Введение к работе
Актуальность проблемы
Экспрессия гена Oct3/4 из семейства POU-доменных транскрипционных факторов исследована на зародышах и на культивируемых эмбриокарцнномпых (ЭК) и эмбриональных стволовых (ЭС) клетках мыши (Okamoto et al., 1990; Rosner et al., 1990; Scholer et al., 1990; Yeom et al., 1996). Совокупность феноменологических, а также молекулярно-генетических данных позволила выдвинуть ряд предположений относительно роли Oct3/4 в поддержании полипотент-ного клеточного фенотипа, детерминировании и спецификации линии половых клеток.
Экспрессия
.-.—її—1| 1 j / белка Oct3/4
:СпсрмийНВСЧКСН иНпсН СГ : (показано в
і—її—її—і- j настоящей
w* работе)
Рнс. 1. Экспрессия гена Oct3/4 в онтогенезе мыши.
ВКМ - внутренняя клеточная масса бластоцисты, ТЭ -
В раннем эмбриогенезе мыши геи Oct3/4 транскрибируется в тотипотентных (бластомеры) и плюринотентных (ВКМ, эпибласт) клетках, но в ходе диффе-ренцировки указанных клеток происходит последовательная дезактивация гена (Рис. 1). После 9 суток развития продукты гена Oct3/4 обнаружить в каких-либо соматических клетках зародыша уже невозможно. Экспрессия Oct3/4 прослеживается только в первичных половых клетках (ППК) по ходу их миграции и заселения ими презумтивных гонад (Рис. 1). Программа дальнейшего развития половых клеток включает пролиферацию и дифференцировку гоний в направлении двух высокоспециализированных клеточных типов, ооцитов и сперматозоидов, слияние гамет и регенерацию линии половых клеток в эмбриогенезе потомства. Ооциты на стадии диктиотены характеризуются заторможенным метаболизмом и, в частности, репрессированным состоянием гена Oct3/4, однако по мере роста этих клеток наблюдается постепенное усиление синтеза мРНК Oct3/4. Таким образом, в онтогенетическом плане экспрессия Oct3/4 по линии развития женских гамет носит циклический характер (ооцит -> бластомеры -» ВКМ -> эпибласт -> ППК - ооцит) (Рнс. 1).
- сперматогонии, ПС - пахитенные сперматоциты, II вторичные сперматоциты, КС - круглые сперматиды, ВС - вытянутые сперматиды.
По неизвестным причи
нам практически вне ра
мок исследований осталась
экспрессия Oct3/4 в пост-
натальном периоде разви
тия мужских гамет трофэктодерма, ППК - первичные половые клетки, СГ
(сперматогенезе). В связи
с этим интересным представляется выяснить, имеет ли место в семенниках синтез продуктов гена Oct3/4, если да, то в каких именно клеточных популяциях этого органа. Это, как нам кажется, сделает более полным описание картины экспрессии Oct3/4 в онтогенезе, и, тем самым, позволит расширить сложившиеся представления о регуляторных функциях этого гена.
Сложные сочетания взаимодействий сравнительно небольшого числа факторов транскрипции с промоторными/энхансерными последовательностями ДНК координируют экспрессию десятков тысяч эукариотических генов. Фундаментальная роль в организации точного контроля генной экспрессии принадлежит белок-белковым взаимодействиям между транскрипционными факторами, которые по способу вхождения в аппарат РНК-полимеразы II и выполнямым регуля-торным функциям делятся на три класса: базальные, сайт-специфические (в их числе Oct3/4) и коактиваторные. Последние, не обладая каким-либо сродством к ДНК, способны оказывать регуляторный эффект посредством кооперации с белками двух других классов. Функции коактиваторов весьма разнообразны: они могут быть вирусного (Е1А, VP16) или клеточного происхождения (RIP140, РС1-4), входить во все прединициирующие комплексы с РНК-полимеразой II (TAFs) или действовать избирательно к определенным промоторам (ОСА-В, VP16). Однако во всех случаях коактиваторы необходимы для модуляции активированной, обусловленной сайт-специфическими факторами транскрипции.
активирующий домен Oct3/4 необходим,
Белок Oct3/4 при попадании из среды ЭК-клеток (фенотип Oct3/4+) в эктопическое окружение, каковым являются дифференцированные клетки (Oct3/4~), теряет способность стимулировать транскрипцию репортерных генов, контролируемых за счет сайта связывания Oct3/4 (т. н. октамерного сайта, АТГЦа/тААТ). Такой дезактивации Oct3/4 не сопутствуют ни утрата октамер-связывающиех свойств, ни какие-либо внутрибелковые изменения. N-концевой транс-
Рис. 2. Механизм активации транскрипции посредством Oct3/4 и коактиваторов.
КоА - экзогенный белок Е1А (в дифференцированных клетках, Oct3/4") или гипотетический Е1А-подобный эндогенный коактива-тор (для клеток с фенотипом Oct3/4+); ОТК - общий транскрипционный комплекс; рої II
но не достаточен для стимуляции транскрипции в системе дифференцированных клеток. Оказалось, что потенциал указанного домена существенно возрастает в присутствии аденовирусного белка Е1А. Биохимические тесты показали способность Е1А осуществлять функциональные белок-белковые контакты с Oct3/4 и общим транскрипционным комплексом (Рис. 2). В ходе эмбриогенеза мыши Oct3/4 и El А экс-прессируются реципрокно, отсюда белок Е1А может быть рассмотрен
в качестве коактиватора Oct3/4, но лишь с формальной точки зрения. Однако исходя из того, что эндогенный Oct3/4 активирует октамер-содержащие конструкции, постулировано, что клетки с фенотипом Oct3/4+ (Рнс. 1) содержат активность, выполняющую те же функции что и Е1А з дифференцированных клетках (Oct3/4~) по отношению к экзогенному Ос!3/4, и что вероятней всего, эта активность представлена одним или несколькими коактиваторами (Рис. 2) (Scholeret al, 1991).
Указанное направление исследований представляет значительный интерес в плане понимания молекулярных основ работы белка Oct3/4 как транскрипционного фактора. Тем не менее, какие-либо белки со свойствами и функциями эндогенных коактиваторов Oct3/4 пока еще не идентифицированы. Часть диссертационной работы связана с решением этого вопроса.
Цели и задачи исследования
-
Проверить данные Rosner et al. (1990) по экспрессии Oct3/4 мРНК в семенниках взрослой мыши. Показать, в каких клеточных популяциях семенников взрослых мышей синтезируются мРНК и белок Oct3/4.
-
Установить, происходят ли изменения в уровне экспрессии Oct3/4 в процессе сперматогенеза, и соотносятся ли эти изменения с фазами развития спермато-генных клеток.
-
Исследовать плюрипотентиые, дифференцированные и сперматогенные клетки на предмет экспрессии в них ОаЗМ-Связывагощнх Белков (ОСБ) - потенциальных коактиваторов белка Oct3/4. Установить тканеспецифичность экспрессии, спектр и молекулярные веса ОСБ. Исследовать, сохраняется ли взаимодействие ОСБ с белком Oct3/4, связанным с октамерной последовательностью ДНК.
Научная новизна полученных результатов
Подтверждены данные, касающиеся экспрессии Oct3/4 мРНК в семенниках половозрелых мышей. Работа содержит новые сведения, свидетельствующие об экспрессии белка и мРНК Oct3/4 в ограниченных популяциях сперматогенных клеток.
Выявлена корреляция между содержанием белка Oct3/4 и процессом развития половых клеток в ходе сперматогенеза. Синтез белка Oct3/4 заметно усиливается в поздней профазе, поддерживается на высоком уровне в ходе мейотических делений, а затем постепенно угасает в гаплоидной фазе развития сперматогенных клеток. Показано, что предмейотические, ранние мейотические и соматические клетки полового эпителия семенников содержат следовые количества белка Oct3/4.
Установлено, что снижение уровня белка Oct3/4 в постмейотической фазе сперматогенеза не сопровождается снижением уровня соответствующей мРНК, и что Oct3/4 мРНК, несмотря на тотальное блокирование транскрипции, присутствует в цитоплазме гаплоидных клеток вплоть до завершення цикла сперматогенеза.
Получен продуцент биологически активного рекомбинантного белка Oct3/4 (rOct3/4), использованный затем для выявления ОСБ в плюрипотентных (F9, Oct3/4+) и сперматогенных (пахитенных сперматоцитах, Oct3/4+) клетках мыши. Основываясь на ряде признаков, высказано предположение, что некоторые из обнаруженных ОСБ могут являться коактиваторами белка Oct3/4, существование которых было постулировано ранее.
Практическая ценность работы
Предложен простой и эффективный способ повышения иммунореактивности парафиновых срезов ткани (фиксированной параформальдегидом), позволяющий обнаруживать низкокопийные ядерные белки. Сочетание интактной морфологии ткани и сильного иммунологического сигнала позволяет применять этот метод и в диагностических целях.
Белок rOct3/4 может быть в дальнейшем использован в качестве зонда при клонировании эмбриональных и тестикулярных ОСБ из экспресснонных X-библиотек. Возможность обнаружить rOct3/4-OCB контакты на мембранах дает все шансы для успешного осуществления такой работы. Мутанты rOct3/4 могут быть весьма полезны при изучении белок-белковых взаимодействий Oct3/4 с ОСБ и компонентами общего транскрипционного аппарата ядра.
Апробация работы
Материалы работы представлялись на IX-м европейском симпозиуме по молекулярной и клеточной эндокринологии тестиса (Норвегия, 1996), ХН-м Всероссийском симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (1996), а также неоднократно на научных семинарах Института цитологии РАН и Университета г. Кан.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на /' стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, содержащего й^/йублика-ций. Диссертация иллюстрирована У.у рисунками и zb_ таблицами.
