 1987; Bereiter-Hahn, 1988; dbody et al. 1992; Williamson, 1993); так и в системе межклеточных взаимодейст-участие в передаче сигнала с мембранных рецепторов (Drobak et а!., 1994). регу-1и транспорта веществ через плазмодесмы (White et al., 1994), а также в механиз-їлозмного транспорта (Cleary, 1995).
Іальнепшее изучение модификаций актинового цитоскелета и его функций в рас-іях необходимо для формирования более полной и целостной картины фчнкцио-)вания живой клетки.
Подходы к идентификации актина разнообразными методами детально разрабі ны лишь для традиционных мышечных объектов, в то время, как для растений методы нуждаются в существенной модификации с учетом их биохимической спе фики .
Кроме того, для детального рассмотрения функционирования актинового ш скелета очень важно дифференцирование полимерного и мономерного состоя этого белка в цитоплазме живой клетки. Имеющиеся традиционные иммуноцитс мические маркеры не способны различать глобулярную (мономерную) и фибрил; ную (полимерную) формы актина.
Цель работы. Целью данной работы было выделение, идентификация и очис фракций актина из различных тканей растений (корней проростков пшеницы и эк карпа незрелых плодов томата), разработка специфических маркеров на глобулярі и фибриллярную формы актина. Применение этих маркеров для выявления актш дот-блот анализе и методами электронной микроскопии. Визуализация с их помои особенностей строения актинового цитоскелета на ультратонких срезах и в субі точных препаратах корней проростков пшеницы и эндокарпа плодов томата.
В соответствии с данной целью, в работе решались следующие задачи:
-
Модифицировать традиционную методику выделения и обогащения фрак: актина для растительных объектов.
-
Синтезировать узкоспецифические маркеры на основе коллоидного золота выявления глобулярной и фибриллярной форм актина в дот-блот анализе и метод; электронной микроскопии.
-
Показать на электронно-микроскопическом уровне особенности актина рас тельного происхождения в сравнении с мышечными актинами.
-
Выявить морфологические особенности конфигурации актинового цитоскел на ультратонких срезах и в субклеточных препаратах тканей растений с использс нием синтезированных биомаркеров.
Научная новизна работы. Впервые удалось получить обогащенную актиі фракцию из корней проростков пшеницы. Разработан метод получения специфі ского маркера к филаментной форме актина на основе фаллоиднна и коллоидн золота.
С помощью синтезированных маркеров показаны некоторые особенности и ж ли строения актиновых филаментов на препаратах очищенного актина и на улы тонких срезах растительных объектов.
Разработан метод "давленного препарата" корней проростков пшеницы для эх тронно-микроскопической визуализации деталей морфологии актинового цитоске та с использованием специфических маркеров.
5 Практическая значимость работы. Результаты исследования вносят су шествен-1 вклад в изучение пространственной организации актинового цитоскелета растп-ьноп клетки. Они дают сведения о биохимических и структурных особенностях тительного актина и его роли в жизнедеятельности клеток растений. Синтезирован новый маркер, специфичный к филаментной форме актина и про-онстрнрованы возможности его применения в дот-блот анализе и различных элек-нно-микроскопических методах.
Препараты фаллоилин-коллоилное золото и антиактиновые антитела-коллоидное ото были использованы в исследованиях ряда лабораторий ИБФРМ РАН, а также еданы по заказам в следующие научные организации: Институт физиологии рас-ий им. Темирязева РАН (г. Москва). Институт ботаники им. Холодного АН Ук-ны (г. Киев). Институт физиологии и биохимии растений АН Молдовы (г. Киши-). Институт цитологии РАН (г. Санкт-Петербург), Санкт-Петербургский государ-;нный университет. На зашиту выносятся следующие основные положения:
-
Выделение и очистка фракций, обогащенных актином, из растительных объек-(корней проростков пшеницы и эндокарпа незрелых плодов томата), и их сравнимый анализ.
-
Синтез узкоспецифнческих маркеров на основе коллоидного золота для иден-икации глобулярной и фибриллярной форм актина с помощью различных мето-
-
Электронно-микроскопическое изучение морфологии актиновых филаментов из шх растительных объектов. Их сравнение с мышечными актинами.
I. Пространственная визуализация актин-содержащпх структур в цитоплазме кле-
растений с использованием специфических маркеров.
Работа выполнялась по плану НИР ИБФРМ РАН в рамках темы: '"Изучение
странственно-временной организации белков цитоскелета клеток растений", на-
ый руководитель темы к.б.н., с.н.с. О.И. Соколов. № гос. регистрации
частично работа пол\чпла финансовую поддержку Российского фонда фунда.мен-
>ных исследований (код проекта 94-04-13673-а).
Препараты маркеров на основе коллоидного золота были синтезированы совмест-
:о старшими научными сотрудниками лаборатории физической химии клеточных
.ктур Богатыревым В.А. п Дыкманом Л.А.
-Чпробацня работы. Основные результаты диссертационной работы представля-
:>. докладывались и обсуждались на: 20th Meeting of the Federation of European
:hemical Societies. Budapest (Hungary). 1990: 15 International Congress of
Biochemistn. Jerusalem (Israel). 1991: 21st Annual Meeting of the FEBS. Dublin (Irelan 1992: 3 Съезде Всероссийского общества физиологов растений. Санкт-Петербу 1993; International Symposium on Biological Motility. Pushcliino (Russia). 1994. а так на заседании Саратовского отделения Всероссийского биохимического общества и отчетных научных конференциях ИБФРМ РАН.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ в отече венных и зарубежных изданиях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти г: (включающих обзор литературы, описание материалов и методов исследования, ложенпе полученных результатов и их обсуждение), заключения и списка исполь ванных литературных источников. Работа изложена на 117 страницах, иллюстри вана 16 рисунками и включает 3 таблицы. Список использованных литератури источников включает 236 наименования.
