Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 8
1. История открытия семейства повторов LINE1 8
2. Структура повторов LINE1 8
3. Консенсусные последовательности элементов LINE1 разных видов 11
4. Зарегистрированные ретротранспозиции LINE1 14
5. Предполагаемые механизмы ретротранспозиции элементов LINE1 15
6. Воздействие элементов LENE1 на геном млекопитающих 23
7. Промоторные последовательности LINE1 29
8. Тканеспецифичность экспрессии LINE1 36
9. Белки, связывающиеся с видоспецифичными промоторами элементов LINE1 38
Материалы и методы 42
1. Выделение ядер и получение ядерного экстракта 42
2. ДНК, плазмиды и олигонуклеотиды 42
3. Метод торможения в геле (ретардация) 44
4. Электрофоретическое разделение белков и их окрашивание в геле 45
5. Инкубация белков, иммобилизованных на мембране с меченой ДНК (Саузвестерн-блоттинг) 46
6. Иммуноблоттинг 46
7. Ионообменная хроматография белков 47
8. Аффинная очистка белков 47
9. Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание 48
10. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) 49
11. Выделение ДНК. Гибридизация по Саузерну и дот-блот гибридизация 49
12. Выделение РНК. Электрофорез РНК в формальдегадном агарозном геле. Нозернблоттинг . 50
13.Иммунопреципитация 51
14. Иммунопрецепитация хроматина 52
15. Компьютерные методы исследования 53
Результаты 54
1. Тканеспецифичность экспрессии L1 крысы. 54
2. Геномная организация LlRn. Анализ промоторной области LlRn. 56
3. Выявление белков, связывающих промотор элементов L1 крысы in vitro. 61
4. Определение молекулярной массы PRLP- и nodel-связывающих белков. Аффинная очистка этих белков . 64
5. Идентификация PRLP- и nodel-связывающих белков. 67
6. Определение предполагаемых точек инициации транскрипции LlRn 73
7. Состояние метилирования геномных промоторов LlRn и влияние метилирования промотора LlRn на связьюание с белками Spl, Sp3 и МеСР2. . 75
8. Изучение связывания белков Spl, Sp3, МеСР2 с промоторами LlRn in vivo. 80
Обсуждение результатов 82
Выводы 98
Список литературы 100
- Предполагаемые механизмы ретротранспозиции элементов LINE1
- Белки, связывающиеся с видоспецифичными промоторами элементов LINE1
- Выделение РНК. Электрофорез РНК в формальдегадном агарозном геле. Нозернблоттинг
- Определение молекулярной массы PRLP- и nodel-связывающих белков. Аффинная очистка этих белков
Введение к работе
Изучение геномов высших эукариот показало, что они содержат огромное количество повторяющихся последовательностей ДНК, функции которых в последнее время только начинают раскрываться. В геномах млекопитающих повторяющиеся последовательности ДНК составляют около 50%, в то время как гены - менее 5%. Среди повторяющихся последовательностей ДНК можно вьщелить пять классов: простые повторы, например (А)„, (CGG)n; сегментные дупликации, состоящие из блоков длиной примерно 30-100 т.п.н.; тандемно повторенные последовательности, такие как центромеры и теломеры; ретропозированные копии клеточных генов - процессированные псевдогены; и мобильные элементы, часто относимые к диспергированным повторам (Lander et al, 2001). При этом, большую часть повторяющихся последовательностей ДНК млекопитающих (примерно 40-45% генома) составляют мобильные элементы -транспозоны и ретротранспозоны (Lander et al, 2001).
Широкое распространение мобильных элементов в геномах обусловлено существованием эффективного механизма размножения этих последовательностей. Некоторые семейства мобильных элементов кодируют белки, необходимые для перемещения и встраивания в геном их копий. Такие мобильные элементы являются автономными.
У млекопитающих наиболее распространенным семейством автономных мобильных элементов, содержащим способные к перемещению копии, является семейство LINE1 (long interspersed nucleotide element 1). Элементы LINE1 занимают примерно 10-20% генома млекопитающих, они способны размножаться в геноме с помощью механизма обратной транскрипции посредством РНК интермедиата и поэтому являются ретротранспозонами (Ostertag, Kazazian, 2001). Белки, кодируемые LINE1, способствуют ретротранспозиции не только этих элементов, но и другой клеточной ДНК, в том числе ДНК неавтономных ретротранспозонов (Wei et al, 2001; Dewannieux et al, 2003).
Данные о функционировании элементов LINE1 и их возможной роли в рекомбинации, репарации двунитевых разрывов, ретротранспозиции клеточной ДНК, организации структуры хроматина, геномных перестройках и регуляции транскрипции близлежащих генов больше не позволяют рассматривать повторы LINE1 лишь как «паразитическую» ДНК в геномах (Furano, 2000; Ostertag, Kazazian, 2001). Свое влияние на геном элементы LINE1 оказывают главным образом посредством ретротранспозиции, требующей экспрессии РНК LINE1 и кодируемых ими белков. Неконтролируемая ретротранспозиция элементов LINE1 может приводить к негативным последствиям дестабилизации генома клеток (Bourc'his, Bestor, 2004). Несмотря на это, ретротранспозиция элементов LINE1 не является абсолютно запрещенной у млекопитающих и происходит в определенных типах клеток (Brouha et al, 2002; Ostertag et al, 2002; Prak et al, 2003). Следовательно, существует четкий контроль активации и репрессии этих повторов in vivo. Одним из главных способов контроля ретротранспозиции элементов LINE1 является регуляция их экспрессии. Экспрессия элементов LINE1 тканеспецифична, однако механизмы ее регуляции до сих пор мало изучены. Белки, специфически связывающие регуляторные районы элементов LINE1, играют важную роль в контроле экспрессии этих ретротранспозонов. Поэтому можно ожидать, что изучение белков, специфически связывающих промоторные последовательности ретротранспозонов LINE1, позволит приблизиться к пониманию механизмов тканеспецифичной регуляции экспрессии повторов LINE1 в клетках млекопитающих
Выявление и идентификация белков, специфически связывающих промотор ретротранспозона LINE 1 крысы, являлось предметом настоящей работы.
Предполагаемые механизмы ретротранспозиции элементов LINE1
С помощью экспериментов по гибридизации было установлено, что элементы L1 широко распространены в геномах млекопитающих (Burton et al, 1986). Дальнейшие исследования показали, что повторяющиеся последовательности ДНК, негомологичные L1 млекопитающих, но относящиеся к семейству элементов LINEs на основании подобной структурной организации, присутствуют в геномах многих эукариот. Они были обнаружены у простейших (Kimmel et al, 1987; Martin et al, 1995), насекомых (Fawcett et al, 1986; Nocera et al, 1986; Burke et al, 1987; Nocera, Casari, 1987), растений (Schwarz-Sommer et al, 1987; Noma et al, 2000; Komatsu et al, 2003), амфибий (Garrett et al, 1989; Christensen et al, 2000) и птиц (Vandergon, Reitman, 1994; Haas et al, 1997).
Анализ последовательностей элементов LI млекопитающих позволил установить, что представители повторов L1 внутри какого-либо вида более гомологичны друг другу, чем элементы L1, принадлежащие разным видам, причем, чем дальше филогенетически отстоят исследуемые виды друг от друга, тем меньше степень гомологии их повторов L1 (Burton et al, 1986; Hutchison et al, 1989). Например, наиболее консервативная часть отдельно взятых последовательностей элементов L1 мыши, крысы и человека отличается от соответствующего района консенсусной последовательности L1 мыши на 4%, 15% и 33%, соответственно (Hutchison et al, 1989). Для указания совокупности элементов L1, принадлежащих какому-либо виду, были введены обозначения соответствующих семейств, например L1 человека {Homo sapiens) - LIHs, LI мыши (Mus domesticus) - LIMd, LI крысы (Ratfus norvegicus) - LIRn (Hutchison et al, 1989). Видоспецифичное распространение повторов LI позволяет предположить, что все современные семейства повторов L1 произошли от одного предшественника L1, существовавшего у общего предка всех млекопитающих более 100 миллионов лет назад (Furano, 2000). Ретротранспозоны L1 продолжают реплицироваться и к настоящему времени составляют около 20% геномов млекопитающих (Lander et al, 2001; Ostertag, Kazazian, 2001).
В секвенированных геномах человека, мыши и крысы обнаружено более 500 000 копий повторов LI (Lander et al, 2001; Waterston et al, 2002; Gibbs et al, 2004). Однако подавляющее число копий L1 являются дефектными, т.е. содержат мутации, лишающие их способности к дальнейшей ретротранспозиции (Fanning, 1983; Voliva et al, 1983; Scott et al, 1987). Кроме этого, у разных видов удалось выделить отдельные группы повторов — подсемейства L1, которые имеют одинаковые характерные отличия от консенсусной последовательности (Saxton, Martin, 1988; Cabot et al, 1997; Boissinot et al, 2000). Эти наблюдения позволили предположить, что все новые элементы L1 появляются в результате репликации всего нескольких активно размножающихся последовательностей LI (Furano, 2000). Согласно такой модели репликация определенного активного элемента L1 давала начало многим дефектным копиям, формирующим соответствующее подсемейство. Если в ходе ретротранспозиции активного элемента L1 появлялась его копия, сохраняющая способность к дальнейшей ретротранспозиции, но содержащая отличающие ее мутации, то репликация такой копии приводила к формированию нового подсемейства L1. Размножение элементов L1 согласно описанной модели может поддерживать наблюдаемую относительную однородность внутри подсемейств L1 у разных видов. С течением времени элементы L1 всех подсемейств с одинаковой скоростью накапливают индивидуальные мутации. В результате элементы L1 подсемейств, возникших относительно давно, успевают накопить больше мутаций и, следовательно, больше отличаются друг от друга, чем элементы подсемейств L1, появившихся относительно недавно. Поэтому, оценивая степень дивергенции различных подсемейств L1, можно определить время их возникновения. Так как во время появления подсемейств L1 может происходить дивергенция видов, то более старые подсемейства являются более филогенетически распространенными, чем молодые (Saxton, Martin, 1988). Поскольку единичная ретротранспозиция какого-либо элемента L1 является уникальным событием, которое произошло в определенном участке генома в определенное время, то анализ последовательностей L1 дает возможность проследить за молекулярной эволюцией как L1 элементов, так и всего генома в целом.
Элементы L1 крысы R. norvegicus за последние 2 млн. лет значительно амплифицировались и представлены в геноме тремя различными подсемействами: LlRo», LlRrvj и LlRnmivi2; элементы L1 этих подсемейств можно различить по специфическим нуклеотидным заменам в З -нетранслируемой области (Usdin et al, 1995; Hayward et al, 1997). Определение степени дивергенции элементов L1 каждого из этих подсемейств позволило установить, что подсемейства LlRa», LlRn3 и LlRnmiVi2 появились около 2.0, 1.0 и 0.5 млн. лет назад, соответственно (Cabot et al, 1997).
Интересно, что элементы подсемейства LlRnmi имеют двойственное происхождение: их 3 UTR происходят от ближайших хронологических предшественников — подсемейств LlRn4 и LlRn3. ORFI элементов подсемейства ІЛКПЩІУЙ содержит характерный участок длиной 21 п.н., отсутствующий у ORFI элементов подсемейств LlRa» и LlRn3 и поэтому, вероятно, происходит от более древней последовательности ORFL которая обнаруживается у элементов подсемейства LlRnanoestmi (Cabot et al, 1997; Hayward et al, 1997) (Схема 2). Предполагают, что более старая последовательность ORFI была захвачена современными LIRnmiva в результате рекомбинации, а затем за короткое время эволюционировала, образовав различные современные модификации - ORFI I-21pmod. (Cabot et al, 1997) (Схема 2). Вероятно, рекомбинация также ответственна за тандемную дупликацию у некоторых элементов подсемейств LlRri4, LlRn3 и LlRnmivt2 области ORFI длинной 66 п.н. (Cabot et al, 1997) (Схема 2). Такая дупликация является причиной наблюдаемого полиморфизма молекулярных масс транслированных in vitro белков pORFI L1 крысы (Hayward etal, 1997).
На основании анализа структуры последовательности повторов L1 было сделано предположение, что они являются перемещающимися элементами генома. Вскоре появились экспериментальные данные, подтверждающие, что повторы L1 способны к транспозиции. В частности, описаны случаи полиморфизма по наличию/отсутствию элементов L1 в определенных локусах, например: у мыши такой полиморфизм обнаружен в локусе р-глобиновых генов (Burton et al, 1985), у крысы - в локусах Igh и Mlvi-2 (Economou-Pachnis et al, 1985), у человека - в интроне гена с-тус (Hutchison et al, 1989) и др. Секвенирование последовательностей, прерванных встраиванием L1, — мишеней интеграции, а также последовательностей, окружающих интегрированные копии L1, показало, что прямые короткие повторы, фланкирующие элементы L1 являются сайтами дупликации мишеней интеграции (TSDs, target site duplications). Кроме этого, зарегистрировано несколько случаев встраивиния ретротранспозонов L1. Например, у двух мужчин больных гемофилией, но не у их родителей были обнаружены элементы L1, встроившиеся в кодирующую часть гена фактора VHI сворачивания крови (Kazazian et al, 1988). Так же встроившийся элемент L1 был выявлен в интроне гена с-тус в клетках опухоли молочной железы пациентки, но не обнаружен в здоровых клетках этой женщины (Morse et al, 1988). Все эти данные указывают на то, что ретротранспозиции L1 в геномах млекопитающих происходят и в настоящее время.
Белки, связывающиеся с видоспецифичными промоторами элементов LINE1
Транскрипция полноразмерной смысловой РНК элементов L1 является первым шагом, необходимым для ретротранспозиции L1, так как такая РНК L1 кодирует белки, необходимые для ретротранспозиции, а также является матрицей для построения новой ДНК копии элемента L1 в процессе обратной транскрипции (Ostertag, Kazazian, 2001). Для того чтобы определить область L1, ответственную за организацию транскрипции, различные фрагменты элементов L1 соединяли с репортерным геном, экспрессию которого изучали в культуре клеток. Эти эксперименты показали, что за транскрипционную активность элементов L1 человека, мыши и крысы отвечают последовательности, расположенные в видоспецифичных 5 -нетранслируемых районах (5 UTRs) этих повторов (Furano et al, 1988; Swergold, 1990; DeBerardinis, Kazazian, 1999). Т.е. промоторные последовательности элементов LI разных видов абсолютно не гомологичны в отличие от участков, кодирующих белки.
В отличие от человека, у мыши и крысы 5 -нетранслируемые районы элементов L1 состоят из двух частей: 5 -часть этих районов организована в виде тандемных повторов, которые поэтому называют мономерами (Padgett et al, 1988), а 3 -часть, длиной около 200 п.н. соединяет мономеры с ORF1 и называется «перемычкой» (Cabot et al, 1997) (Схема 1). У человека 5 UTR имеет длину около 900 п.н., а мономеры 5 -нетранслируемых областей L1 мыши и крысы имеют длину около 200 п.н. и 600 п.н., соответственно (Furano et al, 1988; Swergold, 1990; Naas et al, 1998; Goodier et al, 2001). Полное отсутствие гомологии между 5 -нетранслируемыми промоторными районами элементов L1 разных видов может объясняться повторяющимся приобретением повторами L1 новых регуляторных последовательностей (Scott et al, 1987; Furano et al, 1988; Padgett et al, 1988; Jubier-Maurin et al, 1992; Schichman et al, 1993). Новыми 5 -областями элементов LI становятся последовательности ДНК сайтов интеграции, а также последовательности ДНК, ассоциировавшиеся с элементами L1 в результате рекомбинации или переключения нити в процессе обратной транскрипции (Padgett et al, 1988; Buzdin et al, 2003). Какая-нибудь из приобретаемых 5 -областей элементов L1 с некоторой вероятностью может обладать промоторной активностью. Экспрессия функциональных элементов L1 с такой новой 5 -области может привести к размножению в геноме этих элементов L1 вместе с новой промоторной областью и, следовательно, образованию нового подсемейства L1, захватившего в качестве промотора уникальную последовательность ДНК.
Установлено, что даже у одного вида подсемейства элементов L1 могут иметь разные промоторные области. Например, у мыши выявлено 4 разных типа мономеров — F, A, Tf и Gf, каждый из которых организует 5 UTRs подсемейств LIMdF, LIMdA, LIMdTf и LlMdof, соответственно (Padgett et al, 1988; Schichman et al, 1993; Adey et al, 1994; Naas et al, 1998; Saxton, Martin, 1998; Goodier et al., 2001). Определение степени дивергенции элементов L1 каждого из этих подсемейств позволило установить, что подсемейства LlMdp и LIMdA появились в геноме мыши около 5 и 2.5 млн. лет назад, соответственно (Saxton, Martin, 1998), а подсемейства LlMdjf и LIMdGf- менее 0.5 млн. лет назад (Hardies, 2000; Goodier et al, 2001). Анализ промоторных последовательностей различных подсемейств L1 мыши показал, что мономер А абсолютно не похож мономер F, а мономеры Tf и Gf гомологичны друг другу и мономеру F примерно на 70% (Naas et al, 1998; Saxton, Martin, 1998; Goodier et al, 2001). Такая низкая степень гомологии также позволяет рассматривать мономеры Tf и Gf как заново приобретенные промоторные последовательности. В отличие от 5 UTR L1 мыши промоторные области современных подсемейств L1 крысы являются почти идентичными (степень гомологии 95%) (Cabot et al, 1997). Следует заметить, что 5 UTR современных семейств L1 гориллы и человека гомологичны на 95% (DeBerardinis, Kazazian, 1998).
Чтобы выяснить эволюционное происхождение видоспецифичной 5 -нетранслируемой промоторной области элементов L1 крысы, зонд к этой области гибридизовали с геномной ДНК различных видов. Результаты этого эксперимента показали, что зонд к промоторной области L1 крысы не гибридизуется с геномной ДНК млекопитающих, не относящихся к грызунам, а также не гибридизуется с геномной ДНК многих грызунов, включая мышь. Исходя из экспериментов по гибридизации можно заключить, что промоторная последовательность элементов LI R.norvegicus была приобретена видами Rattus sensu stricto около 2.5 млн. лет назад сразу после дивергенции Berylmys bowersi и Sundamys muelleri (Furano, 2000).
Эксперименты с репортерными генами показали, что 5 -нетранслируемый район L1 человека обладает промоторной активностью и поэтому называется промотором (Swergold, 1990). Также было установлено, что именно мономеры, но не «перемычки» из 5 UTR L1 грызунов стимулируют транскрипцию репортерных генов и поэтому называются промоторными мономерами (Nur et al, 1988; Severynse et al, 1992; Naas et al, 1998). В этих экспериментах определили, что промоторная активность 5 UTR L1 грызунов увеличивается пропорционально числу мономеров в их составе (Segal-Bendirdjian, Heidmann, 1991; DeBerardinis, 1999), причем большей транскрипционной активностью обладают промоторные мономеры молодых подсемейств. Например, у крысы промоторный мономер подсемейства LlRnmivi2 в 2 раза более активен, чем промоторный мономер подсемейства LIRm (Furano, 2000). У человека и мыши большинство специфичных смысловых транскриптов L1 синтезируется с наиболее молодых подсемейств L1 (Skowronski et al, 1988; Schichman et al., 1992). Кроме этого, установлено, что у мыши мономер самого старого подсемейства LlMdp полностью утратил промоторную активность, которая, однако, может быть восстановлена при реконструкции консенсусной последовательности мономера F за счет устранения накопленных мутаций (Adey et al, 1994). Предполагают, что приобретение новых промоторных районов элементами L1 является необходимым механизмом сохранения их репликативных возможностей, поскольку таким способом могут быть преодолены последствия инактивирующих мутаций, а также клеточных механизмов репрессии LI (Adey et al, 1994; Furano, 2000).
Строение промоторных последовательностей элементов L1. В экспериментах с репортерными генами установлено, что 5 -нетранслируемая область элементов L1 обладает внутренней промоторной активностью (Nur et al, 1988; Padgett et al, 1988; Swergold, 1990). В составе 5 -нетранслируемой области элемента L1 человека были обнаружены мотивы промотора для РНК-полимеразы Ш (Crowther et al, 1991). Впоследствии, было показано, что репортерный ген с промотором элемента L1 человека может транскрибироваться РНК-полимеразой Ш (Kurose et al, 1995). Однако, существует немало фактов, противоречащих участию РНК полимеразы Ш в транскрипции элементов LI in vivo. Во-первых, длина транскрипта L1 значительно превышает длину типичного транскрипта РНК полимеразы Ш, кроме этого, элементы L1 кодируют белки, а также содержат в своем составе последовательности, терминирующие транскрипцию, осуществляемую РНК полимеразой П. Так, известно, что элементы L1 содержат функциональный сигнал полиаденилирования - ААТААА (Moran et al, 1999). Этот сигнал необходим для терминации транскрипции, осуществляющейся РНК полимеразой П (Osheim et al, 1999); правильное отщепление и полиаденилирование транскрипта также требует участия РНК полимеразы П (McCracken et al, 1997; Hirose, Manley, 1998). Более того, установлено, что синтез смысловых транскриптов элементов L1 человека в клетках NTera2Dl ингибируется при добавлении такого уровня а-аманитина, который ингибируют РНК полимеразу П, но не РНК полимеразу Ш (Woodcock et al, 1996). Наконец, показано, что 5 UTR элементов L1 мыши и человека могут быть успешно заменены составным промотором для РНК полимеразы П в экспериментах по ретротранспозиции в культурах клеток (Moran et al, 1996; Naas et al, 1998). Все эти данные позволяют предполагать, что элементы L1 транскрибируются РНК-полимеразой П.
Выделение РНК. Электрофорез РНК в формальдегадном агарозном геле. Нозернблоттинг
На первом этапе исследования необходимо было выбрать ткань, в которой элементы L1 крысы (LIRn) экспрессируются с образованием дискретной смысловой РНК и кодируемых LIRn белков, и ткань, в которой такая экспрессия не происходит. Экспрессию РНК ретротранспозона LIRn изучали методом нозернблоттинга со специфичными зондами. Экспрессию одного из кодируемых LIRn белков - pORFI - изучали методами иммунопреципитации и иммуноблоттинга со специфичными антителами против этого белка. Для анализа мы использовали семенники и печень трехмесячных крыс, как источники половых и соматических клеток. Кроме этого, исследовали семенники 19-дневных крыс, так как у мыши на соответствующем этапе развития в семенниках выявляется полноразмерный смысловой транскрипт LI (Branciforte, Martin, 1994).
С помощью нозернблоттинга с однонитевыми зондами ГУ к 3 -области ORFI в клетках печени обнаружили набор смысловых и антисмысловых транскриптов LIRn всевозможных длин в диапазоне от 1 до 5 т.н., то есть дисперсный набор РНК. Эти данные соответствуют ранее охарактеризованной транскрипции LIRn в клетках печени (Nur et al, 1988). Дискретные смысловые транскрипты LIRn удалось обнаружить в клетках семенников крыс, причем полноразмерный транскрипт выявляется лишь в клетках семенников 19-дневных крыс (Рис. 1, А). В экспериментах по нозернблоттингу, при использовании однонитевых зондов I к промоторной области элемента LIRn наблюдали картину гибридизации, совпадающую с представленной на Рис. 1, А (данные не приведены). Для того чтобы выяснить, транслируются ли обнаруженные транскрипты LIRn в исследуемых тканях, выявляли белок pORFI крысы методом иммуноблоттинга (Рис. 1, Б) и иммунопреципитации (Рис. 1, В). Оба метода показали одинаковый результат. Оказалось, что белки с ожидаемыми молекулярными массами около 40 и 45 кДа присутствуют в экстрактах из клеток семенников (Рис. 1, Б, дорожки 2, 3; Рис. 1, В, дорожки 3,4), но не печени крысы (Рис. 1, Б, дорожка 4; Рис. 1, В, дорожка 5). Кроме этого, белок pORFI был обнаружен в клетках глиомы С6 (Рис. 1, Б, дорожка 1). Наличие белка pORFI в цитоплазме и ядрах клеток глиомы С6 подтверждено также методом иммуфлуоресценции (Рис. 2). Выявляемые изоформы белка pORFI с молекулярными массами около 40 и 45 кДа образуются, вероятно, в результате экспрессии подсемейств L1 Исследование экспрессии LlRn в разных тканях. А: Сравнительный анализ транскриптов LlRn из разных тканей. Тотальную РНК из семенников крыс в возрасте 19 дней (1, 4), и 90 дней (2, 5) и из печени крыс (3, 6) гибридизовали с однонитевыми ДНК-зондами к смысловой (1-3) и антисмысловой (4-6) РНК района IV LlRn (см. Рис. 3, Б). Стрелками отмечены выявляемые дискретные транскрипты. Слева указаны положения рибосомальных 28S и 18S РНК. Б: Выявление белка pORFI методом иммуноблоттинга в белковых экстрактах из клеток глиомы С6 (1), семенников 19-дневных крыс (2), семенников и печени 3-месячных крыс (3 и 4 соответственно). На дорожки наносили по 20 мкг белкового экстракта. Окраска с помощью антител rG24. Стрелки указывают положения выявляемых белков. В: Выявление белка pORFI методом иммунпреципитации в белковых экстрактах из клеток семенников 19-дневных крыс (3), семенников и печени 3-месячных крыс (4 и 5 соответственно). Инкубационная смесь содержала белковый экстракт из клеток семенников 3-месячных крыс в отсутствии антител гСт24 (1), инкубационная смесь не содержала белкового экстракта (2). Стрелки указывают положения выявляемых белков. М (здесь и далее) - маркер молекулярной массы (кДа). крысы, различающихся по длине ORFT, за счет тандемной дупликации участка 66 п.н. (Hayward et al, 1997) (Схема 2).
В результате описанных экспериментов удалось обнаружить ткани - семенники и печень, с разным уровнем экспрессии белка pORFI. Именно эти ткани мы использовали в дальнейшей работе для поиска белков, специфично связывающих промотор LlRn.
За транскрипционную активность L1 крысы отвечают тандемно повторенные последовательности - промоторные мономеры (длиной 609 п.н.), расположенные в 5 -нетранслируемом районе L1 и отделенные от ORFT коротким немономерным участком (Рис. 3, Б) (Nur et al, 1988; Furano et al, 1988). Большинство геномных последовательностей LINE1 человека и мыши усечены на разном расстоянии от 3 -конца, поэтому они не содержат промоторной области и, следовательно, являются транскрипционно не активными. В нашем исследовании важно было установить, какая доля геномных элементов LlRn содержит промотор. Для этого определяли относительное количество различных участков ретротранспозона LlRn в геноме крысы методом дот-блот гибридизации соответствующих ДНК-зондов (I-V, см. Рис. 3, Б) с геномной ДНК крысы; в качестве контроля эти зонды гибридизовали сами на себя. Результаты денситометрического анализа сигналов гибридизации представлены на графике (Рис. 3, А). Соотношение копий областей 3 UTR (зонд V) и ORFI (зонды Ш, IV) хорошо согласуется с ранее полученными результатами (Cabot et al, 1997). Интересующую нас относительную копийность промоторной области (зонды L П) мы определили впервые. Результаты показывают, что количество элементов L1, содержащих промотор, примерно в 6 раз меньше, чем количество элементов L1, содержащих 3 UTR, Следовательно, лишь небольшая доля геномных элементов L1 крысы может транскрибироваться. Компьютерный анализ расположения элементов LlRn в геномном сиквенсе хромосом крысы (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) показал, что G-бэнды хромосом (за некоторыми исключениями) и хромосома X обогащены этими ретротранспозонами, что хорошо согласуется с расположением L1 элементов на хромосомах мыши и человека (Korenberg, v Rykowsky, 1988; Boyle et al., 1990). Для локализации ретротранспозонов LlRn в интерфазных ядрах клеток глиомы С6 использовали метод FISH с зондом IV к фрагменту ORFI (Рис. 4, А) и зондом I к промоторной области LlRn (Рис. 4, Б).
Определение молекулярной массы PRLP- и nodel-связывающих белков. Аффинная очистка этих белков
Для поиска белков, связывающих промотор ретротранспозона L1 крысы, в качестве зонда использовали фрагмент промоторного мономера - последовательность PRLP (part of rat LINE1 promoter), соответствующую участку 47-457 п.н. промоторного мономера LIRn (Рис. 3, Б; Рис. 5, Д). Ядерные белковые экстракты из клеток семенников и печени 3-месячных крыс и семенников 19-дневных крыс тестировали на наличие PRLP-связывающей активности методом торможения в геле (ретардации). Эти эксперименты показали, что белки из всех исследуемых тканей образуют комплексы pl-p5 с зондом PRLP (Рис. 6, А) в присутствии 2000-кратного избытка неспецифичного конкурента - ДНК Rcoli. Поскольку выяснили, что PRLP-связывающая активность присутствует во всех исследованных ядерных экстрактах, т.е. не зависит от типа клеток и возраста крыс, то в дальнейших экспериментах по ретардации использовали белковый экстракт только из клеток семенников 3-месячных крыс.
Для проверки специфичности выявленных комплексов к инкубационным смесям добавляли избытки неспецифичной конкурентной ДНК - разрушенной ультразвуком до средней длины 500 п.н. геномной ДНК E.coli. Комплексы устойчивы в присутствии 500-, 1000- и 2000-кратных молярных избытков конкурентной ДНК E.coli (Рис. 6, Б, дорожки 1-3), однако комплексы pi, р2, р4, р5, исчезают и интенсивность комплекса рЗ существенно ослабевает при добавлении 10000-кратного молярного избытка конкурентной ДНК E.coli А: Инкубация ядерных белков из семенников крыс в возрасте 90 дней (1) и 19 дней (2), и из печени крыс (3) с зондом PRLP в присутствии 2000-кратного молярного избытка неспецифической конкурентной ДНК Е.соїі. Ф (здесь и далее) - свободный меченый зонд PRLP. Стрелки pl-p5 показывают PRLP-белковые комплексы.
Б: Ядерные белки из семенников 3-месячных крыс инкубировали с зондом PRLP. (1-5) -инкубационные смеси содержали 500-, 1000-, 2000-, 5000-, 10000-кратные молярные избытки конкурентной ДНК Е.соїі, соответственно. (6-13) - инкубационные смеси содержали 2000-кратный молярный избыток ДНК Е.соїі и дополнительно 50- и 100-кратные молярные избытки указанной сверху конкурентной ДНК. Стрелки pl-рЗ и р4, р5 показывают положение неспецифичных и специфичных комплексов, соответственно (здесь и далее).
В: Ядерные белки из семенников 3-месячных крыс инкубировали с меченым олигонуклеотидом nodel. ф — свободный меченый олигонуклеотид nodel (здесь и далее). 1 -инкубационная смесь содержала 2000-кратный молярный избыток конкурентной ДНК Е.соїі, (2-5) - инкубационные смеси содержали 2000-кратный молярный избыток ДНК Е.соїі и дополнительно 50- и 100-кратные молярные избытки указанной сверху конкурентной ДНК. Стрелка оЗ и стрелки ol, о2, о4 показывают положение неспецифичного и специфичных комплексов, соответственно (здесь и далее). (Рис. 6, Б, дорожка 5). Специфичность PRLP-белковых комплексов также проверяли по их устойчивости к избыткам специфичной и неспецифичной конкурентной ДНК. Добавление в ретардационную смесь 50-кратного молярного избытка немеченого фрагмента PRLP приводило к исчезновению комплексов р4, р5 (Рис. 6, Б, дорожка 6). В тоже время, добавление 50- и 100-кратных молярных избытков последовательности 3UTR, которая негомологична PRLP, но имеет приблизительно ту же длину, не приводило к вытеснению ни одного из наблюдаемых комплексов (Рис. 6, Б, дорожки 8, 9). Эти результаты показывают, что лишь комплексы р4, р5 сформированы за счет специфичного связывания ядерных белков с зондом PRLP. Используемый в настоящей работе фрагмент PRLP содержит сайт длиной 15 п.н., ответственный за связывание промоторного мономера LlRn с неидентифицированными ядерными белками (Furano, 2000), названный "nodel" (Рис. 5, Д). Олигонуклеотид nodel, являющийся фрагментом промотора LlRn, и олигонуклеотид YYlwt, содержащий консервативный сайт связывания для белка YY1, были также использованы в качестве конкурентов в ретардации. Добавление к инкубационным смесям избытков олигонуклеотида nodel приводило к исчезновению специфичных комплексов р4, р5 (Рис. 6, Б, дорожки 10, 11), а добавление избытков олигонуклеотида YYlwt не приводило к вытеснению ни одного из наблюдаемых комплексов (Рис. 6, Б, дорожки 12, 13). Таким образом, было показано, что сайт связывания специфично-взаимодействующих белков идентичен олигонуклеотиду nodel, а транскрипционный фактор YY1 не связывает последовательность PRLP in vitro.
С помощью ретардации мы показали, что сам олигонуклеотид nodel способен взаимодействовать с ядерными белками, формируя комплексы ol-o4 (Рис. 6, В, дорожка 1). Добавление к инкубационным смесям избытков специфичного конкурента - немеченого олигонуклеотида nodel (Рис. 6, В, дорожки 2,3) избытков олигонуклеотида YYlwt (Рис.6, В, дорожки 4, 5) показало, что комплексы ol, о2 и о4 образованы за счет специфичного взаимодействия ядерных белков с олигонуклеотидом nodel. Эти результаты позволили в дальнейшем использовать олигонуклеотид nodel, наряду с фрагментом PRLP, в качестве зонда для поиска LlRn промотор-связывающих белков.
Для дальнейшей характеристики выявленных PRLP- и nodel-связывающих белков определяли их молекулярную массу методом Саузвестерн-блоттинга. Ядерные белки разделяли с помощью электрофореза в SDS-ПААГ, переносили на мембрану и инкубировали с меченными зондами PRLP (Рис. 7, дорожки 1, 2) и nodel (Рис.7, дорожки 3, 4) в присутствии 1000-кратного молярного избытка неспецифичной конкурентной ДНК Exoli. В инкубационную смесь (Рис. 7, дорожки 2, 4) дополнительно добавляли 100-кратные молярные избытки соответствующих специфичных конкурентов. Результаты этого эксперимента демонстрируют, что зонд PRLP, так же как и зонд nodel, специфично взаимодействует с ядерными белками с приблизительными молекулярными массами 115, 100 (двойная зона), 70 и 60 кДа. Эти данные также свидетельствуют о том, что последовательности PRLP и nodel специфично взаимодействуют с одинаковым набором ядерных белков.
Для того чтобы определить молекулярные массы белков, взаимодействующих с промотором L1 крысы в нативных условиях, проводили их аффинную очистку. На первом этапе очистки ядерные белки фракционировали с помощью ионообменной хроматографии на DEAE-сефарозе. Фракции, смытые с колонки линейным градиентом NaCl, анализировали с помощью ретардации (Рис. 8). Белки, ответственные за образование специфичных комплексов р4, р5, элюировались во фракциях 2-6. Для дальнейшей очистки PRLP-связывающих белков использовали аффинную хроматографию.
