Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 19
1.1. Кальций и фосфат в организме человека 19
1.2. Пластинчатая кость 20
1.2.1. Процесс минерализации пластинчатой кости 20
1.2.2. Рельеф фронта минерализации кости 25
1.2.3. Минеральный компонент костного матрикса и его связь с органическими структурами межклеточного вещества 25
1.2.4. Изменения минерального компонента пластинчатой кости при старении 29
1.3. Гиалиновый хрящ 30
1.3.1. Процесс минерализации гиалинового хряща 31
1.3.2. Фронт минерализации и остеохондральное соединение гиалинового хряща 36
1.3.3. Минеральный компонент гиалинового хряща и его связь с органическими структурами межклеточного вещества 37
1.3.4. Изменения минерального компонента гиалинового хряща при старении 38
1.4. Фиброзный хрящ 38
1.4.1. Процесс минерализации фиброзного хряща 40
1.4.2. Фронт минерализации фиброзного хряща и область остеохондрального соединения 41
1.4.3. Минеральный компонент фиброзного хряща и его связь с органическими структурами межклеточного вещества
1.4.4. Изменения минерального компонента фиброзного хряща при старении 43
1.5. Атерокальциноз - частный случай эктопического обызвествления 43
1.5.1. Процесе минерализации атеросклеротической бляшки 45
1.5.2. Рельєф фронта минерализации атеросклеротической бляшки 47
1.5.3. Минерал атеросклеротической бляшки и его связь с её органическим компонентом 47
1.5.4. Процесс оссификакции в минерализованной атеросклеротической бляшке 48
1.6. Заключение 49
Глава II. Материал и методы исследования 52
2.1. Характеристика исследованного материала 52
2.2. Методы исследования 55
2.2.1. Световая микроскопия 55
2.2.2. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) 55
2.2.3. Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ) 56
2.2.4.Удаление кристаллов холестерина из минерализованных атероматозных масс атеросклеротических бляшек при подготовке их к исследованию методами СЭМ и ТЭМ 57
2.2.5. Получение изолированных минеральных частиц из образцов кальцифицированных тканей 57
2.2.6. Криофрактография и получение платино-углеродных реплик с естественных поверхностей минерализованных тканей 57
2.2.7. Измерение линейных параметров минеральных частиц 58
2.2.8. Статистическая обработка полученных данных 59
2.3. Условные обозначения, принятые в работе 60
Глава III. Морфологическая характеристика минерального компонента компактного и губчатого вещества пластинчатой кости поясничных позвонков людей зрелого возраста 62
3.1. Характеристика компактного и губчатого вещества передне-боковой зоны поясничных позвонков 62
3.2. Особенности процесса минерализации пластинчатой кости 62
3.3. Строение костного минерала 64
3.4. Костная поверхность и рельеф фронта минерализации переднебоковой зоны тела позвонка 68
3.4.1 .Формирующиеся участки костной поверхности 68
3.4.2. Сформированные участки костной поверхности 70
3.4.3. Резорбирующиеся участки костной поверхности 73
3.5. Поверхность костных лакун и канальцев 75
3.6. Заключение 75
Глава IV. Морфологическая характеристика минерального компонента гиалинового хряща рёбер у людей зрелого возраста 78
4.1. Общая характеристика минерализованной зоны рёберного хряща 78
4.2. Фронт минерализации гиалинового хряща 78
4.3. Особенности процесса минерализации гиалинового хряща 80
4.4. Структурная организация минерального компонента матрикса гиалинового хряща 82
4.5. Минеральный компонент в области стенок лакун хондроцитов 90
4.6. Область остеохондрального соединения 90
4.7. Заключение 93
Глава V. Структурная организация минеральной фазы фиброзного хряща в фиброзных кольцах межпозвоночных дисков и прободающих волокнах поясничных позвонков у людей зрелого возраста 95
5.1. Общая характеристика минерализованных зон фиброзного кольца межпозвоночного диска и прободающих волокон в поясничных позвонках 95
5.2. Процесс минерализации фиброзного хряща 95
5.3. Фронт минерализации фиброзного хряща 101
5.4. Структурная организация минерала фиброзного хряща 104
5.4.1. Интертерриториальный матрикс 104
5.4.2. Территориальный матрикс 108
5.4.3. Минеральный компонент в области контакта структур территориального и интертерриториального матрикса 110
5.5. Заключение 112
Глава VI. Особенности строения минерального компонента обызвествляющихся видов соединительной ткани в скелете людей старческого возраста 115
6.1. Пластинчатая кость в скелете людей старческого возраста 115
6.2. Минерализованная зона гиалинового хряща в скелете людей старческого возраста 116
6.3. Минерализованная зона фиброзного хряща в скелете людей старческого возраста 121
6.4. Заключение 126
Глава VII. Особенности распределения минеральных частиц при эктопическом обызвествлении на примере атерокальциноза 129
7.1. Общая характеристика обызвествляющихся участков артериальной стенки при атерокальцинозе 129
7.2. Особенности процесса минерализации при атерокальцинозе 129
7.3. Рельеф фронта минерализации кальцифицированной зоны атеросклеротической бляшки 131
7.4. Структурная организация и пространственное распределение минерального компонента атеросклеротической бляшки 133
7.4.1. Кальцифицированные области атероматозного распада 135
7.4.2. Области минерализованной соединительной ткани 137
7.6. Заключение 140
Обсуждение полученных результатов 145
Выводы 181
Практические рекомендации 185
Список использованной литературы 186
- Минеральный компонент костного матрикса и его связь с органическими структурами межклеточного вещества
- Минеральный компонент фиброзного хряща и его связь с органическими структурами межклеточного вещества
- Структурная организация минерального компонента матрикса гиалинового хряща
- Минеральный компонент в области контакта структур территориального и интертерриториального матрикса
Введение к работе
Актуальность проблемы
Минерал придаёт пластинчатой кости, гиалиновому и фиброзному хрящам жёсткость, которая необходима опорным структурам скелета для выполнения стато-локомоторной функции и для защиты внутренних органов [Benjamin М. et al 1990; Mow V. et al 1992; Weiner S. et al 1999]. Нарушение структуры минеральной составляющей этих видов соединительной ткани, наряду с другими факторами, играет важную роль в патогенезе ряда заболеваний, приводящих к уменьшению двигательной активности и, как следствие, к снижению социальной адаптации людей [Мещков А.П. 2003; Fountos G. и др. 1997; Boulman N. и др. 2005]. Таким образом, определение закономерностей структурной организации минерального компонента межклеточного вещества кости и хрящей, способствующее пониманию их приспособляемости к действующим нагрузкам, является одной из фундаментальных проблем современной морфологии.
По мнению [Brown S. et al 2000; Balcerzak M. et al 2003; Anderson H. et al 2004; Hoshi K. et al 2004] в минерализованных тканях нуклеация и рост минеральных кристаллов контролируется органическим матриксом благодаря специфическим клеточно-опосредованным процессам. В зависимости от природы матрикса разные по составу органические компоненты, организующие ионы кальция и фосфата в структурированную минеральную фазу, включаются в образующийся композит [Buckwalter J. et al 1997; Gao J. 2000]. При этом сведения о влиянии органических структур на характер отложения минерала и о его строении в обызвествляющихся видах соединительной ткани отличаются противоречивостью или неполны [Kirsch Т. et al 2000; Felisbino S. et al 2002; Price P. et al 2004; Wilson E. et al 2005].
He однозначны данные об организации минерализованных коллагеновых фибрилл в кости и фиброзном хряще. Предлагаемые в работах
8 [Traub W. et al 1989; Fratzl P. et al 1991; Landis W. et al 1993; Jager I. et al 2000] модели таких фибрилл базируются на изучении строения отдельных фрагментов внутрифибриллярных минеральных структур и компьютерном моделировании, так как выделить для исследования отдельный пул локализованных в фибрилле кристаллов до настоящего времени не представлялось возможным. Не ясна пространственная организация кристаллов, расположенных в межфибриллярном пространстве, и кристаллов, локализованных на сформированных участках костной поверхности. До сих пор не объяснено, как влияет одновременное присутствие в матриксе крупных фракций коллагенов I и II типов на отложение и строение минерала фиброзного хряща [Nerlich A. et al 1998; Petersen W. et al 2000].
Остаётся открытым вопрос о минерализации коллагеновых фибрилл гиалинового хряща. Не известно, какую роль они играют при отложении минерального компонента в межклеточном веществе. Отсутствуют исчерпывающие данные о распределении минеральных образований и их взаимосвязи с органическими структурами в полностью обызвествлённом гиалиновом хряще [Boyde A. et al 1983; Kim Н. et al 1996; Akisaka Т. et al 1998; KimpelM. et all 999].
Недостаток данных о строении минерального компонента пластинчатой кости, гиалинового и фиброзного хрящей у людей зрелого возраста не позволяет выявить особенности его структуры у лиц старших возрастных групп. Указания [Подрушняк Е.П. и др. 1983; Chatterji S. et al 1968] на увеличение размеров кристаллов в матриксе пластинчатой кости при старении требуют проверки с применением комплекса морфологических методов исследования. Характеристики минеральных структур гиалинового и фиброзного хрящей у людей старческого возраста вообще не отражены в исследованной литературе.
9 Таким образом, из-за недостатка сведений в настоящее время не разработана концепция об особенностях отложения, организации минеральных образований и их взаимодействия с различными структурами органического компонента в обызвествляющихся видах соединительной ткани скелета человека. Отсутствие такой концепции затрудняет изучение механизмов эктопической кальцификации, так как для проведения сравнительных исследований необходим базис из данных о структуре минеральных отложений при физиологическом обызвествлении. Решение этой проблемы позволит не только уточнить строение минерализованных тканей, но и прогнозировать изменения в составе тканевого матрикса на разных этапах онтогенеза, в ходе ряда патологических и репаративных процессов.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы являлось выяснение закономерностей структурной организации минерального компонента пластинчатой кости и обызвествляющихся видов хряща, а также оценка их реализации в условиях эктопического обызвествления.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
установить структурные единицы, формирующие минерал обызвествляющихся видов соединительной ткани;
выявить общие закономерности строения минерального компонента в пластинчатой кости, гиалиновом и фиброзном хрящах;
определить механизмы отложения минерала в разных видах соединительной ткани;
показать особенности распределения минеральных структур в матриксе пластинчатой кости людей зрелого возраста;
выяснить отличительные черты устройства минеральной составляющей межклеточного вещества гиалинового хряща у лиц зрелого возраста;
установить закономерности размещения минеральных структур в матриксе фиброзного хряща людей зрелого возраста;
изучить особенности организации неорганических структур матрикса пластинчатой кости, фиброзного и гиалинового хрящей у лиц старческого возраста;
оценить сходство и различия в строении минеральных структур, формирующихся в условиях физиологической кальцификации и при эктопическом обызвествлении в минерализованных атеросклеротических бляшках;
на основании полученных данных создать модель кальцифицированной коллагеновой фибриллы.
Научная новизна исследования
Впервые проведено комплексное морфологическое исследование структуры и распределения минерального компонента в матриксе обызвествляющихся видов соединительной ткани человека. При этом разработана методика получения платиноуглеродных реплик с поверхности фронта минерализации образцов без замораживания-скалывания. В ходе настоящей работы установлено:
В межклеточном веществе пластинчатой кости, гиалинового и фиброзного хрящей наименьшими минеральными частицами являются кристаллы, которые формируют копланарные объединения в виде пластин неправильной формы.
В матриксе пластинчатой кости, гиалинового и фиброзного хрящей выделены пулы кристаллов и их объединений, локализованные в матриксных везикулах, коллагеновых фибриллах и основном веществе.
В минерализованных матриксных везикулах распределение плотноупакованных минеральных частиц определяется округлой формой везикул. Внутрифибриллярно расположены параллельные друг другу
спирально ориентированные минеральные пласты. В межфибриллярных промежутках размещены околофибриллярные минеральные манжетки и плотные группы объединений кристаллов. Сформированные участки костной поверхности покрыты параллельными слоями кристаллов и их объединений.
У лиц старческого возраста в матриксе пластинчатой кости, по сравнению со зрелым возрастом, копланарные объединения кристаллов увеличены в длину и ширину при неизменной толщине.
Коллагеновые фибриллы в гиалиновом хряще не содержат центров нуклеации кристаллов минерала и являются лишь каркасом для размещения неорганических структур.
Минерализованные матриксные везикулы и окружающие их кальцифицированные участки фибрилл и основного вещества в гиалиновом хряще образуют конгломераты (диаметр 0,1-1,2 мкм), которые в интертерриториальном и территориальном матриксе сливаются, формируя калькосфериты (диаметр 0,9-3,3 мкм).
В старческом возрасте, по сравнению со зрелым возрастом, копланарные объединения кристаллов в гиалиновом хряще уменьшены в длину и ширину при неизменной толщине. Появляются крупные минерализованные матриксные везикулы, разделённые на сегменты.
В области остеохондрального соединения конгломераты, расположенные в гиалиновом хряще, и пучки минерализованных коллагеновых фибрилл субхондральной кости образуют соединение по типу замка.
В фиброзном хряще минерализованные везикулы, фибриллы и основное вещество в интертерриториальном матриксе входят в состав обызвествлённых коллагеновых волокон, формирующих пучки, а в территориальном матриксе находятся в составе конгломератов (диаметр 0,2-0,6 мкм), объединяющихся в калькосфериты (диаметр 0,7-2,0 мкм).
У лиц старческого возраста в фиброзном хряще, по сравнению со зрелым возрастом, копланарные объединения кристаллов уменьшены в длину и
12 ширину при неизменной толщине.
В атеросклеротической бляшке в пучках коллагеновых волокон соединительной ткани выявлены везикулярный, внутрифибриллярный и внефибриллярный пулы минеральных частиц, а в очагах атероматозного распада везикулярный пул минеральных частиц и кальцифицированные атероматозные массы, образованные конгломератами (диаметр 257-844 нм), объединяющимися в калькосфериты (диаметр 0,9-3,0 мкм).
Фрагменты эластических мембран в процессе кальцификации атеросклеротической бляшки замуровываются в минеральные отложения с образованием окружающих их плотных футляров из конгломератов и калькосферитов.
Предложена модель кальцифицированной коллагеновой фибриллы в кости и обызвествляющихся видах хряща, которая соответствует новым данным о спиральной ориентации внутрифибриллярных минеральных пластов.
Теоретическая и практическая значимость
В настоящей работе на основании проведённых исследований разработаны теоретические положения, которые в совокупности открывают новые перспективы развития гистологии, анатомии и патологической анатомии минерализованных тканей. Диссертация создаёт методологическую основу для многостороннего изучения минеральных структур в организме человека.
Представленные в работе данные о строении минерального компонента в обызвествляющихся видах соединительной ткани следует включать в курс преподавания гистологии и анатомии. Информация о распределении минерализованных структур пластинчатой кости, гиалинового и фиброзного хрящей должна учитываться в практической и научной деятельности травматологов, ортопедов, терапевтов и врачей, работающих в области авиа-
13 космической медицины. Результаты работы, полученные на материале от людей старческого возраста, представляют интерес для геронтологов. Сведения о распределении минеральных структур соединительной ткани в норме будут полезны для судебно-медицинской практики и при исследовании археологических находок. Данные о минеральных отложениях в атеросклеротических бляшках могут быть внесены в курс преподавания патологической анатомии. Сведения о структурах, связанных с процессом биоминерализации, могут использоваться в ходе преподавания нормальной и патологической физиологии.
Полученные в исследовании данные могут служить основой для теоретического обоснования распределения минеральных структур в тканях в зависимости от выполняемой ими функции. Результаты данной работы должны быть учтены при разработке и внедрении в лечебный процесс новых композитных материалов, предназначенных для биопротезирования. Собранная в результате проведённой работы информация необходима для разработки методов лечения случаев эктопического обызвествления и патологических состояний, сопровождающихся нарушениями процесса минерализации в разных видах соединительной ткани скелета.
Реализация результатов исследования
Тема диссертации рассмотрена, утверждена Учёным Советом и включена в план научных исследований НИЦ БМТ ВИЛАР по проблеме «Репродукция клеток, тканей и биопротезирование». Новые сведения о структурных особенностях минеральной фазы обызвествляющихся видов соединительной ткани, а также предложенные методологические подходы, внедрены в научно-исследовательскую деятельность НИЦ БМТ ВИЛАР, ГОУ ВПО РГМУ Росздрава и ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава.
14 Рекомендации по использованию научных положений
Полученные данные могут быть использованы в ходе дальнейших исследований процесса минерализации и структурной организации минеральной фазы в пластинчатой кости, гиалиновом и фиброзном хрящах, при атерокальцинозе и в других случаях физиологического и эктопического обызвествления.
Установленные закономерности строения минерального компонента матрикса пластинчатой кости, гиалинового и фиброзного хрящей в старческом возрасте следует учитывать в геронтологической практике.
3. Выявленные особенности распределения минеральных структур в
межклеточном веществе кости и хрящей могут быть полезны .при разработке
и внедрении в лечебный процесс новых композитных материалов,
предназначенных для биопротезирования.
Разработанные методические подходы к изучению минеральной фазы обызвествлённых тканей следует использовать в практической работе кафедр гистологии, анатомии, патологической анатомии, физиологии, патологической физиологии, лабораторий электронной микроскопии.
Полученные новые сведения о структурных особенностях минерального компонента в обызвествляющихся видах соединительной ткани скелета и в кальцифицированных атеросклеротических бляшках могут быть использованы при составлении учебников и пособий по гистологии, анатомии человека, возрастной морфологии, патологической анатомии. Их целесообразно включать в учебный процесс медицинских и биологических факультетов ВУЗов.
Апробация работы
Материалы исследований доложены, обсуждены и одобрены на IV, V и VII Конгрессах Международной ассоциации морфологов (Нижний Новгород, 1998; Ульяновск, 2000; Казань 2004), на Научном совещании
15 «Экспериментально-гистологический анализ соединительных тканей и крови» (Санкт-Петербург, 1999), на IV Международной научно-практической конференции «Пожилой больной. Качество жизни.» (Москва, 1999), на 3-ем Международном конгрессе по интегративной антропологии (Белгород, 2000), на XVIII и XX Российских конференциях по электронной микроскопии (Черноголовка, 2000, 2004), на IV Украинской научно-практической конференции «Остеопороз: эпидемиология, клиника, диагностика и лечение» (Харьков, 2001), на Российском конгрессе по остеопорозу (Москва, 2003), на Годичной сессии Научно-исследовательского института морфологии человека РАМН (Москва, 2003), на заседании МНОАГЭ (Москва, 2004), на V Общероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов, (Казань, 2004), на IV Общероссийской конференции с международным участием «Проблемы морфологии. Теоретические и клинические аспекты» (Астрахань, 2005), на ежегодных научных конференциях НИЦ БМТ ВИЛАР (Москва 1996-2003).
По результатам исследований опубликовано 46 научных работ в
центральных научных журналах «Бюллетень экспериментальной биологии и
медицины», «Клиническая геронтология», «Морфология»,
«Морфологические ведомости», «Технологии живых систем», «Успехи современной биологии», «Успехи современного естествознания», в двух монографиях (коллективных изданиях), в сборниках трудов НИЦ БМТ ВИЛАР, в сборниках трудов, материалов и тезисов различных конференций, а также получен патент на изобретение.
Объём и структура работы
Диссертация изложена на 222 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы и собственных исследований, включающих в свой состав материал и методы исследования, пять глав, в которых отражены полученные результаты, и их обсуждение. Далее следуют выводы, практические рекомендации и указатель литературы, содержащий
ссылки на 337 работ (49 отечественных и 288 зарубеленых). Текст иллюстрирован 100 рисунками (схемы, световые и электронные микрофотографии) и девятью таблицами.
Основные положения, выносимые на защиту
В обызвествлённом матриксе пластинчатой кости, гиалинового и фиброзного хрящей людей зрелого возраста выявлено четыре уровня организации минерального компонента, из которых каждый последующий представлен структурами, сформированными из минеральных образований предыдущего уровня. Первый - уровень кристаллов и их объединений в виде пластин неправильной формы. Второй - уровень минерализованных коллагеновых фибрилл и матриксных везикул, где различают везикулярный, внутрифибриллярный и внефибриллярный пулы кристаллов и их объединений. Третий - уровень минерализованных коллагеновых волокон и конгломератов. Четвёртый - уровень пучков минерализованных волокон и калькосферитов.
В обызвествляющихся видах соединительной ткани существуют два независимых механизма инициации процесса минерализации, обусловленные особенностями строения органической матрицы. При первом минерализация межклеточного вещества на основе матриксных везикул приводит к формированию конгломератов, сливающихся в калькосфериты. При втором обызвествление за счёт коллагеновых фибрилл обусловливает появление минерализованных коллагеновых волокон, объединяющихся в пучки. В случае сочетанной нуклеации минеральных частиц отложение минерала в везикулах матрикса происходит раньше, чем в фибриллах. Аналогичные варианты обызвествления выявлены в условиях эктопической кальцификации при атерокальцинозе.
В пластинчатой кости людей зрелого возраста процесс обызвествления матрикса реализуется на основе минерализации коллагеновых фибрилл,
17 которые формируют основную часть межклеточного вещества. Межфибриллярные промежутки заполняет кальцифицированное основное вещество с редко встречающимися минерализованными матриксными везикулами. Обызвествлённые коллагеновые волокна формируют пучки в составе костных пластинок, образующих структуры компактного и губчатого вещества кости. Сформированные участки костной поверхности покрывает кальцифицированное основное вещество, в котором расположены несколько параллельных слоев кристаллов и их объединений. В старческом возрасте в межклеточном веществе кости объединения кристаллов увеличены в длину и ширину при неизменной толщине по сравнению со зрелым возрастом.
В гиалиновом хряще людей зрелого возраста процесс .минерализации инициируется матриксными везикулами с последующим формированием конгломератов и калькосферитов в интертерриториальном и территоририальном матриксе. Территориальный матрикс обызвествляется раньше интертерриториального. Конгломераты и калькосфериты в нём плотно упакованы и образуют минерализованные стенки лакун хондроцитов. В интертерриториальном матриксе они распределены более рыхло. Контакт калькосферитов между собой обеспечивает целостность минерального компонента во всём объёме кальцифицированного гиалинового хряща. У лиц старческого возраста в межклеточном веществе кальцифицированного гиалинового хряща длина и ширина объединений кристаллов уменьшены по сравнению со зрелым возрастом. Кроме того, в старческом возрасте появляются разделённые на сегменты крупные минерализованные матриксные везикулы.
В фиброзном хряще нуклеация кристаллов в территориальном матриксе осуществляется только в матриксных везикулах, а в интертерриториальном матриксе - в матриксных везикулах и коллагеновых фибриллах. При этом в территориальном матриксе образуются конгломераты, сливающиеся в калькосфериты, а в интертерриториальном матриксе формируются
18 минерализованные коллагеновые волокна, объединяющиеся в разнонаправленные пучки. В отличие от гиалинового хряща непрерывность минерального компонента во всём объёме фиброзного хряща обеспечивается за счёт контакта калькосферитов и кальцифицированных коллагеновых волокон. В старческом возрасте объединения кристаллов фиброзного хряща уменьшены по длине и ширине по сравнению со зрелым возрастом. 6. Разработана модель, отражающая распределение минеральных структур и коллагеновых молекул или микрофибрилл в обызвествлённых коллагеновых фибриллах пластинчатой кости, фиброзного и гиалинового хрящей. Каждая фибрилла состоит из параллельных друг другу слоев коллагеновых молекул или микрофибрилл, которые спирально ориентированы вдоль её продольной оси. Кристаллы и их копланарные объединения образуют параллельные пласты, которые аналогично ориентированы по ходу фибриллы. Отдельные копланарные объединения кристаллов размещаются в толще слоев коллагеновых молекул или микрофибрилл и обеспечивают связь между соседними минеральными пластами.
Минеральный компонент костного матрикса и его связь с органическими структурами межклеточного вещества
Содержание минеральной фазы может доходить до 65% массы и до 50% объема сухого остатка кости [15]. По мнению авторов [25] эти значения не являются постоянными и, например, для позвонков человека подвержены сезонным колебаниям на 10-11% с максимумом содержания минерала в зимне-весенний период.
В работе [157] показано более высокое содержание минерала у лиц мужского пола по сравнению с аналогичными показателями для женщин. Однако, в исследовании [28] не обнаружено тенденции увеличения количества неорганического компонента кости для одного из полов.
Кристаллы минерала в кости представлены гидроксиапатитом (СаюСРОДОНл) и составляют от 40% до 80% всей массы минеральной фазы [131, 170]. Однако, в вопросе о строении костного минерала остаётся ещё много неясного. Так, соотношение размеров в «идеальных» кристаллах гидроксиапатита по cja0 равно 0,734, а в кости людей зрелого возраста это значение меньше и составляет 0,730 [169, 293]. При близкой структурной организации «идеального» и костного гидроксиапатитов соотношение в первом составляет 1,67, в то время как во втором оно колеблется от 1,37 до 1,77 [49].
Расхождение показателей, характерных для костного минерала и «идеального» гидроксиапатита, могут иметь вполне объяснимые причины. В гидратный слой кристаллов минерала кости диффундирует ряд ионов (К+, Na , СГ, F", Mg , Sr" , Ra" , UO" , С03 \ цитрат-ион) [8]. На их поверхности адсорбируются хондроитин-4-сульфат, гепарин, альбумин. Возможен дефицит Са" или избыток РО4 в минеральных образованиях костного матрикса, недостаток ОН" и КҐ между атомами кислорода в ортофосфате. Ионы стронция замещают в решётке гидроксиапатита Са +-ионы, ионы фтора заменяют гидроксильную группу, ионы свинца также могут встраиваться в решётку кристаллов минерала кости [82, 276; 312].
По данным [222] при формировании гидроксиапатита могут встречаться такие промежуточные формы, как дикальцийфосфатдигидрат и октакальцийфосфат. Redepenning J. с соавторами [265] показали возможность преобразования брушита (СаНР04х2Н20) в гидроксиапатит. Не исключено, что в костном матриксе имеются различные виды фосфата кальция: трикальцийфосфат, дефектные апатиты, монолит и другие (в общей сложности 25 форм) [129].
В литературе встречаются два мнения о форме кристаллов костного минерала: стержневиднои и пластинчатой, и до сих пор этот вопрос окончательно не решён. В работах [16, 218] наименьшие структурные единицы костного минерала описываются как тонкие пластины, объединяющиеся в пласты. Пластинчатая форма кристаллов установлена и у частиц гидроксиапатита, выращенных искусственно [218, 282]. В исследованиях [196, 218] показано, что такие пластины имеют неровные края. Однако, некоторые авторы [140] полагают, что форма кристаллов костного минерала - стержневидная. В обзоре [15] помимо возможности существования кристаллов в виде стержней, приводятся данные об их шаровидной форме.
Противоречива информация о размерах кристаллов костного минерала. Автором обзора [146] приведены данные о линейных параметрах как стержневидных (20-40x1,5-3 нм), так и пластинчатых (50x25x10 нм) минеральных частиц. В обзоре [8] показано, что при помощи рентгенографического анализа были определены минимальные (9,6±1 нм) и максимальные (23±2 нм) размеры кристаллов минерала кости по с-оси (длина), которые в 2-3 раза больше аналогичных параметров для других осей. При этом такие данные сильно разнятся со значениями, полученными при помощи метода ТЭМ (40-100x3-6 нм, 5-150x3-5 нм, 150x3 нм) [8, 15]. По мнению [65] вариабельность размеров кристаллов минерала небольшая: 12-17x5 нм. Авторами [16, 21] показано, что длина минеральных пластинок в кости достигает 50-100 нм, но чаще встречаются структуры с размерами (35-50x20-40x4-6 нм), кроме того, на поверхности фибрилл выявлены удлинённые кристаллы (30-45x5-10x4-6 нм). В работе [140] подтверждены предыдущие данные о небольшой толщине кристаллов (3-4 нм).
Содержание аморфного фосфата кальция в разных костях скелета неодинаково и может доходить до 60% минерального компонента кости, выявляясь в больших количествах в костях растущего организма и убывая с возрастом [8]. В работе [252] он определяется как электроноплотный, лишенный очертаний и чёткой упорядоченности субстрат, включающий в себя тризамещённый или двузамещённый фосфат кальция. Соотношение Ca"+/PD+ в нём составляет 1,1-1,3, что значительно ниже, чем у кристаллов гидроксиапатита.
Не исключено, что аморфный фосфат кальция является нестабильным предшественником гидроксиапатита. Так, в водной среде in vitro возможен переход аморфного фосфата кальция в гидроксиапатит [249]. Авторы работы [231] на основе наблюдений за отложением карбоната кальция в коллагеновых губках выдвигают гипотезу о том, что в процессе минерализации аморфная минеральная фаза проникает в «дыры» и «поры» коллагеновых фибрилл кости, что в дальнейшем обеспечивает рост кристаллов гидроксиапатита.
Существует и противоположное мнение [306], что аморфного фосфата кальция не существует, а имеется лишь совокупность мелких растущих кристаллов на ранних этапах их формирования. Кроме того, [148] показано, что методом плотностного фракционного центрифугирования аморфный фосфат кальция не определяется даже в молодой кости.
В обзоре [8] показано, что ионы СОз"", содержание которых достигает 5% массы сухой кости, могут проникать в поверхностные слои кристаллов минерала. Это утверждение подтверждается исследованием на синтетических апатитах [81]. Авторы [6] считают, что карбонат-ионы связаны с аморфным или кристаллическим апатитом. При этом параметры решётки кристаллов карбонатапатита (Са9,75[(Р04)5,5(СОз)о,5]С03), описанные в работе [299] близки к таковым у гидроксиапатита и у костного минерала, что не исключает возможности присутствия кристаллов карбонатапатита в костном матриксе.
Минеральный компонент фиброзного хряща и его связь с органическими структурами межклеточного вещества
Как и в других обызвествляющихся видах соединительной ткани, хондроциты имеют непосредственное отношение к процессу минерализации фиброзного хряща, так как синтезируют большинство компонентов его межклеточного вещества [73]. Кроме того, по мнению [333] эти клетки накапливают минеральные ионы ещё до начала кальцификации матрикса. Накопленный твердофазный материал высвобождается в пузырьках (везикулах) [112]. Авторы [194, 333] указывают, что матриксные везикулы являются центрами нуклеации первых кристаллов минерала во внеклеточном матриксе фиброзного хряща.
По данным [159] основная часть минерального компонента в фиброзном хряще связана с коллагеном, матриксные везикулы обусловливают лишь появление локальных депозитов минерала на ранних этапах процесса минерализации. При этом в работе [118] с одной стороны, учитывается возможность активации матриксными везикулами последующей минерализации коллагеновых фибрилл, а, с другой стороны, не исключается независимый ход процесса минерализации в обеих этих структурах. Таким образом, вопрос о роли в процессе минерализации везикул матрикса и коллагеновых фибрилл до конца ещё не решён.
В работе [196] показано наличие начальных признаков отложения неорганического компонента хряща вдоль или около фибрилл коллагена в виде лучистых скоплений, рассеянных по всему матриксу на разной глубине. В исследованиях [197, 209] в результате сопоставления молекулярного строения коллагеновой фибриллы и локализации в ней первых кристаллов минерала было установлено, что на ранних стадиях процесса кальцификации они обнаруживаются в зонах «дыр» и «перекрытий» коллагеновых фибрилл, за исключением гидрофобных участков, преобладающих в зонах «перекрытий». Лишь в дальнейшем минерал может появляться по периметру фибрилл вне связи с матриксными везикулами. Однако, позднее [199] выявлено, что параллельно с внутрифибриллярным образованием кристаллов их нуклеация наблюдается на поверхности коллагеновых фибрилл.
Участие макромолекул матрикса в процессе минерализации фиброзного хряща изучено мало. В работе [120] была показана выраженная активность щелочной фосфатазы в территориальном матриксе вблизи от фронта минерализации. В фиброзном хряще сухожилия индюка в малых концентрациях присутствует фосфофорин, который за счёт электростатического взаимодействия присоединяется к преобладающим в фибриллах молекулам коллагена I типа и может являться медиатором обызвествления на поверхности коллагеновых фибрилл [123,311].
До настоящего времени спорным остаётся вопрос об участии коллагена X типа в обызвествлении фиброзного хряща. Так, по данным работ [143, 226], его локализация ограничена только пределами зоны, содержащей минеральный компонент. В противоположность этому мнению, некоторые авторы [120] указывают на отсутствие коллагена X типа в минерализующемся фиброзном хряще.
В области фронта минерализации фиброзного хряща располагаются отдельные минеральные депозиты кальцифицированного основного вещества и коллагеновые волокна, находящиеся на разных стадиях обызвествления [99]. Неровность границы минерализованной зоны усугубляется тем, что отложение неорганического компонента матрикса в различных пучках коллагеновых волокон осуществляется неравномерно.
Сведений об остеохондральном соединении в области контакта фиброзного хряща с костью нами в изученной литературе не обнаружено. В ряде работ [140, 195, 197, 310] кристаллы минерала фиброзного хряща описаны как тонкие пластины неправильной формы, объединяющиеся в пласты. Однако, встречаются данные об обнаружении изогнутых кристаллов [206]. Толщина кристаллов по данным [140] достигает всего 2 нм. Размеры кристаллов по сведениям [196, 197] колеблются в значительных пределах: 40-170x25-45x4-6 нм. Кристаллы в матриксе волокнистого хряща могут быть расположены как внефибриллярно, так и внутрифибриллярно [204]. Данные об их распределении в матриксе единичны, так [326] считают, то по отношению к продольным осям фибрилл коллагена они ориентированы под разными углами. Отрывочны сведения и о распределении минеральных образований в экстрафибриллярных пространствах. Известно лишь, что экстрафибриллярные кристаллы располагаются тангенциально по отношению к фибриллярной поверхности [204]. Внутрифибриллярные кристаллы, очевидно, наклонены к оси фибриллы под разными углами и могут быть упакованы менее плотно, чем в межфибриллярных промежутках. До настоящего времени был предложен ряд моделей строения минерализованной коллагеновой фибриллы в обызвествлённом сухожилии индюка, однако, общепризнанной ни одна из этих моделей не является. Так, Traub W. с соавторами [310] считают, что благодаря наличию расположенных в определённой последовательности межмолекулярных полостей внутри фибриллы формируются параллельные минеральные пласты. Рост пластинчатых кристаллов в перпендикулярном направлении относительно длинной оси фибриллы возможен по промежуткам между коллагеновыми молекулами. Расстояние между соседними пластами составляет около 3,8 нм.
В работе Landis W. с соавторами [197] предполагается, что молекулы коллагена, имеющие размеры около 300 нм в длину и 1,23 нм в диаметре, расположены рядами, в которых они выравнены в горизонтальном направлении и отделены друг от друга и от вышележащих и нижележащих рядов расстоянием в 0,24 нм. Каждый ряд молекул коллагена в фибрилле смещён относительно соседнего ряда на Ул длины молекулы, а ряды, расположенные в одной плоскости, разделены промежутками в 40 нм («дырами»). Кристаллы минерала, образовавшиеся в зонах «дыр», в ходе своего роста проникают за пределы этих зон, оказываясь в областях, заполненных молекулами коллагена (так называемых зонах «перекрытий»). Кристаллы из соседних зон «дыр», таким образом, могут объединяться и формировать параллельные пластинчатые структуры. При этом соседние ряды удалены друг от друга на расстояния, равные 4,2+1 нм.
Структурная организация минерального компонента матрикса гиалинового хряща
Проведенный анализ литературы показал, что, несмотря на обилие данных о минеральном компоненте пластинчатой кости многие вопросы остаются нерешенными или спорными. Так, до конца не ясна последовательность минерализации основного вещества и фибрилл коллагена. Требуют дополнения сведения о роли клеток, матриксных везикул и коллагеновых фибрилл в инициации процесса минерализации. Нет определённости в данных о значении аморфного фосфата кальция как предшественника гидроксиапатита.
Противоречивы сведения о форме, размерах и ориентации кристаллов минерала в костной ткани. Не установлена пространственная организация и взаимосвязь между внутрифибриллярно и межфибриллярно расположенными кристаллами. Нет сведений о распределении кристаллов на формирующихся, сформированных и резорбирующихся участках костной поверхности. Отсутствует общепризнанная модель пространственной организации минеральной и органической фаз костного матрикса. Теории о распределении минеральных частиц в межклеточном веществе кости базируются на основании косвенных фактов и компьютерного моделирования. Сведения об особенностях структуры и пространственной организации костного минерала у лиц старших возрастных групп отрывочны.
Не определена роль клеток и компонентов внеклеточного матрикса в процессе минерализации гиалинового хряща. Отличаются скудостью сведения о характере распределения неорганических структур в его интертерриториальном и территориальном матриксе.
В изученной литературе крайне отрывочна информация о форме кристаллов минерала в гиалиновом хряще. Не обнаружены данные об их размерах. На фоне малого количества сведений о пространственной организации межфибриллярных кристаллов минерала данные о внутрифибриллярных отложениях неорганического вещества в фибриллах коллагена гиалинового хряща вообще не обнаружены. На основании имеющихся в рассмотренных работах сведений невозможно составить представление о распределении минерального и органического компонентов на различных уровнях организации обызвествлённого хрящевого матрикса. Кроме того, отсутствуют данные о строении минерального компонента в гиалиновом хряще у лиц старших возрастных групп.
До конца не ясен ход процесса отложения минерального компонента в матриксе фиброзного хряща. Требует существенного дополнения схема влияния на обызвествление хряща хондроцитов, а также таких структурных компонентов межклеточного вещества, как матриксные везикулы, коллагеновые структуры, макромолекулы основного вещества.
Проведённый анализ литературы показал, что представления о строении минерализованного матрикса фиброзного хряща являются достаточно отрывочными и противоречивыми. Так, скудны сведения о форме и размерах кристаллов минерала. Неполны данные о расположении неорганических структур внутри фибрилл, в межфибриллярных пространствах и о взаимодействии их между собой. Нет общепринятой точки зрения на взаимосвязь минеральной и органической составляющих матрикса фиброзного хряща. Отсутствуют какие-либо сведения о строении минерального компонента матрикса фиброзного хряща у лиц старших возрастных групп.
Из приведённого обзора литературы видно, что при атерокальцинозе минерал атеросклеротических бляшек представлен гидроксиапатитом. Это обеспечивает возможность сравнения неорганических образований, сформированных как при кальцификации пластинчатой кости, гиалинового и фиброзного хрящей, так и в условиях патологии. На основании результатов такого сравнительного исследования можно составить единую концепцию о строении кальцифицированного матрикса при физиологическом и эктопическом обызвествлении, что позволит использовать данные об его устройстве в соединительной ткани скелета при изучении ряда патологических процессов, сопровождающихся отложением минеральных структур.
При этом сведения о влиянии клеток, матриксных везикул, коллагеновых и эластических структур, а также атероматозных масс на процесс минерализации в области атеросклеротического поражения требуют уточнения. Отрывочны данные о форме и размерах кристаллов минерала при атерокальцинозе. Нет информации об их пространственном распределении в обызвествлённой бляшке.
Применение в нашей работе комплекса методов исследования, охватывающего диапазон изучения минерала соединительной ткани от ультраструктур до тканевого уровня его организации, позволяет оценить морфологические особенности строения минерального компонента в матриксе кости и кальцифицирующихся хрящей, получить данные о взаимосвязи неорганической и органической составляющих межклеточного вещества разных видов соединительной ткани скелета, выявить общие закономерности строения минеральных отложений при физиологической и эктопической минерализации.
Для исследования были взяты костные фрагменты из переднебоковых зон тел I и II поясничных позвонков, а также включающие в свой состав минерализованную зону образцы хрящей VI и VII рёбер и фиброзного кольца межпозвоночных дисков между I и II поясничными позвонками. Материал был получен от трупов лиц, погибших от заболеваний, не связанных с костной и хрящевой патологией. Патологически изменённые кости и хрящи в исследование не включали.
Аутопсийный материал замораживали и хранили при температуре (-20С). Посмертный период составлял 5-15 часов. Разбивку материала на группы (зрелый (19-44 года) и старческий (75-89 лет) возраст) проводили в соответствии с возрастной периодизацией принятой для исследования твёрдых биологических тканей [27].
Кроме этого исследовали нижнебоковые зоны тел I-II поясничных позвонков, а также минерализованные зоны с прилежащими к ним участками в хрящах VI-VII рёбер и фиброзных кольцах межпозвоночных дисков между I и II поясничными позвонками у двух-трёхмесячных белых крыс. В отдельной серии экспериментов изучали VI-VII рёбра двух-трёхмесячных белых крыс и крышу черепа недельных крысят, так как на их поверхности чётко выражены сформированные, резорбирующиеся и формирующиеся участки. Для выявления костных клеток, а также этапов процесса минерализации костного матрикса, исследовали крышу черепа недельных крысят. Животных брали из вивария НИЦ БМТ ВИЛАР. Забой производили с помощью паров эфира. Посмертный период составлял 10-30 минут.
Минеральный компонент в области контакта структур территориального и интертерриториального матрикса
Наименьшими структурами минерального компонента гиалинового хряща являются кристаллы и формируемые ими копланарные объединения, представляющие собой пластинки неправильной формы с хорошо различимыми границами (рис. 23). Такие минеральные частицы входят в состав всех неорганических образований матрикса.
Размеры кристаллов и их копланарных объединений в гиалиновом хряще приведены в таблице 3. Отмечено, что линейные параметры кристаллов не отличаются от таковых в пластинчатой кости, а длина и ширина их копланарных объединений больше в гиалиновом хряще при не имеющих отличий значениях толщины.
Минеральные структуры однотипны в территориальном и интертерриториальном матриксе, что позволяет рассматривать их во всём объёме обызвествлённого межклеточного вещества. Так, выделены многочисленные минерализованные везикулы матрикса, обызвествлённые коллагеновые фибриллы, а также расположенное между ними кальцифицированное основное вещество.
Обызвествлённые матриксные везикулы имеют диаметр, колеблющийся в широких пределах: 99-351 нм. Везикулярный минеральный компонент определяется в виде минеральных частиц, которые располагаются во внутренних отделах везикулы под разными углами по отношению друг к другу, достаточно равномерно заполняя её объём. За пределы везикулы выступает лишь небольшая часть объединений кристаллов, что обусловливает существование хорошо выраженной границы между кальцифицированной везикулой и минеральными структурами окружающего её матрикса (рис. 24).
Расположенные в толще обызвествлённого матрикса везикулы со всех сторон окружены кальцифицированными коллагеновыми фибриллами и участками минерализованного основного вещества межфибриллярных промежутков. При этом внутрифибриллярный и межфибриллярный пулы кристаллов контактируют с везикулярным минералом.
После обызвествления коллагеновых фибрилл (диаметр поперечного сечения 20-40 нм) минеральный компонент в них имеет вид 3-5 параллельных пластов. Такие пласты располагаются под углом 10-21 по отношению к длинным осям фибрилл (рис. 25).
Обызвествлённые коллагеновые фибриллы окружены циркулярно расположенными минеральными частицами. Последние формируют околофибриллярные минеральные манжетки (рис. 26).
В центральных отделах межфибриллярных промежутков располагаются плотные группы из частиц минерала. В таких группах минеральные частицы размещены в стопках, контактируя между собой. Стопки частиц могут быть расположены как в одной плоскости, так и под разными углами по отношению друг к другу (рис. 27). Везикулярный, внутрифибриллярный и локализованный в основном веществе пулы кристаллов и их объединений входят в состав конгломератов, диаметр которых составляет 153-1250 нм. Последние сливаются между собой посредством образования переходных кальцифицированных участков. Такие участки формируются при продолжающемся обызвествлении коллагеновых фибрилл и окружающего их основного вещества. Фибриллы, в таких переходных участках могут частично находиться в толще конгломератов, но могут и прилежать к их поверхности (рис. 28). В ряде мест граница между отдельными конгломератами плохо различима. Располагающиеся между ними минеральные частицы, сглаживают их очертания и делают структуру хрящевого минерала более гомогенной (рис. 29).
В результате соединения конгломератов друг с другом формируются калькосфериты, диаметр которых колеблется в пределах 0,9-3,3 мкм. Конгломераты в них плотно прилежат друг к другу. Из-за различного количества конгломератов, локализованных в разных участках калькосферитов, форма последних не всегда представляет собой правильную сферу (рис. 30).
Калькосфериты формируют кальцифицированную зону хряща. В толще территориального и интертерриториального матрикса они соединяются между собой посредством располагающихся между ними конгломератов. Однако, в местах контактов таких конгломератов меньше, чем во внутренних отделах калькосферитов, что иногда делает возможным определение границ последних в полностью обызвествлённом хряще (рис. 31).
Размещение конгломератов и калькосферитов в территориальном и интертерриториальном матриксе различно. Так, в территориальном матриксе на их основе формируется минерализованная стенка лакуны хондроцита. При этом составляющие её минеральные структуры плотно прилежат друг к другу. В интертерриториальном матриксе конгломераты и калькосфериты расположены более рыхло (рис. 32).
