Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Характеристика и свойства эмбриональных стволовых (ЭС) клеток
1.1.1. Получение ЭС клеток 12
1.1.2. Клеточный цикл 19
1.1.3. Дифференцировка ЭС клеток в культуре 19
1.1.4. Направленная дифференцировка ЭС клеток в культуре 24
1.1.5. Генетические модификации ЭС клеток 37
1.1.6. Моделирование эмбрионального развития с использованием ЭС клеток 38
1.2. Семейство TRIM белков
1.2.1. Характеристика семейства TRIM белков 47
1.2.2. Три основные группы белков TRIM семейства 49
1.2.3. Ген pub — представитель семейства TRIM белков 54
1.2.4 .Строение и свойства белка Pub 55
1.2.5. Возможные функции белка Pub . 58
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Культивирование клеток млекопитающих
2.1.1. Культивирование ЭС клеток 61
2.1.2. Приготовление фидерного слоя из первичных эмбриональных фибробластов (ПЭФ) мыши 61
2.1.3. Культивирование клеток Rat-2 64
2.1.4. Культивирование лини клеток феохромацитомы крысы PC-12 64
2.1.5. Культивирование клеток человека Jurkat 64
2.2. Плазмиды, использованные в работе
2.2.1. Плазмиды pcDNA3, plneo, pPB, pRNAi, использованные для трансфекции ЭС клеток 65
2.2.2. Плазмиды pEJ6.6, pBR322 использованные для трансфекции клеток Rat-2 66
2.2.3. Плазмиды k-pub-myc, pub-myc, использованные для трансфекции ЭС клеток 67
2.3. Трансфекции клеток млекопитающих 2.3.1. Трансфекция ЭС клеток методом электропорации и последующая селекция 68
2.3.2. Трансфекция ЭС клеток с помощью липофектамина 68
2.3.3. Трансфекция и селекция псевдонормальной крысиной линии клеток Rat-2 69
2.3.4. Трансфекция клеток РС-12 69
2.4. Анализ пролиферации трансфицированных ЭС клеток 70
2.5. Индукция дифференцировки ЭС клеток с образованием ЭТ 70
2.6. Выделение тотальной РНК и проведение обратной транскрипции 70
2.7. Полимеразная цепная реакция 72
2.8. Выделение белковых гомогенатов из клеток млекопитающих 73
2.9. Электрофорез белков в полиакриламидном геле 74
2.10. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану после электрофоретического разделения 74
2.11. Иммуноблотинг 74
2.12. Анализ дифференцировки ЭС клеток в кардиомиоциты 74
2.13. Иммуноцитохимический анализ 75
2.14. Индукция дифференцировки стабильно-трансфицированных клеток РС-12 под действием ФРН 75
2.15. Статистическая обработка результатов экспериментов 76
Глава 3. Результаты и их обсуждения
3.1. Экспрессия эндогенного в недифференцированных ЭС клетках мыши линии R1 и ЭТ 77
3.2. Получение трансфицированных линий ЭС клеток с повышенной экспрессией гена человека hpub, гена мьшшриЬ, а также с пониженной экспрессией гена мыта pub 78
3.2.1. Изучение пролиферативной активности трансфицированных линий. 82
3.3. Оценка онкогенного потенциала гена человека hpub 89
3.4. Влияние повышенной экспрессии гена hpub и пониженной экспрессии гєпариЬ на разные пути дифференцировки ЭС клеток мыши 92
3.4.1. Влияние повышенной экспрессии гена hpub и пониженной экспрессии гена pub на энтодермальную дифференцировку 94
3.4.2. Влияние повышенной экспрессии гена hpub и пониженной экспрессии гена pub на мезодермальную дифференцировку 96
3.4.3. Влияние повышенной экспрессии гена hpub и пониженной экспрессии гена, pub на эктодермальную дифференцировку 103
3.5. Влияние гена человека hpub на нейрональную дифференцировку линии клеток феохромацитомы крысы PC-12 107
3.6. Возможный механизм влияния экспрессии генов pub и hpub на процессы дифференцировки ЭС клеток 113
Выводы 116
Список литературы
- Направленная дифференцировка ЭС клеток в культуре
- Приготовление фидерного слоя из первичных эмбриональных фибробластов (ПЭФ) мыши
- Выделение белковых гомогенатов из клеток млекопитающих
- Влияние повышенной экспрессии гена hpub и пониженной экспрессии гєпариЬ на разные пути дифференцировки ЭС клеток мыши
Введение к работе
Ранее в отделе вирусной и клеточной молекулярной генетики Института
молекулярной генетики РАН с помощью метода вычитающей
гибридизации были получены и охарактеризованы клоны кДНК
повышенно транскрибирующиеся в ВИЧ-ассоциированных
иммунобластных лимфомах [1]. Анализ этих кДНК позволил выявить среди них, наряду с уже охарактеризованными генами {set, calpain и т.д.) несколько кДНК с неизвестными функциями. Одним из таких лимфоидспецифичных генов, был ген нуклеотидная последовательность (кДНК) которого содержалась в базе данных генома человека под названием KIAA0129. Японскими учеными было проведено исследование мышиного гомолога гена человека KIAA0129, которому они дали название pub. Показано, что белковый продукт этого гена КТАА0129 человека (hpub) имеет высокую степень гомологии (82%) с мышиным белком Pub [2].
Pub (hPub) относится к семейству TRIM (tripartite motif) белков [2], для которых характерно наличие так называемого TRIM (или RBBC) мотива, состоящего из трёх цинк-связывающих доменов: RING (R), B-box 1 (В1) и B-box 2 (В2), сопровождаемых coiled-coil (СС) регионом [3]. На данный момент известно 37 представителей данного семейства белков [3]. Некоторые из них вовлечены в такие биологические процессы, как регуляция транскрипции, организация цитоскелета, контроль клеточной пролиферации и дифференцировки [4].
Функции гена hpub не изучены. Однако известно, что его мышиный гомолог pub играет важную роль в процессах клеточной дифференцировки и оказывает существенное влияние на транскрипционную активность фактора PU.1 [2]. PU.1 относится к ETS семейству транскрипционных факторов, играет центральную роль в дифференцировке и пролиферации макрофагов и В-клеток в ходе гемапоэза, контролирует функциональную активность нейтрофилов [5]. Показано, что продукт гена pub ингибирует
транскрипционную активность PU. 1 в гемоцитах и вследствие этого играет важную роль в дифференцировке и пролиферации миелоидных и лимфоидных клеток [2]. Влияние генов hpub и pub на более ранние стадии развития организма до настоящего времени исследовано не было.
В данной работе для изучения влияния генов hpub и pub на начальные этапы эмбрионального развития использовали модель эмбриональных стволовых клеток.
Эмбриональные стволовые клетки (ЭС клетки) представляют собой уникальную модель для изучения процессов, лежащих в основе онтогенеза. Как и в ходе развития зародыша in vivo, ЭС клетки в культуре способны давать начало всем трём зародышевым слоям: энтодерме, мезодерме и эктодерме, а, соответственно, и всем развивающимся из них типам клеток. Исследования дифференцировки ЭС клеток в том или ином направлении в ответ на воздействие специфических индукторов (факторов роста, цитокинов) или на непосредственную генетическую модификацию позволяют приблизиться к пониманию функции исследуемых веществ и генов в данном процессе.
Есть данные о том, что гены некоторых членов TRIM семейства белков в случае рекомбинации с некоторыми другими генами приобретают свойства онкогена [4]. Основываясь на том, что повышенная экспрессия гена hpub наблюдалась в ВИЧ-ассоциированньтх иммунобластных лимфомах, необходимо было проверить, является ли увеличение экспрессии этого гена одной из причин злокачественного перерождения клеток и возникновения опухолей?
Нами проведены эксперименты с целью изучения влияния повышенной и пониженной экспрессии гена hpub (pub) на пролиферацию и дифференцировку ЭС клеток мыши in vitro по трём зародышевым слоям: энтодерме, мезодерме и эктодерме. На культуре ЭС клеток мы показали, что ген hpub человека действует аналогично гену pub мыши, что в дальнейшем позволило сравнивать нам действие повышенной экспрессии
гена человека hpub и пониженной экспрессии TQnapub мыши. Произведена оценка онкогенного потенциала лимфоидспецифичного гена hpub первичных фибробластов эмбрионов крысы.
Цель исследования
Целью работы было изучение влияния лимфомоспецифического гена pub на рост и дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши in vitro и оценка онкогенного потенциала данного гена.
Задачи исследования:
1. Изучить профиль экспрессии эндогенного гена pub на начальных этапах
дифференцировки эмбриональных стволовых (ЭС) клеток мыши (при
образовании эмбриоидных тел);
Получить стабильно трансфицированные поликлональные линии ЭС клеток мыши с повышенной экспрессией гена pub человека (hpub) и подавленной экспрессией эндогенного гепа pub мыши;
Изучить влияния подавления экспрессии гена pub и' повышенной экспрессии гена hpub на пролиферацию и дифференцировку ЭС клеток мыши в разных направлениях (эктодермальном, энтодермальном, мезодермальном);
Оценить онкогенный потенциал гена hpub человека на культуре псевдонормальных клеток крысы линии Rat-2.
Направленная дифференцировка ЭС клеток в культуре
Мезодермальное направление развития ЭС клеток на данный момент является наиболее изученным и включает в себя гемопоэз, кардиогенез и образование клеток сосудов. Более того, многие исследования отмечают поразительное сходство между дифференцировкой в данном направлении ЭС клеток in vitro и in vivo [18].
Направленная дифференцировка ЭС клеток в гемопоэтическом направлении и развития клеток сосудов
В определённых условиях культивирования ЭС клетки идут по пути гемопоэтической дифференцировки. Причём развитие клеток крови in vitro напоминает данный процесс на начальных стадиях эмбрионального развития.
Как известно, гемопоэз в тканях раннего эмбриона начинается в двух независимых участках: желточном мешке и в пара-аортальной спланхноплевре (ПС) [49,50,51]. Сразу после стадии гаструляции в желточном мешке формируются так называемые "кровяные островки", в
которых в последствие образуются первичные эритроциты— ядерные клетки, содержащие эмбриональную форму гемоглобина. Помимо первичных эритроцитов здесь образуются и некоторые зрелые типы клеток крови, в частности, макрофаги, эритроциты. Гемопоэз в ПС, включает в себя образование миелоидных, лимфоидных, эритроидных линий клеток, а также гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) [52,53].
Keller G. с сотрудниками показали, что многие характеристики первичных эритроцитов, образованных из ЭТ, идентичны популяции первичных эритроцитов в желточном мешке раннего эмбриона [54]. Например, обе популяции образуют маленькие колонии крупных ядерных клеток, продуцирующих эмбриональный глобин. Обе первичные эритроидные линии представляют собой временное образование, появляющееся в ходе развития очень рано и сохраняющееся в течение короткого времени (около 4 дней). Анализ экспрессии некоторых генов, принимающих участие в гемопоэзе, указывают на сходство первичных эритроцитов желточного мешка и ЭТ. Например, GATA-1 — ген, вовлечённый в развитие эритроидной линии in vivo, экспрессируется и в ЭТ. Однако, в ходе эмбрионального развития экспрессия GATA-1 предшествует экспрессии Р-глобина приблизительно на 24 часа, тогда как при развитии ЭТ экспрессия этих двух генов совпадает во времени. Эти отличия исследователи объясняют разной кинетикой развития ЭТ и эмбриона [54].
Как уже было сказано, образование миелоидных, лимфоидных, эритроидных линий клеток, а также ГСК у эмбриона происходит позднее в ПС. В ходе развития ЭС клеток in vitro линии, обладающие характеристиками клеток ПС, так же могут выявляться на более поздних стадиях дифференцировки. Показано, что при культивировании на подложке из ОР9 стромальных клеток в среде, содержащей лимфоидные цитокины, часть ЭС клеток дифференцируется в В-лимфоциты. Существуют данные о том, что экспрессия лиганда Notch рецептора в ОР9 стромальных клетках способствует развитию В и Т лимфоцитов in vivo. Вероятно, что Notch-путь передачи сигнала действует подобным образом и в культуре клеток in vitro [18].
Как уже было сказано, создавая определённые условия культивирования ЭС клеток, исследователь может повлиять на ход дифференцировки ЭС клеток в том или ином направлении. Показано, например, что степень дифференцировки ЭС клеток в клетки крови, зависит от количества и вида сыворотки, используемой при культивировании клеток. Так, увеличение концентрации сыворотки в среде приводит к возрастанию гемопоэтической активности ЭТ. Также и использование сыворотки плазмы крови, вместо фетальной сыворотки коровы (FCS, fetal calf serum), способствует более активной дифференцировке клеток в данном направлении [54].
Согласно одной гипотезе, существует единый предшественник гемопоэтических и эндотелиальных клеток, известный как гемангиобласт. Основана данная гипотеза на том факте, что клетки крови и эндотелия сосудов развиваются в одно и то же время на близком расстоянии друг от друга в "кровяных островках" желточного мешка [55,56,57]. Исследования ранних стадий развития ЭТ in vitro позволили выявить предшественника — колониеформирующую клетку (КФК),— который даёт начало колониям, содержащим как гемопоэтическии компонент (предшественника первичных эритроцитов), так и сосудистый в присутствие фактора роста эндотелия сосудов (VEGF, vascular endothelial growth factor). Сосудистый компонент в данном случае представляет собой предшественника как эндотелиальных, так и гладкомышечных клеток сосудов [18].
Приготовление фидерного слоя из первичных эмбриональных фибробластов (ПЭФ) мыши
Введение плазмидной ДНК в ЭС клетки осуществляли с помощью электропорации на приборе СУМ4 (производство Института молекулярной биологии РАН им. В.А. Энгельгардта) при следующих экспериментально подобранных параметрах: продолжительность импульса - 1,5 мс, напряжение 400 В. Для трансфекции 1000000 клеток использовали 8 мкг плазмидной ДНК. Трансфицированные клетки рассевали по 200000 на чашки диаметром 35 мм, покрытые желатином (0,1%). В культуральную среду добавляли LIF (10 нг/мл). Селекцию начинали на вторые сутки после посева добавлением в среду антибиотика G418 (200 мкг/мл). Смену селективной среды проводили каждые 3-4 суток. Поликлональные культуры каждого варианта трансфекции снимали с чашек на 10-ый день селекции в виде суммарного пула G418-резистентных клонов.
Накануне трансфекции ЭС клетки рассевали на чашки d=35, покрытые желатином в количестве 500 тыс. на чашку, в стандартную среду культивирования. На следующий день осуществляли введение плазмидной ДНК в клетки с помощью реагента Унифектин-56 («Unifect. The transfection group». Россия) по стандартной методике. Для трансфекции использовали плазмиды k-myc и pub-myc в концентрации 6 мкг на 1 млн. клеток. Для оценки частоты трансфекции использовали плазмиду, содержащую ген белка, флуоресцирующего зелёным светом: pEGFP-Cl.
Введение плазмидной ДНК в клетки Rat-2 осуществляли с помощью электропорации на приборе СУМ4 (производство Института молекулярной биологии РАН им. В.А. Энгельгардта) при следующих экспериментально подобранных параметрах: продолжительность импульса — 1,5 мс, напряжение 600 В. Для трансфекции 1000000 клеток использовали 6 мкг плазмидной ДНК. Трансфицированные клетки рассевали по 250 000 на чашки диаметром 60 мм, в 5 мл стандартной среды для культивирования. По достижению клетками 90% монослоя осуществляли ее замену на среду с пониженным содержанием ФСК ( 3%). Далее клетки культивировали еще в течение 20 дней, производя смену среды каждые 3 суток. Через 23 дня после трансфекции, клетки фиксировали 2 % парафармальдегидом и окрашивали метиленовым синим. Подсчет фокусов морфологической трансформации осуществляли визуально под микроскопом (Olympus СКХ41., Japan).
Введение плазмидной ДНК в клетки осуществляли с помощью реагента Унифектин-56 («Unifect. The transfection group». Россия) по стандартной методике. Для трансфекции использовали плазмиды pcDNA3 и рРВ в концентрации 6 мкг на 1 млн. клеток. Селекцию начинали на вторые сутки после посева добавлением в среду антибиотика G418 (500 мкг/мл). Смену селективной среды проводили каждые 3-4 суток. Поликлональные культуры каждого варианта трансфекции снимали с чашек на 14-ый день селекции в виде суммарного пула G418-резистентных клонов.
Для определения ростовых характеристик клетки рассевали по 150000 на чашки диаметром 35 мм, покрытые желатином (0,1%) с добавлением LIF (10 нг/мл). Количество клеток оценивали на 3-й сутки после посева прямым подсчетом под микроскопом Olympus СКХ41 ("Olympus", Япония) в камере Горяева. Для каждой линии просчитывали не менее 6 чашек.
Для индукции дифференцировки с образованием эмбриоидных тел ЭС клетки изолировали от фибробластов фидерного слоя. Для этого клетки обрабатывали трипсином, центрифугировали, а затем полученную суспензию инкубировали в чашке Петри (d =60 мм) ("Nunc" Дания) в течение 10-20 мин. За это время основная масса фибробластов прикрепляется ко дну чашки, в то время как ЭС клетки остаются в суспензии. Для формирования ЭТ суспензию ЭС клеток переносили на чашку Петри (d=35 мм) ("Nunc" Дания) в количестве 200 000 клеток в 2 мл среды, либо на 96-луночную иммунологическую плашку (по 1000 клеток на лунку, в 100 мкл среды), затем помещали в С02-инкубатор (5% СОг). На 2-4 сутки культивирования образовавшиеся ЭТ переносили на чашки, покрытые желатиной (0,1%) ("Serva", ФРГ). Подсчет количества образованных ЭТ проводили на 3-4 и 6-8 сутки с момента появления первых ЭТ.
Тотальную РНК из недифференцированных ЭС клеток (культивировались без фидерного слоя в присутствии LIF,), ЭТ, а также из других клеточных линий и тканей выделяли методом, фенол-хлороформной экстракции с использованием набора YellowSolve («Clonogen», Россия), следуя рекомендациям производителя. Процедуру обратной транскрипции проводили с использованием набора фирмы «Силекс» (Россия) согласно протоколу и рекомендациям производителя. Синтез кДНК проводили на 0,5 мкг тотальной РНК в течение 1 ч при 37 С в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 0,05 мкг случайных гексапраймеров и 100 ед. обратной транскриптазы MMLV (moloney murine leukemia virus). После остановки реакции (инкубация 10 мин при 70С) образцы кДНК хранили при -20 С. Определение концентрации РНК в пробе.
Концентрацию РНК в пробе определяли спектрофотометрическим методом с использованием следующей формулы: С = А2бо х [разведение] х 40 , где С — концентрация (мкг/мл) исходного раствора РНК Коэффициент 40 отражает пересчёт оптических единиц в концентрационные: 1А2бо РНК=40мкг/мл. Определение пативности и чистоты выделенной РНК.
Чистоту и нативность выделенной РНК определяли при помощи электрофореза в 2%-ном агарозном геле, приготовленном на 40 мМ Трис-ацетатном буфере, содержащем 2мМ ЭДТА, рН 8,5 (xl-ный ТАЕ буфер). Гель содержал бромистый этидий в концентрации 0,1 мкг/мл. Хорошо выделенным препаратом считали тот, который на электрофореграмме давал дискретные полосы, соответствующие 18S и 28S рРНК, а так же 5S РНК.
Критерием чистоты также являлось отношение А2бо / A2go , отражающее наличие примеси белка в пробе. При величине А2бо / А280 2 препарат РНК считали чистым. Полимеразную цепную реакцию (ПНР) проводили в 25 мкл реакционной смеси, состоящей из Taq-буфера, 1,5 мМ смеси dNTP, 1,25 ед. «colored» Taq полимеразы («Синтол», Россия), 0,5 мкл образца кДНК и 10 пмоль каждого праймера. Праймеры использованные в работе представлены в таблице 2.
Продукты ПЦР разделяли в 1,5 % агарозном геле с визуализацией с помощью бромистого этидия, далее с помощью системы BioDocAnalyze («Biometra», ФРГ) определяли интенсивность свечения продуктов в ультрафиолетовом свете.
Выделение белковых гомогенатов из клеток млекопитающих
Для более полного изучения влияния гена, часто бывает не достаточно получить модели только с повышенной экспрессией изучаемого гена. В нашем исследовании мы использовали двунаправленный подход, а именно получили стабильно трансфицированные линии клеток с повышенной экспрессией экзогенного гена hpub человека и линии клеток с пониженной экспрессией эндогенного гена pub мыши. Для этого были сконструированны следующие плазмиды.
1. Плазмида рРВ, на основе вектора pcDNA3 содержал вставку кДНК гена hpub (KIAA0129) человека (номер в базе данных «Blast 2», gi 15208662), по сайтам Hindlll/Notl.
2. Плазмида pRNAi была сконструирована на основе вектора рсіпео, в котором промотор цитомегаловируса (CMV) был заменен на промотор гена гистона НІ для экспрессии миРНК (pined). Два синтезированных олигонуклеотида: (подчеркнуты инвертированные последовательности) подвергали отжигу и клонировали в плазмиду pineo по BgUI и Hindlll сайтам. Данная плазмида позволяет обеспечить транскрипцию в клетках миРНК, гомологичной определенному участку гена pub. Все рекомбинантные плазмиды содержали в своем составе ген устойчивости к антибиотику генетицину (G418), что позволяло обеспечить селекцию трансфицированных клеток.
В результате трансфекции ЭС клеток и последующей селекции были получены 4 стабильно трансфицированные поликлональные культуры. 1. ЭС-hPub (линия с повышенной экспрессией гена hpub) 2. 3C-DNA3 (контрольная линия) 3. ЭС-RNAi (линия с потенциально пониженной экспрессией эндогенного гена, pub) 4. ЭС-Ineo (контрольная линия).
Методом ОТ-ПЦР была обнаружена экспрессия гена hpub в недифференцированных ЭС клетках, а также в ЭТ линии ЭС - hPub, в то время как в контрольной лини ЭС -DNA3 экспресии этого гена, как и следовало, ожидать, не наблюдалось (рис. 10а). В то же время экспрессия эндогенного (мышиного) гена pub была показана в обеих линиях клеток (рис. 106). В качестве положительного контроля для определения гена hpub использовали плазмиду рРВ, несущую кДНК человеческого гена hpub. Для отрицательного контроля и определения загрязнения РНК геномной ДНК, мы использовали смесь образцов РНК, которую так же подвергали процедуре обратной транскрипции, но без добавления MMLV-обратной транскриптазы (во всех последующих ОТ-ПЦР применяли такой же отрицательный контроль) В качестве гена «домашнего хозяйства» использовали ген GAPDH.
Экспрессия экзогенного гена hpub и эндогенного гена pub в стабильно трансфицированных недифференцированных ЭС клетках и ЭТ. а) Экспрессия экзогенного гена hpub. М- маркер pUC19/Mspl, 1. клетки ЭС-hPub, 2. клетки 3-DNA3, 3. ЭТ-hPub (ЭТ, образованные из клеток линии ЭС -hPub). 4. 3T-DNA3 (ЭТ, образованные из клеток линии 3C-DNA3), 5- отрицательный контроль, 6. положительный контроль (плазмида рРВ) б) Экспрессия эндогенного гена pub 1. клетки ЭС -hPub, 2. клетки ЭС -DNA3, 3. ЭТ-hPub , 4. 3T-DNA3, 5. положительный контроль (костный мозг мыши) в) Экспрессия гена GAPDH 1. клетки ЭС-hPub, 2. клетки 3C-DNA3, 3. ЭТ-hPub , 4. 3T-DNA3.
Также нами методом иммуноблоттинга с использованием поликлональных антител к TRIM 14 (Aviva Systems biologi, США) было показано наличие белкового продукта hPub, в линии клеток ЭС -hpub и эмбриоидных телах ЭТ-hPub, в отличие от контрольной линии. В качестве положительного контроля использовали клеточную линию Jurkat (лейкемические Т-лимфоциты человека) (рис. 11).
Иммуноблотинг трансфицированных ЭС клеток и ЭТ. 1. клетки ЭС-hPub, 2. ЭТ-hPub (ЭТ, образованные из клеток линии ЭС-hPub). 3. клетки 3C-DNA3, 4. 3T-DNA3 (ЭТ, образованные из клеток линии ЭС -DNA3), 5. Положительный контроль, клетки Jurkat.
Также методом ОТ-ПЦР было показано заметное снижение экспрессии эндогенного гена pub в клетках и ЭТ линии ЭС-RNAi по сравнению с контрольной линией клеток ЭС-Ineo. В качестве положительного контроля использовали плазмиду pub-myc, несущую кДНК мышиного гена pub (рис. 12). а) Экспрессия эндогенного гена pub 1. клетки ЭС-Ineo, 2. клетки ЭС-RNAi, 3. ЭТ-Ineo , 4. ЭТ-RNAi, 5. положительный контроль (плазмида pub-myc), 6. отрицательный контроль в) Экспрессия гена GAPDH 1. клетки ЭС-Ineo, 2. клетки ЭС-RNAi, 3. ЭТ-1пео, 4. ЭТ-RNAi. Таким образом, мы получили трансфицированные поликлональные ЭС клетки с повышенной экспрессией гена hpub и пониженной экспрессией эндогенного гена pub. Однако перед нами встал вопрос можно ли сравнивать действия человеческого и мышиного генов? Безусловно, высокая гомология этих генов дает нам такое право, но мы решили проверить, будут ли воспроизводиться данные при трансфекции ЭС клеток эндогенным геном pub хотя бы на начальных этапах дифференцировки. Японскими коллегами [2] любезно была предоставлена плазмида pub-myc, несущая кДНК гена pub мыши, экспрессирующийся слитно с туе эпитопом. Данная плазмида не имела гена устойчивости к антибиотику, для осуществления селекции и получения стабильных трансфектантов. Поэтому, мы смогли получить и проанализировать только транзиентно трансфицированные линии ЭС клеток. Чтобы получить контрольный вектор k-pub-myc, из плазмиды pub-myc по сайту Xhol был вырезан ген pub. Для повышения эффективности трансфекции в данном эксперименте мы использовали липофектаминовый метод. Для оценки частоты трансфекции использовали плазмиду, содержащую ген белка, флуоресцирующего зелёным светом: pEGFP-Cl. Частота трансформации составила порядка 10"4.
В результате трансфекции ЭС клеток мыши линии R1 были получены 2 поликлональные культуры ЭС-pub-myc (несущая трансген) и ЭС-тус (контроль). С помощью ОТ-ПЦР мы показали увеличение экспрессии гена pub как в недифференцированных ЭС клетках трансфицированных геном pub (ЭС-pub-myc) так и в ЭТ, полученных из этих клеток по сравнению с контролем (ЭС-myc) (рис. 13). В качестве положительного контроля использовали плазмиду pub-myc, в качестве отрицательного смесь образцов РНК (см. выше)
Влияние повышенной экспрессии гена hpub и пониженной экспрессии гєпариЬ на разные пути дифференцировки ЭС клеток мыши
Для изучения влияния генов hpub и pub на дифференцировку в эктодермальном направлении, были выбраны гены ответственные за дифференцировку нейральных клеток, а именно гены nestin, /? III tubulin, gfap и ген th (тирозингидроксилаза).
Нейрональные стволовые клетки м.б. определены наличием гена нестина, (промежуточного нейрофиламента), он также найден в молодых нейронах, reactive глиальных клетках и эпендимальных клетках. Его экспрессия наблюдается на ранних стадих формирования центральной и переферической нервной системы.
GFAP — белок промежуточных филаментов, эго экспрессия обнаружена в глиальных клетках (астроцитах). [142]
Ген тирозин гидроксилазы (th) — синтезируется в более поздних допаминэргических нейронах. [143]
Как видно из результатов ПНР анализа, в клетках с повышенной экспрессией гена hpub наблюдается снижение экспрессии генов вовлеченных в нейральную дифференцировку, а в клетках с пониженной экспрессией pub напротив, увеличение экспрессии этих генов по сравнению с контролями. Такая картина характерна для трех {nestin , р-Ш tubuli, gfap) из четырех проанализированных генов. Экспрессия гена тирозингидроксилазы остается на одинаковом низком уровне для всех четырех линий клеток. Данный результат можно объяснить тем, что допаминэргические нейроны, для которых характерно наличие экспрессии гена th, образуются более поздно, чем другие виды нейральных клеток. Возможно, также это связано с тем, что гены hpub и pub оказывают не столь значительное влияние на образование нейральных клеток и невозможно получить более поздние типы нейронов.
В одной из работ по исследованию свойств RFP, одного из членов семейства TRIM, была показана экспрессия данного белка в ядрах центральных и периферических нейронов (в клетках Пуркинье и ганглиев), а также нейронов и глиальных клеток коры головного мозга [100]. Участие данного белка в регуляции транскрипцонной активности генов через ассоциацию с Polycomb-группой белков предполагает участие RFP в росте и дифференцировке данных клеток [101].
Следующим этапом исследования влияния генов hpub и pub на нейрональную дифференцировку было проведение иммуноцитохимического анализа трансфицированных линий на выявление специфического маркёра нейрональных предшественников — Р-Ш тубулина в дифференцированных клетках. Иммуноцитохимическое окрашивание проводили на 21-е сут культивирования ЭС клеток.
Результаты эксперимента представлены на рисунке 24. Как можно видеть из рисунка, в линии ЭС клеток с повышенной экспрессией гена hpub наблюдается уменьшение количества Р-Ш тубулин-положительных клеток по сравнению с контрольной линией почти в 2 раза. Противоположную картину можно увидеть в линии клеток с потенциально пониженной экспрессией гена pub. В этом случае количество р-Ш тубулин - положительных клеток значительно превышает таковое в контрольной линии более чем в 2 раза.
Для дальнейшего исследования влияния гена hpub мы использовали в нашей работе другую модель соматических клеток, а именно линию клеток РС-12.
Клетки линии РС-12 являются удобной и широко используемой моделью для изучения процессов нейрональной дифференцировки и клеточной гибели, поскольку под действием фактора роста нервов (ФРН), добавляемого в культуральную среду они приобретают нейронально-подобный фенотип.
Была проведена трансфекция клеток РС-12 с помощью липофектамина (по стандартной методике) векторами pcDNA3 (контроль) и рРВ (несущим кДНК гена hpub). В этом эксперименте мы имели возможность оценить влияние только повышенной экспрессии гена hpub, тк вектор, несущий интерфирирующую последовательность для гена pub, был подобран только для мышиного гена. В результате трансфекции и последующей селекции на антибиотике G418, были получены две поликлональные линии клеток: 1. линия клеток PC 12-hpub (несущая трансген, hpub) 2. линия клеток PC12-DNA3 (контроль) С помощью метода ОТ-ПЦР было показано наличие экспрессии трансгена hpub в линии клеток PC 12-hpub, в контрольной линии данного продукта обнаружено не было (рис. 27).
Экспрессия гена hpub в трансфицированных не дифференцированных и дифференцированных линиях клеток PC-12. 1. клетки PC12-hPub, 2. клетки PC12-DNA3, 3. дифференцированные клетки PC12-hPub, 4 дифференцированные клетки PC12-DNA3, 5-положительный контроль (плазмида рРВ, несущая вставку кДНК гена hpub), 6 - отрицательный контроль.
На первом этапе исследования мы провели оценку пролиферативной активности трансфицированных линий (рис. 28). Для этого эксперимента клетки рассевали на 24-х луночную плашку по 12,5 тыс. клеток на лунку в 1 мл среды. Прямой подсчет клеток в камере Горяева осуществляли на 3, 4, и 5 сутки культивирования. Было показано, что как в условиях стандартного культивирования (среда RPMI, глутамин, гентамицин, 15% эмбриональной бычьей сыворотки) так и в условиях трофического голодания (1% эмбриональной бычьей сыворотки) клетки линии PC 12-hpub не отличались по скорости роста от контрольной линии клеток PC 12-DNA3. Эти данные согласуются с результатами, полученными нами ранее в ходе изучения пролиферативной активности трансфицированных ЭС клеток.
