Введение к работе
Актуальность темы. Связывание гормонов, нейромедиаторов и других агонистов с соответствующими мембранными рецепторами приводит к запуску в клетке цепи биохимических реакций, имеющих своим следствием либо специфический для данного типа дифференцированных клеток ответ, либо увеличение синтеза ДНК и деление клеток. Важная роль в передаче сигнала с наружной мембраны к внутриклеточным структурам принадлежит ионным событиям (см. например, Moolenaar, de Laat, 1985). Среди этих событий особая роль принадлежит кальциевому сигналу, т.е. временному увеличению концентрации свободного цитоплазматического Са^+ ([Са2+]цит). Восприятие и преобразование кальциевого сигнала осуществляется ферментами, транспортными белками, внутриклеточными модуляторами, активность которых зависит от [Са2+]цит (Rasmussen, Barret, 1984; Bcrridge, 1985; Abdel-Latif, 1986).
Возрастание уровня [Са2+]цит обеспечивается как за счет выброса Са^+ из внутриклеточных источников, так и за счет входа Са^+ из внеклеточной среды через плазматическую мембрану (Putney, 1987; Berridge, Irvine, 1989). В нервных, мышечных и друшх электровозбудимых клетках вход ионов Са^+ происходит через потенциал-управляемые Са2+ каналы (см., например, Reuter, 1986). Менее ясно, какие механизмы обеспечивают рецептор-зависимый вход Са^+ в невозбудимых клетках. Изучение потоков Са^+ (Johns et al., 1987; Nishimoto et al., 1987) и измерение уровня [Са2+]цит с помощью Са2+-чувствительных зондов (Volpi, Berlin, 1988; Авдонин и др., 1990; Курышев и др., 1991) дают основания полагать, что в плазматической мембране различных типов клеток имеются Са^+.проницаемые каналы, отличные по своим свойствам от потенциал-управляемых каналов. Однако, сообщения о регистрации одиночных Са^+-проницаемьгх каналов в мембранах невозбудимых клеток носят фрагментарньш характер (Kuno, Gardner, 1987; Benham, Tsien, 1987; Penner et al., 1988; Mozhayeva et al., 1990a,6; Mozhayeva et al., 1993). Из сказанного следует, что дальнейшее детальное исследование рецептор-
управляемого входа ионов Са2+ через плазматическую мембрану невозбудимых клеток необходимо для получения целостного представления о механизмах внутриклеточной сигнализации.
Макрофаги являются удобным объектом для изучения рецептор-управляемого входа Са2+, т.к. мембрана этих клеток имеет большое число различных рецепторов, а кальциевый сигнал в них в значительной степени определяется входом Са^+ из внеклеточной среды (Alonso-Torre, Trautmann, 1993).
Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении механизмов, обеспечивающих вход ионов Са^+ через плазматическую мембрану перитонеальных макрофагов крысы в ответ на экстраклеточное приложение АТР. Были поставлены следующие задачи:
-
Выяснить возможность активации входа Са^+ на макрофагах крысы внеклеточным приложением АТР.
-
Идентифицировать и охарактеризовать проводящие и селективные свойства Са2+-проницаемых каналов плазматической мембраны.
-
Определить тип пуринорецептора, индуцирующий вход ионов Са^+ через плазматическую мембрану макрофагов крысы.
Научная новизна. В результате проведенной работы впервые зарегистрирован и охарактеризован новый тип высоко-селективных кальциевых каналов плазматической мембраны макрофагов крысы, активирующихся внеклеточным приложением АТР. Установлено, что АТР действует на пуринорецептор P2Z~Tuna, который, в свою очередь, активирует данный тип каналов, по-видимому, через GTP-связывающин белок. Полученные данные позволяют сделать вывод, что GTP-зависимые Са2+-проницаемые каналы вносят существенный вклад в АТР-индуцируемое повышение внутриклеточной концентрации Са^+.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные в настоящей работе результаты важны для конкретизации представлений о.механизмах, генерирующих кальциевый сигнал в невозбудимых клетках. Обнаружение нового
типа Са2+-проницаемых каналов является существенным дополнением к имеющимся знаниям о функциональной роли ионных каналов клеточных мембран. Тот факт, что индуцируемая внеклеточным приложением АТР стимуляция активности Са2+-проницаемых каналов осуществляется, по-видимому, через GTP-связывающий белок, подтверждает складывающееся к настоящему времени мнение о том, что GTP-связывающие белки являются универсальными модуляторами активности различных ионных каналов. Полученные данные о свойствах и механизмах регуляции АТР-актнвируемых Са2+-проницаемых ионных каналов могут быть использованы при разработке и тестировании фармакологических агентов и лекарственных препаратов.
Апробация работы Основные положения работы доложены и обсуждены на: 37 биофизическом конгрессе США (Бостон, 1993 г.), заседании Физиологического Общества Великобритании (Абердин, 1994), 39 биофизическом конгрессе США (Сан-Франциско, 1995), заседании отделения физиологии РАН (Москва, 1995), отчетной сессии Института цитолоии РАН (Санкт-Петербург, 1995) и на научных семинарах лаборатории ионных каналов клеточных мембран Института цитологии РАН. По материалам диссертации опубликовано 5 печатньгх работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, содержащего/^публикаций. Работа изложена на^страницах машинописного текста и иллюстрирована /^рисунками.
