Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ ; 4
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
Глава I. ХРОМОСОМЫ В НАЧАЛЬНОМ ЭМБРИОГЕНЕЗЕ ЖИВОТНЫХ. . .
Некоторые морфологические особенности становления генетического аппарата у ряда видов животных. ...
Хромосомы млекопитающих на ранних стадиях
эмбриогенеза. ................... 13
Глава 2. ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ЯДЕРНОГО АППАРАТА
В НАЧАЛЬНОМ ЭМБРИОГЕНЕЗЕ МЛЕКОПИТАЮЩИХ 23
Глава 3. ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
УЧАСТКОВ ГЕНОМА НА ПРЕПАРАТАХ ш situ ...... 29
Глава 4. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ . . . 40
Материал исследования
Методы приготовления и окраски препаратов 41
РЕЗУЛЬТАТЫ 54
Глава 5. ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГАМ И ЦИТОХИМИИ ХРОМОСОМ
В НАЧАЛЬНОМ ЭМБРИОГЕНЕЗЕ МЫШЕЙ 58
Формирование метафазы первого деления дробления .
Изучение хромосом первого деления дробления
с использованием метода дифференциальной окраски. . 59
Изучение хромосом второго деления дробления .... 72
Сопоставление длин хромосом первого и второго
делений дробления ....... 78
Влияние БУдРА и Хехста 33258 при культивировании
зигот in vitro на хромосомы 81
Стр.
Окрашивание хромосом первого деления дробления
различными флуорохромами 83
Глава 6. адРЫШКООБРАЗУКВДЕ РАЙОНЫ ХРОМОСОМ В
НАЧАЛЬНОМ ЭМБРИОГЕНЕЗЕ МЫШЕЙ 86
Выявление ядрышкообразущйх районов метафазных хромосом у эмбрионов с нормальным кариотипом^ . . .
Определение времени начала экспрессии ЯОР
отцовского и материнского происхождения ...... 94
Окрашивание серебром интерфазных ядер эмбрионов
мышей 95
Попытка выявления активных кластеров генов р-РНК
при помощи реакции ник-трансляции m situ .... 97
Глава 7. ОБСУВДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 105
ВЫВОДЫ 123
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. 124
Введение к работе
В 1972 г. академик Б.Л.Астауров, открывая 2-ой съезд Всесоюзного Общества генетиков и селекционеров, сказал: "Я твердо уверен, что именно решение проблем осуществления наследственной информации в процессах индивидуального развития, проблем генетики развития, стало сейчас направлением главного удара не только генетики, но и всей современной общей биологии" (Астауров Б.Л., 1972).
Прошедшие годы полностью подтвердили предвидение Б.Л.Астауро-ва. В настоящее время проблемы генетики индивидуального развития, в целом, и генетики развития млекопитающих, в частности, привлекает внимание широкого круга специалистов самого различного профиля. Особенно интенсивно разрабатываются молекулярно-биологиче-ские аспекты генетики развития, механизмы активации и инактивации генетических локусов (см.монографии: Корочкин Л.И., 1977; Нейфах А.А., Тимофеева М.Я., 1977; Кафиани К.А., Костомарова А,А., 1978), в том числе и в исследованиях, выполненных на зародышах
МЛекОПИТаюЩИХ (СМ. Обзоры: Mintz, 1974; McLaren, 1976; Sherman, 1979; Magnuson, Epstein, 1981; Johnson, 1981).
Однако молекулярно-биологические и молекулярно-генетические подходы отнюдь не могут считаться единственными способами изучения механизмов реализации генетической информации в раннем эмбриогенезе млекопитающих, необходимо знать, каковы особенности структурной организации хромосомного аппарата у ранних зародышей, т.е. проводить цитогенетические исследования.
Цитогенетические аспекты развития млекопитающих разработаны крайне недостаточно. Это направление начало успешно развиваться после создания современных методов метафазного анализа хромосом ранних зародышей, т.е. лишь в середине 70-х и начале 80-х гг. (Дыбан А.П., 1970, 1974; Дыбан А.П., Баранов B.C., 1978; Ды-бал А.П., 1979; Баранов B.C., 1983). В этих работах основное внимание обращено на влияние различных хромосомных аномалий на течение эмбриогенеза, т.е. на выявление стадии и конкретных патогенетических процессов, которые нарушаются при трисомиях и моносо-миях. Полученные факты позволили сформулировать гипотезу о дифференциальной активности хромосом в раннем эмбриогенезе млекопи-тащих, т.е. предположить наличие в геноме млекопитающих "ран-ню: генов", локализованных в некоторых, но отнюдь не во всех хромосомах, и определенным образом влияющих на морфогенетические процессы, осуществляющиеся еще в доимплантационном периоде (Дыбан А.П., 1979). Развивая эту гипотезу, было высказано предположение и о взаимодействии гомологичных хромосом еще на одноклеточной стадии, благодаря которому происходит активация генетических локусов, т.е. "ранних генов" (Баранов B.C., 1983).
Это направление исследовании с полным правом следует отнести к феногенетике млекопитащих, так как посредством патогенетических и эмбриологических методов в данных работах выявлялись фе-нокритические фазы для трисомий и моносомий, т.е. решалась задача, органически входящая в основную проблему феногенетики: "Поиску различий между мутантними и немутантными особями, начиная: с первых стадий эмбриогенеза ... накоплению данных о фено-кржтических фазах в развитии (Тимофеев-Ресовский Н.В. и др., 1977).
Однако, несмотря на то, что применение новейших методов цитогенетики в области экспериментальной эмбриологии, является многообещающим, следует признать, что в настоящее время этот подход в познании закономерностей онтогенеза млекопитающих исполь- зуется недостаточно. В основном это объясняется трудностью приложения современных патогенетических приемов, т.е. необходимостью серьезной их модификации при исследованиях хромосом у ранних зародышей млекопитающих. Особенно велики методические трудности при исследовании самых начальных стадий развития, когда из хромосомных наборов отцовской и материнской гамет формируется хромосомный аппарат эмбриона. "Определенный ход патогенетических процессов в этот момент обеспечивает преобразование дозародышевой (материнской) генетической конституции в дефинитивную конституцию потомка и обеспечивает новую возникающую индивидуальность генетической информацией на оставшийся отрезок индивидуального развития" (Астауров Б.Л., 1968). Именно на этих стадиях могут возникать те нарушения хромосомного аппарата, которые приводят к хромосомным эмбриопатиям, что представляет существенный интерес для экспериментальной медицины.
Таким образом, важность изучения структурной организации ядра и особенностей хромосомного аппарата зиготы и первых бластомеров зародышей млекопитающих не вызывает сомнения. Вместе с тем, именно эти стадии эмбриогенеза млекопитающих цитогенетически изучены крайне недостаточно. Так, например, одним из основных цитологических явлений, присущих эмбриогенезу животных, является гетероцикличность родительских наборов хромосом у ранних зародышей (Проко-фьева-Бельговская А.А., 1947, 1964, 1981; Берг P.I., 1965). Это явление твердо доказано для эмбриогенеза различных классов животных (Прокофьева-Бельговская А.А., 1947, 1964, 1981) и предложено биологическое объяснение его смысла для эмбриогенеза некоторых насекомых (Beriowitz, 1974). Гетероцикличность родительских наборов хромосом замечена и у ранних зародышей млекопитающих (Удало-ва Л.Д., 1969; Donahue, 1972, 19726), однако, эти наблюдения сделаны на немногих зародышах и остается невыясненной динамика изменения родительских наборов хромосом в ходе первых делений дробления зародышей млекопитающих.
Между тем, в настоящее время существует реальная возможность так модифицировать методы приготовления и окраски метафазных хромосом ранних зародышей мышей, чтобы не только детально изучить само явление гетеропикличности родительских наборов хромосом, но и исследовать рисунок дифференциальной окраски гомологичных хромосом и измерить их величину. Данный вопрос являлся основной задачей настоящей работы.
Одним из возможных патогенетических подходов для изучения функциональной активности генов в раннем эмбриогенезе млекопитающих может служить метод визуализации в метафазных хромосомах активных рибосомальных генов. В настоящее время это достаточно хорошо разработанные методы, которые позволяют на цитологических препаратах метафазных хромосом выявлять кластеры генов р-РНК (ядрышкообразующие районы хромосом - ЯОР хромосом),которые были аКТИВНЫМИ В Предшествовавшей ИНТерфазе (Howell, 1982; Wachtler, Schwarzacher, 1983). Применение этой патогенетической методики для исследования раннего эмбриогенеза млекопитающих может позволить не только устанавливать саму по себе активность генов р-РНК, но и определять количество функционирующих кластеров рибосомальных генов и их локализацию на хромосомах. Таким образом, изучение активации генов р-РНК, по-видимому, являющихся у зародышей мышей одними из "ранних" генов (Дыбан А.П., 1979), имеет существенный интерес для генетики развития. Изучение этого вопроса является второй задачей настоящей работы.
Применение ряда флуорохромов и других химических веществ, специфически связывающихся с ДНК, позволило получить большое количество важных фактов, значительно расширивших современные представления о структурной организации ядра и метафазных хромо- сом различных клеток животных. Этот подход почти не применялся для анализа хромосом в самом начальном эмбриогенезе млекопитающих. Поэтому в данной работе сделана попытка выявить особенности окрашивания флуорохромами ^характерные для хромосом в начальном эмбриогенезе.
Таким образом, настоящая работа входит в цикл цитогенетических исследований Отдела эмбриологии ИЭМ АМН СССР и относится к самому начальному эмбриогенезу млекопитающих, т.е. к тем же самым стадиям, которым были посвящены две предыдущие кандидатские диссертации, выполненные в отделе (Паткин Е.Л., 1980; Хожай Л.И., 1981), однако, настоящая работа касается другого круга вопросов, В ней поставлены следующие конкретные задачи:
Измерить длины отцовских и материнских гомологичных хромосом в 1-ом и 2-ом делениях дробления зародышей мышей.
Изучить характер поперечной исчерченности хромосом в первых делениях дробления, применив метод дифференциальной окраски.
Определить взаиморасположение хромосом в метафазных пластинках 1-ого и второго делений дробления.
Изучить окрашивание флуорохромами, специфически связывающимися с ДНК и белками хромосом в 1-ой и 2-ой метафазах деления дробления.
Изучить влияние веществ, связывающихся с ДНК (БУдР и Хехст 33258) на отцовский и материнский наборы хромосом.
Определить время появления ЯОР, локализованных на хромосомах отцовского и материнского происхождения.
Сравнить количество ЯОР в 1-ом и 2-ом делениях дробления с количеством ЯОР на хромосомах эмбрионов последующих стадий развития.
Основной итог проведенных исследований сводится к следующему: На стадиях первого и второго делений дробления зародышей мышей рисунок дифференциальной окраски хромосом не отличается от рисунка дифференциальной окраски хромосом взрослых животных.
В первом делении дробления у мышей длина хромосом отцовского происхоадения в среднем в 1,2 раза больше длины гомологичных хромосом материнского происхоадения. Во втором делении дробления не обнаружено существенных различий в длинах гомологичных хромосом.
Активация генов р-РНК в эмбрионах мыши происходит на стадии двух бластомеров. Активируется одновременно несколько кластеров генов р-РНК, локализующихся на различных хромосомах. Активация генов р-РНК, происходящих от отца и от матери, осуществляется одновременно.
На основании полученных результатов на защиту выносятся следующие положения.
При дифференциальном окрашивании по методу трипсин-Гимза рисунок окрашивания хромосом первого и второго делений дробления совпадает со стандартным рисунком дифференциальной окраски хромосом взрослых животных.
В первом делении дробления зародышей мышей существует различие в длинах между гомологичными хромосомами отцовского и материнского происхоадения. Хромосомы отцовского происхоадения длиннее в среднем в 1,2 раза.
Во втором делении дробления в длинах гомологичных хромосом не обнаруживается существенных различий.
Начиная с метафазы второго деления дробления и на протяжении всех последующих стадий доимплантационного развития, в мета-фазах при селективном окрашивании серебром выявляются ядрышкооб-разующие районы на нескольких хромосомах.
