Введение к работе
Актуальность проблемы.
Гомеобокс-содержащие гены вовлечены в контроль морфогенеза в процессе эмбрионального развития позвоночных. Msxl и Мвх2 - два близкородственных гена, гомологичных гену Msh дрозофилы. В процессе эмбриогенеза экспрессия Msxl и Мвх2 наблюдается в мигрирующих клетках нервного гребня, зачатках зубов, глаз, клапанов сердца и в почках конечностей. Хотя рисунок экспрессии известных генов семейства mah сложен, все области экспрессии относятся во временном и пространственном отношении к местам активного морфогенеза, где пролифериршующие клетки находятся в состоянии мезенхимо-эпителиальных взаимодействий. Например, в зачатке сердца Maxl экспрессируется в мигрирующих клетках развивающихся клапанов. В ростральной части нервной трубки и нервного гребня экспрессия Maxl и Msx2 соответствует участкам, где клетки отделяются от нервного гребня, становясь активно-мигрирующими, и снижается по мере того, как клетки достигают точки назначения. В почке конечности Msxl экспрессируется в дистальной мезенхиме, в то время как экспрессия Msx2 локализована главным образом в эктодерме апикально-эктодермального гребня. Временная и пространственная экспрессия Maxl и Мзх2 в почке конечности хорошо изучена, тем не менее их функциональная роль в процессе морфогенеза не понятна. Предыдущие исследования продемострировали, что in vitro экспрессия гена Msxl ведет к блоку дифференцировки и онкогенной трансформации клеточной линии, полученной из мышиных неонатальных скелетных мышц. Эти наблюдения согласуются с экспрессией Msxl в пролиферирующих недифференцированных клетках эмбриона.
В настоящее время биологической роли гомеобокс-содёржащих генов в процессе эмбриогенеза посвящено большое число исследований, в то время как роль этих генов во взрослом организме обратила на себя внимание только сейчас. В большинстве случаев гомеобокс-содержащие гены не экспрессируются в тканях взрослого организма, что давало основание считать их только генами эмбрионального развития.
В отличие от большинства органов, женский репродуктивный тракт рудиментарен при рождении, и его морфологическая и функциональная дифференцировка происходит в постнатальный период. Во время неонатального периода эпителий матки и влагалища является морфологически пластическим и гетеротипная мезенхима может индуцировать экспрессию совершенно новой программы морфогенеза и цитодифференцировки клеток эпителия. Во взрослом организме эпителиальная морфология и дифференцировка драматически меняется в ответ на колебание уровня гормонов в процессе эструса. Еще более поразительными являются десидуальные изменения в эндометрии, вызываемые имплантацией эмбриона. Т.о., морфологическая пластичность является отличительной чертой как неонатального, так и взрослого женского репродуктивного тракта. Выяснение механизмов регуляции функционирования женского репродуктивного тракта с точки зрения роли гомеобокс-содёржащих генов в этом процессе открывает новые горизонты в изучении биологической роли гомеобокс-содёржащих генов, а также имеет перспективное практическое значение. Учитывая данные о том, что стабильно трансфицированные геном Msxl клетки культуры миобластов, введенные подкожно бестимусным мышам, вызывали образование фибросарком (Nature, 1992), можно сделать интригующее предположение о том, что дисрегуляция этого гена может играть роль в возникновении некоторых
патологий женского репродуктивного тракта (например эндометриоз или онкологические заболевания.
Основной целью работы явилось изучение экспрессии МЗХІ (Нох-?.І) гена в клетках развивающегося и зрелого, функционирующего женского репродуктивного тракта и индуктивной роли межклеточных взаимодействий в экспрессии
Msxl.
Задачи исследования
-
Выяснить тканеспецифичность экспрессии гена Msxl в матке мыши и проследить динамику экспресии Msxl в развивающемся женском репродуктивном тракте.
-
Используя модель гомотипных и гетеротипных мезенхимо-эпителиальных рекомбинантов, изучить влияние межклеточных взаимодействий на индукцию/поддержание экспрессии Msxl.
-
Изучить индукцию Msxl гена на модельных экспериментах in vivo.
-
Проследить корреляцию между экспрессией Msxl гена и экспрессией других генов, вовлеченных в процесс морфогенеза и проявляющих пространственно-временную коэкспрессию с Msxl в эмбриогенезе мыши.
-
Изучить экспрессию Msxl гена при различных функциональных состояниях матки мыши.
-
Выяснить влияние женских половых гормонов на экспрессию Msxl в матке мыши.
-
Изучить экспрессию human Msxl (human Нох-7.1 ) В ТКЭНЯХ женского репродуктивного тракта на разных фазах менструального цикла.
Научная новизна и значимость исследований и личный вклад автора в разработку темы. Впервые изучалась роль гомеобокс-содержащих регуляторных генов класса msh и гомеотических генов HoxD9 и HoxDll (по старой номенклатуре Нох4.4 и Нох4.б
соответственно), а также генов Wnt5A и Id в развитии и функционировании женского репродуктивного тракта.
Впервые показано, что гомеобокс-содержащие гены и ростовые факторы, играющие ключевую роль в процессе эмбрионального клеточного роста, пролиферации и мофогенеза, интенсивно экспрессируются в клетках женского репродуктивного тракта и регулируются беременностью . Установлено, что Msxl, гомеобокс-содержащий ген, экспрессирующийся в позиционно пластических клетках эмбриона, также экспрессируется в эпителиальных клетках взрослой матки небеременной мыши и его экспрессия резко падает в первую неделю беременности. Экспериментально показано, что экспрессия Msxl зависит от мезенхимо-эпителиальных клеточных взаимодействий.
В человеческой матке human Msxl интенсивно экспрессируется в железистом и выстилающем эпителии на ранней и поздней пролиферативной стадии менструального цикла, снижаясь на ранней секреторной фазе, и пропадает в середине секреторной фазы, когда уровень прогестерона достигает пика'.
Исследования пренатального Мюллерова протока дают основание выдвинуть гипотезу , что гомеотические гены ряда Hoxd (в недавнем Нох-4) и фактор роста, ген Wnt5A могут
бЫТЬ ВОВЛечеНЫ В реГуЛЯТОрНЫЙ ЦИКЛ Msxl. ГеНЫ HoxD9 и
HoxDll(no старой номенклатуре Нох4.4 и Нох4.6 соответственно) и ген Wnt-5A экспрессируются в эндометриальной строме матки в пренатальном и постнатальном онтогенезе мыши, уровень экспрессии Wnt5A падает во время беременности одновременно с падением уровня экспрессии Msxl. Анализ гомотипных и гетеротипных тканевых рекомбинантов показал, что экспрессия Msxl зависит от взаимодействий с подлежащей мезенхимой маточного происхождения. Способность мезенхимы матки поддерживать
или индуцировать экспрессию Махі в Мюлперовом эпителии коррелирует с экспрессией WntSA в мезенхиме. В то время как экспрессия Махі в эпителии является результатом взаимодействий с маточной мезенхимой, экспрессия Wnt5A не зависит от контакта с эпителием. Наблюдение, что Msxl экспрессируется в эпителии матки взрослой мыши, и, что трансформация предполагаемого вагинального эпителия в маточный может происходить только в первую неделю постнатального развития, когда клетки вагинального эпителия еще экспрессируют Msxl, дает основание предположить, что этот гомеобокс-содержащий ген не только регулирует различные аспекты маточной эпителиальной морфологии и функционирования, но и играет роль в поддержании матки в морфологически пластичном состоянии, необходимом для выполнения ее уникальной функции. На основе полученных в работе результатов, а также данных литературы нами предложена гипотеза, что цервикально-вагинальный аденозис сопровождается изменением нормального распределения экспрессии генов, включая сдвиг рострально-наудальных границ экспрессии гомеотических генов в Мюллеровом протоке. Учитывая данные о предположительной онкогенной роли Msxl, при его эктопической экспрессии, можно предположить, что рак шейки матки или другие гиперпластические патологии женского репродуктивного тракта могут отражать дисрегуляцию генов в его регуляторной цепи.
Для исследования того, каким образом клетки маточной стромы индуцируют (или поддерживают) экспрессию Msxl в эпителии, были созданы и охарактеризованы клеточные линии маточной и вагинальной мезенхимы, иммортализованные с использованием температурчувствительного Т-антигена.
Экспериментальные исследования, обработка материалов и интерпритация полученных данных проведены автором
самостоятельно.
Выращивание тканевых рекомбинантов проводилось с методической помощью сотрудников Калифорнийского университета, Сан-Франциско.
Научная и практическая значимость исследования . Один из основных спорных вопросов медицины касается ракового и/или абнормального роста клеток в женском репродуктивном тракте. К настоящему времени остается неясным, какие условия приводят к таким патологиям как эндометриоэ или рак шейки матки. Особенно интересным в этом отношении кажется наблюдение, что эстрогены, введенные новорожденным самкам мышей, вызывают цервикальный/ вагинальный аденозис, различные уродства генитального тракта, рак матки, рак шейки матки и пролиферативные поражения фаллопиевых труб (Bern et al., 1984; Anderson and Foreberg, 1988). Аденозис характеризуется наличием однослойного цилиндрического эпителия, похожего на выстилающий эпителий матки, в цервикальной области или в ростральной вагинальной части женского репродуктивного тракта. Не смотря на то, что существуют некоторые различия между индуцированным аденоэисом мышей и аденозисом у людей, подвергавшимся воздействию диэтилстилбестрола (ДЭС), в общих чертах поражения, наблюдаемые у мышей удивительно похожи на таковые, наблюдаемые у дочерей женщин, которые принимали ДЭС во время беременности. Недавно было показано, что при его эктопической экспрессии, Msxl обладает онкогенным потенциалом. Ген Wnt-5A родственен гену Wnt-1/int, который в свою очередь при эктопической экспрессии индуцирует опухоли молочной железы у мышей. Нами было показано, что Msxl экспрессируется в эпителии матки небеременной мыши, и что гены Wnt-SA, HoxD9 и HoxDll ассоциированы с подлежащей маточной мезенхимой, способной поддерживать экспрессию
xl. При изменении экспрессии Нох генов, вызванной тацией или воздействием тератогенов (ретиноидная слота), наблюдаются сдвиги рострально-каудальных границ гпрессии. Заманчиво предположить, что рвикально/вагинальный аденозис является результатом эмонально индуцированных нарушений экспрессии меотических генов.
Полученные в работе результаты могут оказаться лезными при изучении причин эндометриоза. Наши зультаты свидетельствуют, что мезенхима, прилегающая к ителию матки, контролирует рост и энспрессию генов в ителии. Эндометриоз характеризуется наличием тканей цометрия (эпителия и стромы) матки вне маточной полости является распространенным гинекологическим заболеванием, ебующим хирургического и терапевтического лечения, ітературньїе данные свидетельствуют, что частота зникновения эндометриоза у фертильных молодых женщин оло 2-5%, в то время как у женщин, лечившихся от сплодия, эта цифра колеблется между 30 и 40. носительно механизма возникновения эндометриоза в стоящее время наиболее популярна теория Сэмпсона, едполагающая простую трансплантацию отслоившихся во емя менструации клеток эндометрия. Тем не менее, троградный менструальный поток происходит у многих ;нщин и зндометриальные клетки были найдены в брюшной лости здоровых женщин и женщин, больных эндометриозом. о., причины эндометриоза до конца не ясны и более полное нимание молекулярной физиологии функционирования матки выявление молекулярных факторов ответственных за ддержание морфологии клеток могут пролить свет на этот прос.
На защиту выносятся следующие основные положения: Матка мыши, в тканях которой нами впервые обнаружена
экспрессия генов эмбрионального развития Maxl, Hoxd9, HoxdII, является является удобным объектом для изучения функций и механизмов регуляции гомеобокс-содержащих генов in vivo.
6. Созданная культура клеток мезенхимы матки мыши является новой клеточной моделью для изучения in vitro действия гормонов и факторов роста на регуляцию экспрессии гена Мзхі и для изучения роли гомеотических генов ряда Hoxd в этом процессе на молекулярно-клеточном уровне. 7. Использование этой модели позволяет показать, что способность клеток мезенхимы матки индуцировать гомеотические мутации в почке конечности коррелирует со способностью экспрессировать ген Wnt-5A. 5. Использование модели гетеротипных рекомбинантов позволяет показать, что экспрессия гомеобокс-содержащего гена Msxl в эпителии матки зависит от мезенхимо-эпителиальных взаимодействий.
2 .Экспрессия Msxl в эпителии женского репродуктивного тракта связана с однослойным цилиндрическим фенотипом клеток. По мере дифференцировки Мюллеровых протоков на матку, цервикс и влагалище экспрессия Msxl сдвигается вверх и остается только в выстилающем и железистом эпителии матки.
-
Экспрессия Maxl в матке мыши резко снижается во время беременности.
-
В женском репродуктивном тракте человека Msxl экспрессируется (также как и в случае мыши) в цилиндрическом эпителии матки и не экспрессируется в многослойном эпителии влагалища и цервикса, однако уровень экспрессии колеблется в зависимости от фазы менструального цикла.
Апробация и внедрение результатов работы в практику. Апробация работы проходила на совместном заседании
лабораторий Института Цитологии РАН в ноябре 1993 года. Результаты работы используются в учебном процессе отдела Биохимических Исследований Медицинской школы Бостонского Университета и отдела Молекулярной Биологии Медицинской школы им. Mount sinai, Нью-Йорк. По материалам работы подан грант. Основные положения диссертационной работы отражены в 4 публикациях. Две статьи находятся а процессе написания.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературных данных, описания материалов и использованных методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Текст диссертации изложен на 130 страницах машинописного текста и иллюстрирован I таблицей и 36 рисунками и фотографиями. Список литературы содержит 120 источников.
