Введение к работе
Актуальность проблемы. Морфогенез борозд и извилин коры головного мозга – один из важнейших и недостаточно изученных аспектов пренатального онтогенеза человека. Существует ряд основополагающих работ, касающихся хронологии закладки борозд в онтогенезе человека и приматов (Gratiolet, 1854, цит. по: Huxley T.H., 1874; Bischoff, 1868, цит. по: Бец В.А., 1883; His, 1904, цит. по: Пинесу, 1949; Бут Н.И., 1956; Астахова А.Т., 1958; Савельев С.В., 1989), и более новые исследования (Савельев С.В., 2005; Ruiz A. et. al., 2006; Sawada K. et. al., 2012). Данные работы содержат много интересных, отчасти противоречащих друг другу фактов об особенностях формирования борозд. Мало изучено и практически не описано появление зачатков борозд в фетальном периоде. В отдельных случаях эти зачатки (первичные борозды) полностью повторяют положение постоянных борозд (Савельев С.В., 1989; Савельев С.В., 1993) и могут кратковременно сглаживаться в процессе развития (Астахова А.Т., 1958; Савельев С.В., 1989). Существует множество гипотез формирования гирифицированного (от лат. gyrus — извилина) мозга. Достаточно популярно представление о том, что быстрорастущий мозг формирует складки из-за того, что упирается в череп изнутри. В экспериментальной работе Р.S. Goldman-Rakic (1980) описано повышение гирификации поверхности мозга в результате повреждения. Повреждения также вызывают цитоархитектоническую реорганизацию первичной зрительной коры. Другая концепция предполагает, что борозды и извилины формируются за счет дифференцированного роста отдельных радиальных структур (Armstrong E. et al., 1991; Toro R, Burnod Y., 2005). Согласно другой гипотезе о механических натяжениях, образование извилин неокортекса происходит вследствие натяженности аксонов между тесно связанными областями коры, в то время как борозды образуются между областями коры, практически не имеющими взаимных связей (Van Essen D.C., 1997).
Многое известно о формировании корковой пластинки. Детально изучены особенности формирования, миграции и дифференцировки нейро- и глиобластов в коре млекопитающих, прежде всего у крыс (Smart, I. H., McSherry, G. M., 1982; Bayer, S. A., Altman, J., 1991; Takahashi, T. et. al., 1995), а также у приматов (Rakic P., 1972; Schmechel D.E., Rakic P., 1979; Letinic K. et. al., 2002). За последнее десятилетие на мышах и крысах были проведены генетические исследования, в которых были выявлены порядка 60 генов, специфично экспрессирующихся в постмитотических нейробластах различных слоев (Molyneaux B.J. et al., 2007). Несмотря на активный интерес к проблеме формирования коры головного мозга, в современной нейробиологии практически не обсуждаются особенности образования коры гирифицированного мозга. Более того, ряд исследователей опровергает наличие гетерогенности развития цитоархитектонических полей, приоритет формирования первичных полей над вторичными (Rakic P. et. al., 1986; Zacevic N., 1998; Letinic K., Kostovic I., 1998), хотя ускоренное созревание первичных полей ранее считалось неоспоримым фактом (Преображенская Н.С., 1965; Huttenlocher P.R., de Courten C, 1987).
Таким образом, несмотря на активно ведущиеся работы по исследованию развития коры головного мозга млекопитающих и человека, многие аспекты формирования мозга недостаточно изучены. Прежде всего не решен вопрос о существовании первичных борозд в процессе развития, которые в дальнейшем элиминируются. Неясно, существуют ли подобные механизмы формирования для других борозд. Неизвестны факторы, под воздействием которых борозды могут сглаживаться, и почему эти факторы воздействуют на отдельные борозды неодновременно. Не описаны события, происходящие в стенке полушария на микроскопическом уровне. Неясно, влияет ли гетерогенность формирования борозд на дальнейшее созревание и формирование цитоархитектоники неокортекса.
Цели и задачи. Целью исследования являлось изучение особенностей морфогенеза первичных и вторичных борозд затылочной доли медиальной поверхности головного мозга человека.
В задачи исследования входило:
-
Установить гистологические и иммуногистохимические особенности миграции нейробластов в зонах формирования первичных и вторичных борозд неокортекса зрительной области с использованием комплекса маркеров (антител к глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP), нейрон-специфическому -III тубулину, фактору нейрональной миграции – рилину, переносчику фактора миграции (ретинола) - CRBP-I).
-
Установить особенности глиальной и нейрональной дифференцировки в зонах формирования первичных и вторичных борозд неокортекса зрительной области с использованием комплекса маркеров (антител к глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP), нейрон-специфическому -III тубулину, нейральному ядерному белку (NeuN), маркерам синаптической активности: глутаматдекарбоксилазе (GAD), переносчику ГАМК (GAT-1), возбуждающему рецептору (NMDAR1)).
-
Определить наличие морфохимической гетерогенности в формировании первичного и вторичного зрительных полей с использованием маркеров (антител к Са2+-связывающему белку (S-100), основному белку миелина (MBP), нейральному ядерному белку (NeuN), глутаматдекарбоксилазе (GAD), переносчику ГАМК (GAT-1), рецептору (NMDAR1)).
-
Составить макроморфологическую периодизацию нормального развития мозга плодов. Определить иммуногистохимические компоненты механизма формирования первичных и вторичных борозд неокортекса.
Научная новизна. В работе впервые детально исследована хронология возникновения как первичных, так и вторичных борозд полушарий головного мозга в фетальном периоде. Описаны первые временные борозды на медиальной поверхности полушария, последовательно исчезающие в ростро-каудальном направлении. Первичная теменно-затылочная борозда исчезает на период 18–21 нед; после этого возраста она формируется как постоянная борозда. Первичная шпорная борозда кратковременно исчезает в 23–25 нед.
В работе применен комплекс иммуногистохимических методов, направленных на выявление миграции и дифференцировки нейробластов и глиобластов одновременно с выявлением синаптической активности головного мозга. Выявлены тенденции к тангенциальной миграции нейробластов в прижелудочковой области под бороздами.
Дифференцировка астроцитов и формирование цитоархитектоники в зрительной коре запускается после 23-й нед – сразу после стадии сглаженной шпорной борозды.
Впервые оценены темпы развития и созревания неокортекса в бороздах, в губах борозд и в свободной коре. Участки неокортекса в губах борозд развиваются раньше других, на втором месте по скорости созревания свободная кора, позже других протекает созревание нейробластов в неокортексе внутри борозд. Выявлен приоритет развития первичного зрительного поля 17 над вторичным полем 18.
Научно-практическая значимость. Понимание нормального развития головного мозга важно для диагностики пороков развития ЦНС. Традиционная ультразвуковая диагностика (УЗИ), совместно с магнитно-резонансной томографией (МРТ) в пренатальном периоде выявляют большое количество аномалий развития внутрненних органов, в том числе ЦНС. Тем не менее, существующие подходы и диагностические шкалы не всегда дают достаточно информации для прогнозирования возможных аномалий развития ЦНС. Борозды полушарий головного мозга хорошо различимы при УЗИ и МРТ. Знание нормальной хронологии формирования борозд, возраст появления и исчезновения первичных борозд должны способствовать более ранней и точной диагностике аномалий развития головного мозга. Полученные в работе данные о морфогенезе борозд больших полушарий на микроскопическом уровне расширят возможности морфологической диагностики патологии ЦНС.
Основные положения, выносимые на защиту:
В процессе становления гирификации выделяют этап формирования первичных борозд, которые в дальнейшем элиминируются, а на их месте формируются постоянные борозды. Шпорная борозда также претерпевает временное сглаживание подобно другим первичным бороздам медиальной поверхности головного мозга. Первичные борозды сглаживаются не одновременно, для каждой борозды существуют свои временные рамки, которые взаимосвязаны между собой.
Выявлена гетерогенность в созревании нейробластов в бороздах и извилинах зрительной коры (поля 17 и 18) мозга человека на всех этапах пре- и постнатального развития. С 19-й по 28-ю нед пренатального онтогенеза дифференцировка нейробластов в слоях V-VI внутри борозд опережает таковую в свободной коре, что подтвержается усилением их NeuN-иммунореактивности. С 28-й нед пренатального развития и до периода детства раньше созревают нейробласты в губах борозд, что подтверждается распределением Са2+-связывающего белка S-100 (до 40-й нед пренатального периода), нейрального маркера NeuN (до 10-го месяца постнатального периода), маркеров синаптической активности GAD и GAT-1 (до 4-х лет).
Показано, что кратковременное сглаживание шпорной борозды в 23–25 нед совпадает с врастанием -III-тубулин-иммунопозитивных афферентных таламических волокон, которые индуцируют экспрессию NeuN в IV слое неокортекса до начала выявления характерной цитоархитектоники II-VI слоев зрительной коры. После этого в 26 нед начинается специфическая временная экспрессия рилина и S-100 в нейробластах IV-VI слоев неокортекса в центре первичного зрительного поля 17. С 34-х нед экспрессия S-100 в нейробластах распространяется на вторичное зрительное поле 18.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на: VIII конгрессе Международной ассоциации морфологов (Орел, 2006), Всероссийской конференции «Структурно-функциональные, нейрохимические и иммуногистохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга» (Москва, 2007), научной конференции ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2008), Международной гистологической конференции «Морфогенезы в эволюции, индивидуальном развитии и эксперименте» (Тюмень, 2008), III съезде Российского общества патологоанатомов (Самара, 2009), научной конференции ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2010), X конгрессе Международной ассоциации морфологов (Ярославль, 2010), научной конференции ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2012), межлабораторной конференции ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН (июнь, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 3 статьи в центральных журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов), выводов, списка цитируемой литературы и двух приложений, изложена на 197 страницах, содержит 10 таблиц, 32 рисунка и 5 диаграмм. Список литературы содержит 194 источника, из них 31 на русском языке.
Работа выполнена на аутопсийном материале головного мозга человека (плоды, новорожденные, дети, взрослые), собранном в 2006–2010 гг. в больницах Москвы: ГКБ №36, ГКБ №72, МОНИИАГ, а также из коллекций лаборатории развития нервной системы ФГБУ «НИИМЧ» РАМН, кафедры антропологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Всего в работе исследованно 63 случая, из них 46 плодов человека на разных сроках развития, 10 недоношенных новорожденных детей, проживших от нескольких часов до нескольких суток, 2 доношенных новорождённых, 3 детей (3,5 мес, 10 мес, 4 г.), 2 взрослых лиц (48 лет, 70 лет). При сборе образцов головного мозга плодов человека учитывали пол, гестационный возраст, клинический диагноз матери и плода, причины прерывания беременности и причины смерти плода. При отсутствии клинических данных, определение возраста плодов проводили по теменно-копчиковой длине, согласно морфометрическим таблицам (Петтен Б.М., 1959), по массе тела, по Е. Бойду (цит. по: Петтен Б.М., 1959), по анатомическим характеристикам мозга (Савельев С.В., 2005). Изучали степень гирификации полушарий головного мозга. Выраженность борозд оценивали по разработанному нами методу в баллах по пятибалльной шкале. Материал фиксировали в 10%-м кислом формалине, нейтральном формалине (4% параформальдегид на 0,1М фосфатном буфере, рН 7,5) или жидкости Буэна. Проводили гистологическое исследование (окрашивание по методу Ниссля) участков медиальной стенки полушария, содержащих шпорную и теменно-затылочную борозды. Проводили иммуногистохимическое исследование. В работе использовали первичные антитела к некоторым антигенам нервной системы: нейрон-специфическому -III тубулину, нейрональному ядерному гистоновому белку (NeuN), глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP), Са2+-связывающему нейроглиальному белку (S-100), основному белку миелина (MBP). Использовали антитела к факторам, влияющим на рост и развитие нервных клеток, и к их переносчикам: рилину, переносчику ретинола (CRBP-I). Использовали антитела к маркерным белкам, связанным с синаптической функцией: глутаматдекарбоксилазе (GAD65/67), пресинаптическому переносчику ГАМК (GAT-1), постсинаптическому возбуждающему рецептору NMDAR1. Негативным контролем служили реакции с заменой первичных антител раствором для разведения антител “Dako diluent” (“Dako”) или PBS рН=7,2–7,4 (0,01М). Во всех случаях в негативном контроле неспецифическая реакция отсутствовала. Позитивным контролем, в основном, служили реакции на образцах головного мозга детей и взрослых людей. Исключение составлял белок рилин, для которого позитивный контроль проводился на головном мозге плодов раннего возраста (Alcantara S. et. al., 1998). Для антител к переносчику ретинола (CRBP-I), для моноклональных антител к изоформе глутаматдекарбоксилазы молекулярной массой 67 кДа, к постсинаптическому рецептору NMDAR1 не удалось получить позитивного контроля ни у плодов, ни у взрослых людей.
Все полученные препараты оценивали визуально с помощью микроскопа Leica DM2500. Видеозахват осуществляли с помощью камеры Lomo TCA-9.0C и программы Микро-View. С помощью программы Image J измеряли толщину каждой из зон стенки полушария, глубину борозд. Для каждого исследуемого участка проводили по 12 измерений. Данные вносили в таблицу в программе Microsoft Exel и вычисляли среднее значение для каждого измерения. Для оценки выраженности иммуногистохимической реакции использовали коэффициент интенсивности иммунореактивности, высчитываемый в программе Image J. Похожие методы оценки иммунореактивности представлены в других исследованиях (Leuba G. et. al., 1998; Cruz D.A. et. al., 2003; Cruz D.A. et. al., 2009). Микрофотографии с исследуемыми областями переводили в двухцветное состояние по стандартизированной методике. Далее в программе Image J вычисляли коэффициент интенсивности иммунореактивности, равный отношению суммы иммунопозитивных (темных) пикселей к общему количеству пикселей в выделенной области:
Ки= иммунопозитивн.пиклел/общ. кол-во пикселей.
Для каждого образца в каждой исследуемой области (кора борозды, кора губы борозды, свободная кора, вентрикулярная зона, краевая зона и др.) получали по 12 значений коэффициента интенсивности иммунореактивности. После этого в программе Microsoft Exel высчитывали уровень значимости различий (р), согласно F-распределению Фишера, высчитывали средние значения коэффициента интенсивности иммунореактивости в исследуемых областях.
![Цилиарное тело глаза человека в онтогенезе [Электронный ресурс]](/i/i/4606/206977.png "Цилиарное тело глаза человека в онтогенезе [Электронный ресурс] Николаенко Галина Анатольевна")
