Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Этиология 12
1.2. Роль системы иммунитета при ВПЧ-инфекции 16
1.3. Эпидемиология .18
1.4. Клиническая картина 21
1.5. Течение 29
1.6. Прогноз 30
1.7. Диагностика 30
1.7.1. Методы оценки злокачественной трансформации клетки, информативные при ВПЧ-инфекции 31
1.7.1.1. Роль протеина Ki-67 в неопластической трансформации Протеин Ki-67: строение и функция .32
1.7.1.2. Пролиферативная активность клеток при генитальных бородавках и CIN .36
1.8. Лечение проявлений папилломавирусной инфекции .37
1.8.1. Лечение бородавок 37
1.8.2. Лечение генитальных бородавок .38
1.9. Наблюдение .47
1.10. Профилактика 47
1.11. Консультирование 51
Глава 2. Материалы и методы 52
2.1. Клиническая характеристика больных 52
2.2. Метод ПЦР .58
2.3. Методика изучения иммунного статуса 60
2.3.1. Подсчет числа лейкоцитов и анализ формулы крови .60
2.3.2. Выделение суспензии лейкоцитов из периферической крови .61
2.3.3. Анализ жизнеспособности клеток 62
2.3.4. Анализ фенотипа клеток методом проточной цитофлуориметрии 63
2.3.5. Определение иммунофенотипа лимфоцитов с использованием стабильных диагностикумов на основе моноклональных антител .66
2.3.6. Определение содержания в сыворотке крови IgG, IgM и IgA 67 2.4. Методика изучения интерферонового статуса .68
2.5. Иммуногистохимический метод исследования (ИГХ) 70
2.6. Статистические методы исследования .72 Глава 3. Молекулярно-биологическая и клинико-морфологическая характеристика различных клинических вариантов папилломавирусной инфекции .73
3.1. Молекулярно-биологические сопоставления при различных клинических вариантах папилломавирусной инфекции 73
3.2. Пролиферативная активность клеток различных клинических вариантов папилломавирусной инфекции .77
3.3. Формирование групп пациентов, результаты лечения не осложненных форм клинических проявлений папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек 85
Глава 4. Результаты лечения осложненных форм клинических проявлений папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек 90
4.1. Иммунологическая характеристика пациентов с осложненными формами клинических проявлений папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек 92
4.2. Клиническая эффективность лечения осложненных форм клинических проявлений папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек с применением иммунотропных препаратов панавир и виферон 95
4.3. Оценка иммунологической эффективности лечения осложненных форм клинических проявлений папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек с применением иммунотропных препаратов панавир и виферон 103
Глава 5. Внутриочаговая интерферонотерапия устойчивых к терапии форм клинических проявлений папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек, а также вариантов клинических проявлений инфекции ВПЧ с признаками инвазивного роста 112
5.1. Клиническая эффективность внутриочаговой интерферонотерапии устойчивых к терапии форм клинических проявлений папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек, а также вариантов клинических проявлений инфекции ВПЧ с признаками инвазивного роста 113
5.2. Иммунологическая эффективность внутриочаговой интерферонотерапии устойчивых к терапии форм клинических проявлений папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек, а также вариантов клинических проявлений инфекции ВПЧ с признаками инвазивного роста 119
5.3. Динамика пролиферативной активности клеток в процессе интерферонотерапии 122 Заключение 128
Выводы 135
Практические рекомендации 137
Список литературы
- Клиническая картина
- Подсчет числа лейкоцитов и анализ формулы крови
- Определение содержания в сыворотке крови IgG, IgM и IgA 67 2.4. Методика изучения интерферонового статуса
- Клиническая эффективность лечения осложненных форм клинических проявлений папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек с применением иммунотропных препаратов панавир и виферон
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Вирус папилломы человека (ВПЧ) является инфекционным агентом, около 35 типов которого вызывают поражения покровного эпителия и слизистых оболочек половых органов.
Доказана этиологическая роль различных типов вирусов папилломы человека в развитии вульгарных бородавок, плоских бородавок, подошвенных бородавок, остроконечных кондилом, гигантской кондиломы Бушке–Левенштейна, дисплазии шейки матки (CIN I, II, III), рака шейки матки, возвратного (рецидивирующего) папилломатоза гортани (zur Hauzen H. et al. 1996).
На сегодняшний день ВПЧ-инфекция является одной из наиболее распространенных и важных ИППП, которой инфицирована большая часть сексуально активного населения планеты (Bauer H. et al. 1992; Но G. et al. 1998). Пик ВПЧ-инфекции приходится на возраст 18–25 лет и снижается после 30 лет, когда существенно возрастает частота дисплазий и рака шейки матки, причем пик последнего приходится на 45 лет.
В России официально регистрируются лишь случаи аногенитальных
(венерических) бородавок, интенсивный показатель заболеваемости ими,
составивший в 2004–2005 гг. 32,9 случая на 100 тысяч населения, что
свидетельствует об эпидемическом характере распространенности этой
категории ПВИ (Евстигнеева Н.П. 2007). В то же время даже с учетом 10-кратного роста регистрируемой за последние 10 лет заболеваемости ПВИ (Киселев В.И. 2004), эти цифры не отражают масштабов ее истинной распространенности. Во многом это связано со сложностью диагностики субклинических и латентных форм инфекции.
К числу важных в эпидемиологическом и клиническом отношении особенностей ПВИ-инфекции, наряду с ее нередким субклиническим
течением, являются длительность инкубационного периода (от нескольких месяцев до нескольких лет), что также существенно затрудняет ее диагностику и лечение (Tagami Н. 1983).
Выделяют следующие этапы инфекционного процесса:
Первичная инфекция.
Персистенция вирусного генома в эписомальной форме с продукцией вирусных частиц.
Поликлональная интеграция вирусной ДНК в клеточный геном.
Индукция мутаций в клеточной ДНК, вызывающая нестабильность генома.
Селекция клона клеток с мутагенной ДНК, содержащей интегрированную вирусную ДНК.
Активное размножение клона клеток и рост опухоли.
Иммунный ответ хозяина играет важную роль в предотвращении
клинической манифестации ВПЧ-инфекции. ВПЧ вызывает как
гуморальный, так и клеточный типы иммунного ответа. Клеточный
иммунитет, особенно Т-клеточная система, играет основную роль как в
персистинции, так и спонтанном регрессе проявлений ВПЧ-инфекции,
который может наступить через 6-8 мес после их возникновения. Роль Т-
клеточного иммунитета в течении ВПЧ-инфекции подтверждается также
данными о более высокой частоте ВПЧ-ассоциированных заболеваний у
реципиентов трансплантата внутренних органов (Halpert R. et al. 1986) и
ВИЧ-инфицированных (Schafer A. et al. 1991), нарушении Т-клеточного
иммунитета у больных с генитальными бородавками (Kienzler J. et al. 1983),
снижении количества клеток Лангерганса в очагах цервикальной
интраэпителиальной неоплазии, а также большим количеством CD4+ и CD8+
Т-лимфоцитов в инфильтрате регрессирующих генитальных бородавок
(Tagami Н. 1983), предотвращении ВПЧ-инфицирования
экспериментальных животных и развития у них опухолевого процесса после иммунизации неструктурными белками ВПЧ (Е6 и Е7) (Brandsma J.L. 1994).
Роль клеточного звена иммунитета в патогенезе ВПЧ-инфекции также
подтверждается данными В.И. Киселева и О.И. Киселева (2003) о полной
ремиссии ВПЧ-ассоциированных заболеваний после специфической
стимуляции Т-клеточного иммунного ответа на Е6 и Е7 (суперэкспрессия которых на клеточной поверхности возникает при интеграции ВПЧ в геном клетки) (Киселев В.И., Киселев О.И. 2003). В этой связи важно отметить, что онкобелки Е6 и Е7 довольно иммуногенны и хорошо распознаются Т-лимфоцитами. Они проявляют свой эффект через формирование комплексов со специальными белками р53 и Rb, которые обычно выполняют в клетке противоопухолевую функцию.
Уровень пролиферативной активности клеток считают одним из
наиболее показательных маркеров роста новообразования. Оценку
пролиферативной активности клеток используют в определении прогноза
опухолевого роста, который диктует выбор стратегии и тактики лечения
(Smith J.K., Davidson H.M. 2005). Кроме того, ряд исследователей
использовали изменение показателей пролиферативной активности в
качестве маркера, свидетельствующего об эффективности
противоопухолевого лечения (Давыдова И.Л. 1996). Наиболее
информативным способом визуализации и оценки пролиферативной
активности клеток является иммуногистохимическое исследование,
поскольку маркеры выявляют не только клетки собственно в митозе, но и находящиеся в процессе подготовки к делению и, следовательно, свидетельствуют о пролиферативном потенциале (Кушлинский Е.Н, Герштейн С.А. 2001). В настоящее время широко используют маркер Ki-67 – ядерный негистоновый белок, представленный двумя различными формами с молекулярными массами 320 и 359 кДа, экспрессия которого строго
связана с клеточной пролиферацией и определяется в клетках, находящихся в G1, S, M, G2 стадиях клеточного цикла (Molino A. et al. 1997).
Высокая иммуногенность опухоли служит обоснованием применения различных методов иммунотропного лечения как метода монотерапии неоплазии, так и в комплексном лечении клинических проявлений папилломавирусной инфекции. Несмотря на значительное количество разнообразных препаратов и схем использования иммунотропных средств, в настоящее время эффективность различных методов лечения клинических проявлений папилломавирусной инфекции, даже с учетом проведения повторных курсов лечения, составляет 60–80% (Молочков В.А. 2000, Wiley D.J., Douglas J., Beutner K. et al. 2002). Чаще всего рецидивы обусловлены реактивацией вируса и в 25–50% случаев наступают в первые 3 месяца после лечения (Koutsky L.A., Kiviar N.B. 1999).
Недостаточная эффективность применяющихся методов терапии, а также высокое количество рецидивов после лечения различных форм папилломавирусной инфекции является основанием для разработки новых методов иммунотропного лечения этой инфекции, а также создания лечебно-диагностических алгоритмов, позволяющих оптимизировать лечебную тактику в каждом случае.
Цель исследования: Разработка патогенетически обоснованного
алгоритма лечения папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек
с возможностью прогнозирования вероятности рецидивирования
патологического процесса.
Задачи исследования:
1. Изучить клинические особенности течения папилломавирусной
инфекции кожи и слизистых оболочек в Московском регионе.
-
Оценить иммунологический статус пациентов с различными клиническими формами папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек.
-
Оценить пролиферативную активность клеток очага поражения при различных клинических проявлениях папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек.
-
Разработать методы комплексной терапии различных клинических форм папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек с применением методов деструкции и патогенетически обоснованных иммунотропных препаратов. Оценить клиническую и иммунологическую эффективность предложенных методов.
-
Разработать метод заместительной иммунотерапии устойчивых к лечению форм клинических проявлений папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек, а также вариантов клинических проявлений папилломавирусной инфекции с признаками инвазивного роста. Оценить клиническую и иммунологическую эффективность предложенного метода.
-
Оценить пролиферативную активность клеток очагов поражения устойчивых к лечению форм клинических проявлений папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек, а также вариантов клинических проявлений папилломавирусной инфекции с признаками инвазивного роста как прогностического критерия рецидивирования патологического процесса.
-
Разработать патогенетически обоснованный алгоритм тактики выбора методов терапии клинических проявлений папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек.
Научная новизна исследования
1. Изучены клинические особенности течения папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек в регионе Московской области.
-
Выявлены иммуноморфологические признаки, позволяющие прогнозировать течение папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек.
-
Оценен иммунологический статус пациентов с различными клиническими формами папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек.
-
Разработан патогенетически обоснованный алгоритм комплексной терапии различных клинических формам папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек с оценкой клинической и иммунологической эффективности предложенных методов лечения.
-
Исследована пролиферативная активность клеток очагов поражения клинических проявлений папилломавирусной инфекции на фоне заместительной иммунотерапии.
Практическая значимость работы
Проведенный клинико-статистический анализ заболеваемости различными
клиническими проявлениями папилломавирусной инфекции кожи и
слизистых оболочек позволил определить тенденции и особенности
изменений уровня заболеваемости на территории Московской области.
Получены данные, позволяющие оценить иммунологический статус
пациентов с различными проявлениями папилломавирусной инфекции,
предполагается зависимость тяжести течения неопластического процесса в
зависимости от степени супрессии клеточного звена иммунитета.
Разработаны иммуногистохимические критерии, позволяющие
прогнозировать течение паилломавирусной инфекции как в отношении
скорости пролиферации неопластической ткани, так и в отношении
вероятности рецидивирования патологического процесса после проведенной
деструкции новообразований. Разработан лечебно-диагностический
алгоритм, позволяющий выбрать тактику иммунотропного лечения папилломавирусной инфекции в зависимости от иммунологического статуса
пациента и морфологической картины патологического процесса, что позволяет значительно повысить эффективность терапии и сократить количество рецидивов клинических проявлений папилломавирусной инфекции.
Положения, выносимые на защиту
-
В настоящее время в популяции жителей региона Московской области увеличивается количество осложненных форм клинических проявлений папилломавирусной инфекции, растет процент рецидивирования после применения метода деструкции как монотерапии.
-
Пациенты с осложненными формами клинических проявлений папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек имеют признаки выраженного дефицита клеточного звена механизма иммунологической толерантности.
-
По уровню пролиферативной активности клеток ВПЧ-ассоциированные новообразования кожи представляют гетерогенную группу, с возрастанием пролиферативной активности в новообразованиях с признаками инвазивного роста.
-
Включение в курс терапии пациентов с осложненными формами клинических проявлений папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек иммунотропных препаратов наряду с методами локальной деструкции патогенетически обосновано и позволит значительно повысить клиническую эффективность терапии.
-
Применение внутриочаговых инъекций интерферона альфа как метода монотерапии устойчивых к лечению форм клинических проявлений папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек, а также вариантов клинических проявлений папилломавирусной инфекции с признаками инвазивного роста патогенетически обосновано и позволит значительно повысить клиническую эффективность терапии.
-
В процессе интерферонотерапии происходит выраженное снижение уровня пролиферативной активности клеток устойчивых к лечению форм клинических проявлений папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек.
-
Проведение клинико-иммунологического и морфологического обследования позволит разработать патогенетически обоснованный алгоритм тактики выбора методов терапии клинических проявлений папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек.
Апробация работы
Материалы и основные положения диссертации доложены на:
Заседании 1074 Московского общества дерматовенерологов (Москва, 18 апреля 2013г.);
Научно-практической конференции дерматовенерологов Центрального федерального округа РФ «Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии» (Москва, 23-24 мая 2013 г);
VI Международном форуме дерматовенерологов и косметологов, Москва, 20-22 марта 2013;
VII Международном форуме дерматовенерологов и косметологов, Москва, 19-21 марта 2014;
II Международном конгрессе евроазиатской ассоциации дерматовенерологов, 21-23 марта 2012 г.
III московском форуме « Дерматовенерология и косметология: синтез науки и практики», 16-18 октября 2013 г.
Всероссийской научной конференции с элементами научной школы «Инновационные технологии раннего выявления, профилактики новообразований кожи в практике и профессиональной подготовке дерматолога и косметолога», 14 ноября 2011г.
Диссертация апробирована на совместной научной конференции кафедры дерматовенерологии факультета повышения квалификации медицинских работников РУДН, кафедры кожных и венерических болезней ФППОВ Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, филиала «Вешняковский» МНПЦДК департамента здравоохранения Москвы, протокол № 22 от 02 декабря 2013 г.
Личный вклад автора
Все клинические наблюдения, методы исследования и лечения освоены
автором, и большинство из них выполнялись им лично. Составление
программы дифференциальной диагностики, клиническое обследование и
ведение всех 468 больных, забор биопсийного материала для
гистологического и иммуногистохимического методов исследований,
постановка иммуногистохимических реакций, оценка данных
иммунологического обследования, удаление новообразований различными
методами деструкции, последующее динамическое наблюдение за
пациентами, статистическая обработка и интерпретация полученных данных проведены лично Г.Э. Баграмовой. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач и их клинической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и их внедрения в практику.
Внедрение в практику
Результаты исследования внедрены в практику филиала
«Бабушкинский» Московского научно-практического центра
дерматовенерологии и косметологии Департамента Здравоохранения Москвы, в лечебную практику отделения дерматовенерологии и дерматоонкологии ФУВ МОНИКИ им. М.Ф. Владимирова. А также в учебный процесс кафедры дерматовенерологии ФПКМР РУДН и кафедры дерматовенерологии и дерматоонкологии ФУВ МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности.
Диссертация соответствует паспорту научной специальности 14.01.10 -кожные и венерические болезни. Медицинские науки.
Диссертация охватывает проблемы кожных заболеваний и инфекций передающихся половым путем.
Публикации материалов исследования
Опубликовано 20 работ по материалам предложенной к защите диссертации, из них 15 публикаций в ведущих рецензируемых научных журналах из перечня ВАК РФ, 1 методическая рекомендация, 1 учебное пособие.
Объем и структура диссертации
Клиническая картина
ВПЧ инфицирует пролиферирующие эпителиальные клетки базального слоя эпителия и отличается высоким тропизмом именно к этому типу клеток. Инфицирование эпидермиса происходит через микроповреждения (механические, бактериальные и др.), когда глубина их достигает базального слоя эпидермиса. Достаточно единичных вирусных частиц, чтобы вызвать инфекционный процесс. Репликация ДНК ВПЧ происходит только в клетках базального слоя, а в клетках других слоев вирусные частицы лишь персистируют [112]. Папилломатозные разрастания формируются в роговом слое в локусах максимальной репродукции вируса. Из этого следует, что методы лечения, направленные на удаление поверхностного слоя эпидермиса без санации клеток базального слоя, неэффективны и сопровождаются рецидивом заболевания.
Итак, проникая через микротравмы, ВПЧ инфицирует стволовые клетки базального слоя, которые затем являются постоянным источником инфицирования эпителиальных клеток, проходящих затем последовательные стадии дифференцировки с персистирующим репликативно неактивным вирусом.
После инфицирования ВПЧ в клетках эпидермиса нарушается нормальный процесс дифференцировки, особенно это касается клеток шиповатого слоя, в котором наблюдается клональная экспансия инфицированных ВПЧ клеток базального слоя, прошедших только первичную стадию дифференцировки. Эта 5 клональная экспансия связана с их трансформацией и последующей иммортализацией. Транформация и иммортализация клеток эпидермиса контролируется генами ВПЧ, кодирующими ранние белки Е6 и Е7 [6, 9, 97]. При этом морфологически наблюдается деформация внутренних слоев эпидермиса и общее утолщение кожи. По результатам детальных исследований популяций клеток, в которых наблюдается синтез вирусной ДНК уже в стадии развитой инфекции, а не при первичном инфицировании, клетки шиповатого слоя эпидермиса при переходе в зернистый слой оказываются наиболее активными в синтезе вирусной ДНК. Эта фаза жизненного цикла ВПЧ включает в себя как бы второй этап репликативной диссеминации внутри эпидермиса. В результате оказывается сильно пораженным зернистый слой эпидермиса. Причем экспрессия поздних генов Н1 и Н2 на этом этапе отсутствует. Она наступает только на конечной стадии дифференцировки в роговом слое, где и наблюдается активная сборка зрелых вирусных частиц, их выделение из клеток и почкование прямо на поверхности кожи. Именно эти участки кожи инфекционно опасны в отношении контактного заражения. Последовательное размножение ВПЧ в отдельных слоях эпидермиса с окончательным почкованием в отживающих клетках рогового слоя представляет собой особый случай тесного сопряжения жизненного цикла вируса с физиологическим процессом дифференцировки и смены эпителиальных клеточных элементов эпидермиса или слизистых оболочек соответствующей локализации.
Впервые о половом пути передачи ВПЧ-инфекции сообщили T.J. Barrett и соавт. в 1954 году, наблюдавшие 64 женщины, у которых генитальные бородавки развились спустя 4–6 недель после возвращения из Дальнего Востока их мужей, недавно страдавших генитальными бородавками и имевших половые контакты с местными женщинами [7]. Позже роль половой передачи ВПЧ-инфекции была доказана другими исследователями [95], а также подтверждена редкостью обнаружения ВПЧ-инфекции у женщин, не живших половой жизнью, и повышением её частоты с каждым новым половым партнером: ДНК ВПЧ в 6 образцах из цервикального канала и влагалища была выявлена у 3% женщин, не живших половой жизнью, у 7% – живших с 1 мужчиной, у 33% – с 2–4, у 53% – с 5 и более половыми партнерами [23]. Подобная зависимость была прослежена и в отношении мужчин [34]. Первый же (8-кратный за почти 20-летний период) рост частоты регистрации остроконечных кондилом в США в конце 1970-х годов совпал как с существенным повышением сексуальной активности молодежи, так и с резким ростом заболеваемости другими ИППП [27]. С внедрением в практику методов идентификации ДНК ВПЧ оказалось, что остроконечные кондиломы в развитых странах встречаются не реже гонореи, в 3 раза чаще, чем генитальный герпес [33].
Первые описания цитологических проявлений цервикальной ВПЧ-инфекции были сделаны в 1956 году. В 70-е годы генетическую гетерогеность ВПЧ удалось продемонстрировать с использованием техники молекулярной гибридизации. В 80–90 гг. с помощью эпидемиологических и молекулярно-биологических методов исследования была установлена четкая связь отдельных типов ВПЧ с развитием большинства раков аногенитальной области [14], а рак шейки матки отнесен к заболеваниям, передаваемым половым путем, что отражено в Пресс-релизе ВОЗ (1996) [132].
Подсчет числа лейкоцитов и анализ формулы крови
1. Определение нарушений механизмов апоптоза. По-видимому, уровень апоптоза, достаточный для поддержания баланса между пролиферацией и элиминацией клеток в нормальной ткани, значительно снижается при раковой трансформации, что и приводит к развитию опухоли [73]. Одним из наиболее информативных современных методов оценки деградации ДНК является предложенный впервые в 1992 г. Y. Gavrieli и соавт. метод TUNEL (от англ. «terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated biotin-dUTP nick-end labeling»), суть которого заключается в визуализации путем световой микроскопии специфической окраски ядер в клетках с фрагментированным хроматином [45, 90].
2. Определение уровня онкобелков Е-6 и Е-7. По данным многочисленных публикаций, одним из ключевых моментов трансформации клеточного роста является взаимодействие белков высокоонкогенных типов ВПЧ (в первую очередь Е-6) с онкосупрессором р53, что приводит к ингибированию последнего [100, 102]. Второй основной онкопротеин ВПЧ – Е-7, являющийся наряду с Е-6 фактором развития цервикального рака, оказывает свой эффект посредством связывания с онкосупрессором белка ретинобластомы (Rb) и его инактивации [107]. Определение уровня онкобелков Е-6 и Е-7 иммуногистохимическим методом является перспективным направлением для определения стадии вирусного развития (повышение синтеза онкопротеинов указывает на интеграцию инфекционного процесса, при которой вероятность спонтанной ремиссии очень мала). Уровни онкобелков достаточно значимо коррелируют с агрессивностью зарождающегося опухолевого процесса и могут рассматриваться как неблагоприятный прогностический признак.
3. Иммуногистохимический метод основан на выявлении Р16ink4a – клеточного протеина, участвующего в регуляции клеточного цикла. В нормальных эпителиальных клетках шейки матки протеин Р16ink4a экспрессируется в очень малом количестве и иммуногистохимическими методами не выявляется. Нарушение регуляции Р16ink4a, вероятно, связано с угнетением функции белка – супрессора опухолевого роста pRb в результате формирования инактивирующих комплексов с онкопротеином Е-7 (E-7/pRb). Поэтому Р16ink4a может рассматриваться как непрямой маркер активной онкогенной экспрессии ВПЧ высокого онкологического риска. В небольшом количестве клеток, особенно в клетках, подвергшихся плоскоклеточной метаплазии, Р16ink4a может экспрессироваться физиологически из-за процессов трансдифференцировки. В гистологических препаратах различие между дисплазией и метаплазией эпителия заключается в характерном окрашивании Р16ink4a – диффузно и локально соответственно [31, 85, 120]. Уровень пролиферативной активности клеток является одним из маркеров злокачественного роста. В связи с чем маркеры клеточного цикла (Ki67, PCNA и др.) часто используют для определения характера опухолевого роста.
Пролиферативная активность (ПА) является фундаментальным биологическим процессом, специфическим свойством популяции клеток, определяющим рост и развитие тканей организма. Одно из ключевых понятий пролиферации — клеточный цикл, который состоит из 4 периодов: собственно, деление клетки (митоз), пресинтетический период (G1), период синтеза ДНК (S) и премитотический период (G2). В отсутствие внешних стимуляторов размножения клетка может переходить в обратимое состояние – «вне цикла» (Go), или покоя (R) – где, благодаря метаболическим преобразованиям, она сохраняет жизнеспособность и пролиферативный потенциал. В нормальных тканях и большинстве медленно пролиферирующих новообразований приблизительно 85% 3 популяции клеток находятся в фазах G0 и G1, остальные 15% клеток – в S-, G2- и М-фазах клеточного цикла [104]. В настоящее время известно несколько ядерных антигенов, изменение экспрессии которых связано с ПА клеток. Однако наиболее изученным и специфическим из них является Ki 67 [137, 158, 161].
Антиген Ki-67 – ядерный негистоновый белок, впервые был описан Gerdes и соавт. в 1983 г. [46]. Ген, отвечающий за экспрессию белка Ki-67, локализован в 10 хромосоме, при этом цикл-зависимая экспрессия этого гена является абсолютно необходимой для осуществления клеточной пролиферации. К настоящему времени первичная структура протеина Ki-67 изучена достаточно подробно: он состоит из двух полипептидных цепей, с молекулярными массами 320 и 359 кДа [36]. Экспрессия белка строго связана с клеточной пролиферацией, антитела к которому реагируют с делящимися клетками, находящимися в G1, S, M, G2 стадиях клеточного цикла [87]. В течение интерфазы Ki 67 может быть обнаружен только в ядрах, тогда как в митозе большая его часть перемещается к поверхности хромосомы, где отмечается максимальное количество белка. В G1-фазе клеточного цикла происходит падение Ki 67, сменяющееся постепенным возрастанием в ходе фазы S и достижением максимума к следующему митозу [22, 103, 111]. Морфологические исследования пролиферирующих клеток показали, что антиген является компонентом ядерного матрикса [18, 80], при этом в течение клеточного цикла наблюдаются изменения внутриядерной локализации Ki-67.
Определение содержания в сыворотке крови IgG, IgM и IgA 67 2.4. Методика изучения интерферонового статуса
Консультирование при ВПЧ-инфекции включает информирование больных об их заболевании, методах лечения, возможности развития рецидива, связи ВПЧ-инфекции и рака, заразительности ВПЧ-инфекции с учетом полового пути передачи ВПЧ-инфекции, особое внимание следует уделять пропаганде использования механических средств защиты, что имеет, однако, ограниченный эффект, так как вирус обычно присутствует на наружных половых органах [135].
В заключение необходимо подчеркнуть, что в настоящее время эффективность различных методов лечения генитальных бородавок, даже с учетом проведения повторных курсов, составляет 60–80% [12]. Рецидивы в 25– 50% случаев наступают в течение первых 3 месяцев после лечения и чаще всего обусловлены реактивацией вируса. Таким образом, медикаментозная терапия должна быть направлена на эрадикацию вируса из организма и укрепление противовирусного иммунитета. При разработке стратегии лечения важно учитывать возраст больного, локализацию, количество элементов, площадь очагов поражения, частоту рецидивов, наличие сопутствующей соматической патологии (в том числе урогенитальных инфекций), переносимость метода лечения, а также клинический опыт врача. 2
В большинстве случаев для достижения хороших ближайших клинических результатов при лечении клинических проявлений ПВИ бывает достаточно применения методов деструкции (криодеструкции, электрокоагуляции, лечения лучами лазера или фотодинамической терапии), однако при оценке вероятности рецидивирования клинических проявлений ПВИ становится очевидной необходимость более или менее массивного курса иммунотропной и противовирусной терапии в каждом случае.
Настоящая работа выполнена на основании результатов клинических и лабораторных исследований 468 пациентов с установленными диагнозами различных клинических вариантов папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек – жителей Москвы и Московской области, находившихся на лечении и диспансерном наблюдении в отделении дерматовенерологии и дерматоонкологии Московского областного научно-исследовательского клинического института им. М.Ф. Владимирского, а также в Московском областном кожно-венерологическом диспансере и филиале «Вешняковский» Московского научно-практического центра дерматовенерологии и косметологии.
Среди обследованных пациентов было 257 мужчин и 211 женщин, возраст пациентов варьировал от 20 до 73 лет и в среднем составлял (33,4 ± 5,6 года). Распределение больных по возрастным группам представлено в табл. 2.1.
Как видно из таблицы 1, и при папилломавирусных поражениях кожи и при поражениях слизистых оболочек на момент первого обращения в клинику большинство больных было в возрасте от 20 до 40 лет (65,9 и 76,3%). С учетом анамнеза заболевания было установлено, что поражения кожи возникали чаще всего после 30 лет (72,03%), тогда как поражения слизистых оболочек часто возникали в более молодом возрасте – до 30 лет они были зарегистрированы у 47,3%. Эти данные свидетельствуют о том, что при папилломавирусной инфекции у взрослых поражения слизистых оболочек развиваются в более молодом возрасте, чем поражения кожи.
В целом у 261 пациента были диагностированы поражения кожи (у 163 – вульгарные бородавки, у 46 – подошвенные бородавки, у 52 – плоские бородавки). У 207 – поражения слизистых оболочек (у 193 – остроконечные кондиломы, у 14 – гигантская кондилома Бушке–Левенштейна). У 352 из 468 (75,2%) патологический процесс носил рецидивирующий характер, при этом в прошлом этим пациентам проводилось от 1 до 6 курсов деструкции новообразований различными методами.
Диагноз различных вариантов клинических проявлений папилломавирусной инфекции устанавливался на основании данных анамнеза, клинической картины, результатов гистологического и иммуногистохимического исследований, молекулярно-биологических методов исследования (ПЦР). Кроме того, пациентам проводили лабораторное обследование (клинический анализ крови, биохимический анализ крови, анализы мочи, иммунограмма, интерфероновый статус) и обследование с применением методов функциональной диагностики 4 (ЭКГ, рентгенография органов грудной клетки и костей скелета, ЭЭГ, УЗИ и др.). По показаниям больные были консультированы терапевтом, эндокринологом, стоматологом, окулистом, невропатологом, гинекологом, онкологом, иммунологом и другими специалистами.
В результате проведенных исследований в 15 случаях выявлено ускорение СОЭ до 18–30 мм/ч, в 23 случаях – лимфоцитопения от 18 до 26%, у 49 пациентов отмечался незначительный лимфоцитоз (до 42%), у 48 – эозинофилия (до 5–8%). Показатели биохимических исследований крови, включавшие определение билирубина, холестерина, мочевины, общего белка, индекса протромбина были в пределах нормы у всех больных, за исключением 18 больных сахарным диабетом, у которых был повышен уровень сахара крови и 37 больных, имеющих в анамнезе хронический вирусный гепатит, у которых отмечалось увеличение показателей билирубина, щелочной фосфатазы, АЛТ и АСТ. У каждого из 468 обследованных больных была исключена ВИЧ-инфекция (антитела к ВИЧ определялись методом иммуноферментного анализа).
Большинство больных с папилломавирусными поражениями кожи – 173 (66,3%) не могли назвать какую-либо причину возникновения заболевания, однако 20 (7,6%) указывали на предшествующие механические травмы или обморожение конечностей (как правило, неоднократную травматизацию одних и тех же локализаций); 68 (26,1%) – на предшествовавшие единичные или множественные эпизоды тактильных контактов с лицами, имевшими признаки папилломавирусной инфекции.
Клиническая эффективность лечения осложненных форм клинических проявлений папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек с применением иммунотропных препаратов панавир и виферон
Необходимо отметить, что 12 из 17 (70,5%) случаев рецидивирования вульгарных бородавок в 1 подгруппе и 9 из 21 (42,8%) случая во второй подгруппе наблюдались нами при локализации патологического процесса в области ногтевого ложа, что вызывало значительные трудности при деструкции новообразований. Значительная частота рецидивирования подошвенных бородавок (40% в подгруппе 1 и 45,8% в подгруппе 2) так же по нашему мнению в большой степени связана с трудностями полной деструкции патологического процесса на фоне выраженного гиперкератоза, характерного для подошвенных бородавок.
В целом, с учетом того, что пациенты 2 группы имели осложненное течение патологического процесса, результаты терапии в обеих группах можно признать удовлетворительными, а статистически достоверно большая комплаентность и тенденция к уменьшению количества рецидивов позволяют рекомендовать методику, применявшуюся во второй подгруппе, как метод выбора. 3
Оценка иммунологической эффективности лечения осложненных форм клинических проявлений папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек с применением иммунотропных препаратов панавир и виферон
Для оценки иммунологической эффективности комплексного метода лечения, проведенного в подгруппах 1 и 2, всем пациентам было проведено иммунологическое обследования до лечения и сразу после деструкции новообразований. Показатели иммунологического обследования пациентов подгруппы 1 представлены в таблицах 4.6. и 4.7.
Как видно из таблицы 4.6, включение в комплексную терапию пациентов с клиническими проявлениями папилломавирусной инфекции препарата панавир позволило достичь статистически достоверного повышения относительного количества Т-хелперов (р 0,05), тенденции к повышению иммунорегуляторного индекса, а также тенденции к повышению относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих активационные маркеры (CD 25, CD 71).
При анализе интерферонового статуса пациентов 1 подгруппы до и после лечения (табл. 4.7) необходимо отметить статистически достоверное (р 0,05) увеличение интерферонпродуцирующей активности клеток как в отношении ИФН-, так и в отношении ИФН-, на фоне некоторого увеличения спонтанной продукции ИФН и достоверного снижения уровня сывороточного ИФН.
В целом иммунологические изменения, зарегистрированные у пациентов 1 подгруппы на фоне терапии препаратом панавир, позволяют говорить о выраженной активации клеточного звена иммунитета. Полученные данные позволяют сделать вывод о патогенетической обоснованности включения панавира в комплекс терапии пациентов с осложненными формами клинических проявлений папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек.
Как видно из таблицы 4.8, включение в комплексную терапию пациентов с клиническими проявлениями папилломавирусной инфекции препарата виферон позволило достичь статистически достоверного (р 0,05) повышения относительного количества Т-хелперов, иммунорегуляторного индекса, относительного количества лимфоцитов и моноцитов, экспрессирующих активационные маркеры (CD25) а также нормализации изначально повышенного относительного количества лимфоцитов с маркерами адгезии (CD3/HLADr).
Таблица 4.9. Динамика показателей интерферонового статуса у пациентов подгруппы Параметр До лечения После лечения Норма Коэффицент Стьюдента T (р 0,05 при Т2,04) Коэффицен т Фишера F (р 0,05 при F2,4) подгруппы: статистически достоверное (р 0,05) увеличение интерферонпродуцирующей активности клеток как в отношении ИФН-, так и в отношении ИФН-, на фоне некоторого увеличении спонтанной продукции ИФН 7 и достоверного снижения уровня сывороточного ИФН. Однако выраженность стимуляции интерферонпродуцирующей активности клеток после применения виферона была несколько выше, чем у пациентов, применявших панавир.
Полученные данные позволяют аргументировано говорить о патогенетической обоснованности применения как иммуностимуляторов с противовирусным действием (панавир), так и заместительной иммунотерапии (виферон) в комплексном лечении пациентов с осложненными формами клинических проявлений папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек.
Таким образом, при анализе эффективности применения иммуностимуляторов с противовирусным действием (подгруппа 1), и заместительной неинвазивной иммунотерапии (подгруппа 2) в комплексном лечении пациентов с осложненными формами клинических проявлений папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек хорошая клиническая и иммунологическая эффективность зарегистрирована в обеих подгруппах. При сравнении результатов в подгруппах по клиническим данным (анализ ближайших и отдаленных результатов), и по иммунологическим параметрам (результаты иммунограммы и интерферонового статуса) несколько большая эффективность зарегистрирована у пациентов 2 подгруппы, получавших препарат виферон. 8
Клинические примеры
Больной К., 27 лет, предъявляет жалобы на образования в области ануса. Считает себя больным в течение 8 месяцев. В области ануса отметил появление единичных разрастаний и через 3 мес обратился к врачу-хирургу, который рекомендовал обратиться на прием к дерматологу. При посещении дерматолога были диагностированы остроконечные кондиломы и проведено однократное прижигание жидкостью. По словам больного, кондиломы регрессировали, однако спустя 1–1,5 мес появились новые, за последние 2 мес количество кондилом резко увеличилось и пациент повторно обратился к дерматологу.
При осмотре в области ануса и перианально определяются множественные папулезные элементы размером от 0,3х0,3 см до 1,3х0,6 см, розового цвета с вегетативными разрастаниями на поверхности (по типу «цветной капусты»), эластической консистенции (рис. 4.1). Ряд папул на поверхности вегетаций имеют белесоватый оттенок. Субъективных ощущений нет. При обследовании РМП, РПГА отрицательные.
Диагноз: рецидивирующие остроконечные кондиломы.
Лечение пациента проводилось в три этапа. На первом этапе проводились 2 внутривенные инъекции препарата панавир по 5,0 мл с интервалом 24 часа. На втором этапе проводилась деструкция новообразований препаратом Мардил цинк. На следующий день после деструкции проводилось три внутривенные инъекции препарата панавир по 5,0 мл с интервалом 72 часа. Затем 10 дней применялись ректальные суппозитории панавир. Через 2 недели после химической деструкции констатирована клиническая ремиссия. При контрольном осмотре через 3 и 6 мес рецидива заболевания не отмечено (рис. 4.2.).
