Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Эколого-биотехнологические проблемы биоконверсии растительного сырья (Обзор литературы) 22
1.1. Ресурсы растительной биомассы, характеристика ее основных компонентов и методов предварительной обработки 22
1.1.1. Состав и источники биомассы 22
1.1.2. Общая характеристика основных компонентов растительной биомассы 32
1.1.3. Предварительная обработка растительных субстратов 49
1.2. Микробиологическая деградация целлюлозы 64
1.2.1. Механизмы микробной деградации целлюлозы 66
1.2.2. Целлюлазные системы грибов 69
1.2.3 Молекулярные механизмы действия целлюлаз 76
1.3. Биодеградация лигнина 88
1.3.1 Ферменты лигниназной системы 92
1.3.2. Деструкция грибами лигноцеллюлозных субстратов 108
CLASS Глава 2. Обьекты и методы исследовани CLASS й 117
2.1 Микроорганизмы для биотехнологических процессов перера ботки растительных субстратов 117
2.2. Методы обработки, исследования химического состава расти тельных субстратов до и после воздействия на них грибов 127
2.3. Методы определения активности ферментов, изучения химического состава биомассы и продуктов биоконверсии 138
2.4 Ферментативный гидролиз растительных субстратов 148
Глава 3. Скрининг продуцентов целлюлолитических ферментов, изучение состава ферментных комплексов и активностей их компонен тов 162
3.1. Отбор природных штаммов- продуцентов целлюлаз 163
3.2. Морфологические и культуральные признаки Trichoderma longi-brachiatum 7-26 172
3.3. Подготовка посевного материала для глубинного культивирования Trichoderma longibrachiatum 177
3.4. Воздействие света на рост и синтез целлюлаз Trichoderma longibrachiatum 183
Глава 4. Биосинтез целлюлолитических ферментов в условиях глубинной ферментации 187
4.1. Влияние состава питательной среды на биосинтез целлюлаз при глубинном культивировании Trichoderma longibrachiatum 7-26 187
4.2. Оптимизация состава питательной среды методом математического планирования эксперимента 198
4.3.Морфологическая дифференциация мицелия Trichoderma longi
brachiatum в процессе глубинного культивирования 200
4.4. Зависимость образования целлюлолитических ферментов от условий культивирования Trichoderma longibrachiatum 209
4.5. Получение препаратов целлюлазы различной степени очистки и их характеристика 213
4.6. Применение препарата целлюлазы для гидролиза свекловичного жома 220
Глава 5. Энзиматическая конверсия растительного сырья и способы ее интенсификации 223
5.1. Интенсификация энзиматической конверсии компонентов древесины с использованием процессов их предварительного разделения в водно- органических системах 225
5.2. Использование водных гидролизатов гемицеллюлоз древесины березы, полученных в результате водно-бутанольной делигнификации для выращивания дрожжей 232
5.3. Применение окислительно-щелочной обработки растительных субстратов для повышения эффективности ферментативного гидролиза полисахаридов 235
5.4. Ферментативный гидролиз древесины ивы (Salix caprea) пре-добработанной паровым взрывом 241
5.5. Использование труднометаболизируемых продуктов ферментативного гидролиза для выращивания Trichoderma longibrachiatum 264
Глава 6. Биодеградация лигнинсодержащих субстратов 277
6.1. Воздействие грибных культур на лигноуглеводный комплексдревесины 277
6.2. Использование гидрофобизирующей кремнийорганической композиции в качестве средства защиты древесины 284
6.3 Воздействие грибов рода Pleurotus на лигнин лиственных пород древесины 292
6.4. Деградация щелочного лигнина мицелиальными грибами 307
6.5. К вопросу о микробиологической деградации фенольных соединений 311
6.6 Роль микробных ассоциаций в деградации лигнинсодержащих субстратов 324
6.7. Слияние протопластов как способ повышения эффективности деградации лигноцеллюлозных материалов 332
Глава 7. Биотехнологическая переработка пожнивных остатков 340
7.1 Способы получения кормовой биомассы на лигноцеллюлозных субстратах 343
7.2 Биоконверсия лигноцеллюлозного субстрата смешанными культурами 352
7.3 Конверсия пшеничной соломы с предварительной ферментацией 356
7.4 Биосол- продукт биологической конверсии пшеничной соломы 359
7.5 Изучение возможности использования микробного каротина для получения высококачественных кормовых препаратов 363
Выводы 367
Список литературы 372
Приложения 429
- Общая характеристика основных компонентов растительной биомассы
- Методы определения активности ферментов, изучения химического состава биомассы и продуктов биоконверсии
- Подготовка посевного материала для глубинного культивирования Trichoderma longibrachiatum
- Оптимизация состава питательной среды методом математического планирования эксперимента
Общая характеристика основных компонентов растительной биомассы
Растительное сырье как биологический объект имеет сложное анатомическое строение и химический состав. Большая часть растительных отходов состоит, главным образом из клеточных стенок растений, которые защищают протопласт от неблагоприятных внешних воздействий, регулируют водообмен и поступление питательных веществ в клетку, являются опорой, скелетом растительных клеток. Клеточная стенка включает тонкий внутренний слой, называемой третичной стенкой, вторичную стенку, придающую клетке прочность, жесткость и первичную стенку. Первичной называют стенку эмбриональных клеток и клеток, растущих растяжением. Возникшие из меристемы в результате митоза дочерние клетки, вначале разделены срединной пластинкой, которая является матриксом будущей клеточной стенки и в период роста клетки преимущественно состоит из пектиновых веществ. После прекращения роста клетки на первичную клеточную стенку изнутри откладываются, новые слои вещества и формируется вторичная клеточная стенка, которая выполняет главным образом опорную функцию (Беликов, Дмитриева, 1992). Оболочки клеток с внутренним утолщением часто подвергаются одревеснению, что особенно характерно для клеток древесины, которые после прекращения синтеза оболочки отмирают. В клетках древесины с достаточно развитой вторичной оболочкой можно различить три слоя, различных по мощности, химическому составу и физическим свойствам: наружный (8і)-узкий слой, непосредственно прилегающий к первичной оболочке, средний (S2)-наиболее мощный и внутренний (S3) - узкий слой (Леонович, Оболенская, 1988).
Основными химическими компонентами, входящими в состав клеточной стенки являются органические вещества, и лишь небольшую часть составляют минеральные вещества, которые при сжигании образуют золу. Органиче 33 ские компоненты клеточной стенки условно подразделяют на: структурные, представленные целлюлозой; компоненты матрикса стенки - гемицеллюлозы, пектиновые вещества, белки, липиды; инкрустирующие клеточную стенку -лигнин, суберин и компоненты, откладывающиеся на ее поверхности (адкру-стирующие) - воска, кутин (Беликов, Дмитриева, 1992).
Целлюлоза является самым распространенным веществом на Земле. Ежегодно за счет фотосинтеза образуется до 100 млрд. тонн целлюлозы. Содержание целлюлозы в первичной клеточной стенке составляет 30% (Кислухина, Кюдулас,1997). Целлюлозные фибриллы короткие, образуют в пектиновом матриксе рыхлую сеть, и первичная клеточная стенка хорошо растягивается, проницаема для воды и веществ. Во вторичной оболочке содержание целлюлозы составляет обычно более 60 % от массы сухого вещества, ее молекулы длинные и формируют микрофибриллы преимущественно с параллельной ориентацией. Строго упорядоченная ориентация определяет высокие механические свойства вторичных оболочек. В неодревесневщих вторичных стенках (лубяные волокна льна, волоски хлопчатника) на долю целлюлозы приходится 95%.(Родионова,1989; Беликов, Дмитриева, 1992).
Состав третичной клеточной стенки растений представлен целлюлозой, гемицеллюлозами и инкрустирующими веществами. Микрофибриллы целлюлозы в ней располагаются под углом друг к другу (Закис и др., 1972).
В период одревеснения откладывается лигнин, который является основным компонентом срединной пластинки, но его большая часть с учетом распределения слоев клеточной стенки по массе содержится во вторичной клеточной стенке, где он ковалентно связан с гемицеллюлозой. Включение лигнина сопровождается увеличением прочности, уменьшением растяжимости клеточной стенки и плохой ее перевариваемостью (Kirk, Schimada,1985). Целлюлоза характеризуется повышенной скелетной жесткостью и прочностью. Это высокомолекулярный полисахарид, макромолекулы которого построены из звеньев P-D-ангидроглюкопиранозы, соединенных Р глюкозид-ными связями 1-4 (Никитин и др., 1978). Благодаря тому, что гидроксильные группы у первого и четвертого атомов глюкозы отличаются расположением относительно плоскости кольца, соседние остатки глюкозы в полимерной цепи оказываются повернутыми по отношению друг к другу на 180. Полимерные цепи стабилизируются за счет водородных связей, образующихся между остатками глюкозы при взаимодействии гидроксильных групп при 6,2,3 углеродных атомов и кислорода кольца (рис.3) В результате таких взаимодействий формируются прочные волокна (Байклз, Сегал,1974).
Методы определения активности ферментов, изучения химического состава биомассы и продуктов биоконверсии
биоконверсии Активность ферментов определяли в бесклеточных фильтратах культур и в ферментных препаратах и использованием следующих методов.
Методы определения активности ферментов, катализирующих разложение полисахаридов растительного сырья
Активность целлюлаз (АФБ активность) оценивали по гидролизу фильтровальной бумаги. Метод рекомендован Международной Комиссией ИЮПАК по биотехнологии в качестве стандартного теста на целлюлазную активность и основан на регистрации редуцирующих Сахаров, образующихся при действии целлюлазного комплекса на хроматографическую бумагу Watman 1 (Ghose,1987; Синицын и др., 1990).
Реакционная смесь содержала полоски 1x6 см хроматографической бумаги весом 50 мг каждая, 1 мл ацетатного буфера рН 4,5 и 1 мл соответственно разведенного ферментного препарата или бесклеточного фильтрата культуры. Реакционную смесь помещали на 1 час в термостат при 50С. Так как в ферментном растворе могут содержаться редуцирующие вещества, параллельно готовили контрольную смесь без субстрата. После термостатиро-вания количество восстанавливающих Сахаров определяли методом Шомоди - Нельсона и с использованием динитросалицилового реагента. Активность рассчитывали по формуле:
A=A[G1]- 1000/ г 180-Е, где 180- молекулярная масса глюкозы; Е - концентрация фермента в реакционной смеси, мл; т -время инкубирования, мин; A[G1] - изменение концентрации глюкозы при ферментативном гидролизе субстрата за время т, г/л. Величина A[G1 определяется из сравнения полученного в эксперименте значения оптической плотности с предварительно построенным калибровочным графиком, отражающим зависимость: оптическая плотность = f (концентрация глюкозы). Линейный участок зависимости лежит в пределах 0,01- 5 г/л глюкозы.
Эндоглюканазную активность определяли вискозиметрическим методом по начальной скорости гидролиза КМЦ - карбоксиметилцеллюлозы (Рабинович и др., 1977). Для приготовления раствора КМЦ 400 мг препарата (Sigma С-4000 средней вязкости) растворяли в 100 мл ацетатного буфера на магнитной мешалке, рН буфера определялся целями эксперимента. Исходный раствор КМЦ хранили в холодильнике при +5С. Растворы КМЦ нужной концентрации готовили путем разбавления исходного раствора тем же буфером. Для определения активности использовали вискозиметр Оствальда с объемом шарика 1 мл и диаметром капилляра 0,6 мм. Объем раствора КМЦ в вискозиметре составлял 3 мл. Кинетика ферментативного процесса определялась по изменению скорости истечения раствора из шарика в течение реакции. Концентрация фермента подбиралась таким образом, чтобы за 5 мин. реакции изменение времени истечения раствора не превышало 10-13 сек.
Для расчета относительной эндоглюканазной активности была использована следующая формула:
А= (x0t)/(txTo))xE где т0 - время истечения раствора КМЦ, с; xt - время истечения реакционной смеси (с) через t минут после добавления фермента; Е - концентрация ферментного раствора, выражаемая мл/л. Для каждого образца определено как минимум по 3 т0.
Активность КМЦ- азы определяли по способности фермента гидролизо-вать КМЦ (Синицын и др., 1990). Реакционная смесь: 1% раствор КМЦ в 0,1 М ацетатном буфере рН 4,5; ферментный препарат или бесклеточный фильтрат культуры. За единицу активности принимали количество фермента. Необходимое для образования 1 мкмоль редуцирующих Сахаров в минуту при 40С. Активность рассчитывали по формуле, приведенной для общей целлю-лазной активности.
Активность целлобиазы определяли по способности фермента гидроли-зовать целлобиозу (Синицын и др., 1990). Реакционная смесь включала: 2 мМ раствор целлобиозы в 0,1 М ацетатном буфере рН 4,5; ферментный препарат или бесклеточный фильтрат культуры. За единицу активности принимали количество фермента, необходимое для образования 2 мкмоль в минуту при 40С.
Количество глюкозы определяли глюкозооксидазно-пероксидазным методом (Березин и др., 1977). Для выявления активности использовали глюкозооксидазу отечественного производства (активность 380 тыс.ед/г); перокси-дазу хрена (350 тыс ед/г), производства Венгрия; глюкозу ( марки х.ч. « Реа-хим»); О - дианизидин ( марка ч «Реахим»). Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре СФ-16 при длине волны 460 нм.
Активность ксиланазы определяли по содержанию редуцирующих веществ, образующихся при гидролизе ксилана из березы. Реакционная смесь содержала: ксилан; 0,1 М ацетатный буфер рН 5,4; ферментный раствор. Гидролиз проводили при 40 С в течение часа. Количество редуцирующих веществ определяли по методу Шомоди - Нельсона.
Подготовка посевного материала для глубинного культивирования Trichoderma longibrachiatum
Весьма важным вопросом при работе с продуцентами, как с теоретической, так и с практической точки зрения, является сохранение в течение многочисленных циклов культивирования их таксономических свойств и физиологической активности, т.е. способности синтезировать высокоактивные цел-люлолитические ферменты.
Известно, что продуктивность штаммов изменяется в зависимости от качества питательной среды, используемой для поддержания жизнеспособности культуры и частоты пересевов (Сизова, 1949; Ген дина, Селищен-ко,1967; Исмаилова и др.,1974).
В этой связи были проведены исследования, которые заключались в изучении изменения продуктивности Trichoderma longibrachiatum в процессе хранения и подборе оптимальных условий подготовки и консервации посевного материала.
Культуру Trichoderma longibrachiatum в активном состоянии поддерживали на агаризованных средах Чапека - Докса, сусло- агар, Роулен - Тома с кукурузным экстрактом; на средах с ферментированным картофелем и фильтровальной бумагой с экстрактом пшеничных отрубей.
Инокуляцию сред осуществляли спорами. После инкубирования в течение 7-10 суток при 28С культуру хранили при температуре 0- 4С. Пересев осуществляли один раз в 3 месяца.
Для определения влияния состава питательной среды на продуцирующую способность культуры проводили одновременный высев, хранившейся на разных средах культуры на жидкую питательную среду со свекловичным жомом. Культивирование Trichoderma longibrachiatum в глубинных условиях показало, что наиболее благоприятной для поддержания жизнеспособности культуры и синтеза, внеклеточных целлюлаз является среда с ферментированным картофелем (рис.36).
Целлюлазная активность Trichoderma longibrachiatum в зависимости от состава питательной среды, используемой для поддержания жизнеспособности. 1- среда с ферментированным картофелем; 2- среда с фильтровальной бумагой; 3 - среда Роулен-Тома с кукурузным экстрактом; 4-среда Чапека-Докса; 5 - среда сусло-агар.
Однако использование картофеля разного урожая и сорта приводит к появлению колоний, отличающихся по интенсивности роста и активности эк-зоферментов. Поэтому для поддержания культуры использовали среду с фильтровальной бумагой, где вместо отвара отрубей использовали свекловичный жом 0,2 % на жидких средах с которым, как отмечалось, ранее наблюдалась наиболее высокая активность (см. рис.32).
При использовании среды на основе фильтровальной бумаги с добавлением свекловичного жома целлюлолитическая активность по фильтровальной бумаге в среднем составляет 8,55 ед/мл, необходимо подчеркнуть то обстоятельство, что при пересевах на среду данного состава популяция Trichoderma longibrachiatum сохраняет стабильную активность и характеризуется однородным составом вариантов по морфологическим и культураль-ным признакам.
Многолетние исследования роста и синтеза ферментов Trichoderma longibrachiatum показали, что культуру следует пересевать не чаще, чем через 2-3 месяца. Необходимо отметить то обстоятельство, что споры на среде с фильтровальной бумагой оставались жизнеспособными и после 4 лет хранения. За этот срок агаризованная среда высыхала, но при внесении спор в пробирки со свежей средой, рост возобновлялся. Культура при этом сохраняла полностью свои культурально-морфологические свойства и способность образовывать целлюлазы. Однако, такой способ хранения предусматривает восстановление роста через 2-3 кратное культивирование на свежей среде, поэтому в целях постоянной доступности культуры периодичность пересевов не должна превышать 3-6 месяцев. 3.3.1. Влияние вида посевного материала, дозы и способа длительного хранения на целлюлолитическую активность гриба Trichoderma longibrachiatum
При производстве ферментных препаратов и переработке растительных отходов возникает необходимость в качественном посевном материале и в подборе эффективных методов длительного сохранения ценных свойств продуцента.
Для засева питательных сред при выращивании грибов-продуцентов ферментов применяют споровый и мицелиальный посевной материал (Бекер и др., 1990). Качество и вид посевного материала, используемого для засева питательной среды при ферментации, оказывает существенное влияние на продуктивность процесса.
Проверку продуктивности Trichoderma longibrachiatum 7-26 в зависимости от вида и дозы посевного материала проводили с использованием мицелия в возрасте 12-48 часов и спорового посевного материала с титром спор 3x10 -2x10 . Мицелиальный посевной материал получали выращиванием спор на жидком сусле, разведенном водопроводной водой 1:1. В ходе проведения исследований было установлено, что максимальная активность по фильтровальной бумаге наблюдается при засеве питательной среды с жомом 12ч часовым мицелием. Микроскопический контроль культуры свидетельст 180 вовал о начале ветвления мицелия. Инокулят в возрасте 12 ч содержал мало биомассы, это затягивало развитие культуры и для достижения максимальной активности требовалось его большая доза (8-10%). Применение суточного инокулята, содержащего 3,5-4,0 мг/мл биомассы, позволяет получить высокий уровень активности при дозе засева питательной среды-2% (рис.37)
Оптимизация состава питательной среды методом математического планирования эксперимента
Оптимизацию состава питательной среды проводили по результатам реализации плана дробного факторного эксперимента (ДФЭ), позволяющего в значительной степени снизить трудоемкость работы, по сравнению с полным факторным экспериментом (ПФЭ).
Был составлен план ДФЭ 4 \ где в качестве факторов варьирования использовали: свекловичный жом - 1 фактор, азотнокислый аммоний - 2 фактор, калий фосфорнокислый однозамещенный - 3 фактор, пшеничные отруби и солодовые отростки отношении 1:1-4 фактор. Культивирование проводили на качалке (п=180-200 об/мин) при 28 в колбах емкостью 750 мл. со 100мл питательной среды.
План ДФЭ и средние результаты, полученные при реализации этого плана, представлены в табл.10.
Анализ уравнений по критерию Фишера показал, что они адекватно с уравнением значимости 0,05 описывают процесс и могут служить основой для расчета программы оптимизации (Грачев, 1979).
Проведенные дополнительные опыты показали, что не значимость коэффициентов Х2 и Х3 объясняется тем, что концентрация этих компонентов в центре эксперимента соответствует их оптимальному (или почти оптимальному) содержанию в среде.
Программу оптимизации рассчитывали по методу Бокса- Уилсона, сущность которого заключается в том, что на основе, анализа уравнения регрессии составляются условия серии опытов с различными значениями факторов. При этом каждое последующее изменение значения факторов обеспечивает в соответствии с уровнем регрессии повышение эффективности процесса, проявляющегося в увеличении синтеза ферментов (Грачев, 1979). Программу рассчитывали от центральной точки эксперимента и от условий опыта, давшего наилучший выход (табл.11).
Из таблицы видно, что наиболее высокий уровень активности наблюдается в опыте 8і
Таким образом, в результате реализации программы оптимизации получили среду следующего состава: свекловичный жом -4,65 %; азотнокислый аммоний -0,70%, калий фосфорнокислый однозамещенный -0,20%; пшеничные отруби и солодовые ростки в соотношении 1:1 - 0,75%.
При культивировании гриба Trichoderma longibrachiatum 7-26 на данной среде активность целлюлолитических ферментов в 1,5 раза выше первоначальной. Увеличение продуцирующей способности культуры при использовании комплексной питательной среды, содержащей несколько растительных субстратов, очевидно связано с перераспределением использования их компонентов на рост и синтез ферментов.
Важнейшим показателем реакции культур микроорганизмов на условия существования является их морфоцитологическое состояние. У многих микроорганизмов механизмы адаптации к условиям среды реализуются посред 201 ством образования особых морфологических форм, которые способствуют их выживанию.
Морфоцитологические особенности продуцентов ферментов в значительной степени зависят от контакта с химическими компонентами питательной среды, используемой для их выращивания. Ранее нами было отмечено, что при глубинном культивировании Trichoderma longibrachiatum 7-26 на средах с сульфитной целлюлозой формируется мицелий, гифы которого длинные и тонкие. Увеличение длины клеток приводит к увеличению отношения поверхности к объему, что способствует тесному контакту с субстратом и его лучшему усвоению. Следовательно, между биосинтезом ферментов, степенью усвоения субстрата и структурой клеток существует определенная взаимосвязь. С изменением активности ферментов и транспорта компонентов среды в клетки меняется и их структура. Последняя может быть показателем физиологической активности клеток.
По многочисленным наблюдениям исследователей, активный синтез целлюлаз отмечается на средах с целлюлозой. Использование растворимых легкоусваиваемых источников углерода обычно способствует активному росту биомассы и незначительной активности ферментов. Однако, среды, содержащие твердые частицы не удобны из-за неоднородности питательной среда для глубинного культивирования.
В этой связи влияние растворимых и нерастворимых источников углерода на развитие культуры и биосинтез ферментов исследовали, используя оптимизированную нами питательную среду, содержащую нерастворимый компонент - свекловичный жом и среду этого же состава без твердой фазы. Твердую фазу из оптимизированной среды удаляли фильтрованием после стерилизации. Жидкую, богатую пектиновыми веществами и сахарами фракцию после последующей стерилизации использовали для культивирования. Культивирование Trichoderma longibrachiatum 7-26 осуществляли в колбах на качалке (п =180 об/мин) на оптимизированной среде с свекловичным жомом (среда А) и питательной среде Б с растворимыми компонентами среды А. Засев питательной среды производили водной суспензией конидий. В связи с тем, что при культивировании гриба на питательных средах с целлюлозосо-держащим субстратом мицелий прочно к нему прикрепляется, и отделить его без потерь не представляется возможным, для определения биомассы на среде с нерастворимым источником углерода использовали косвенный метод оценки по концентрации ДНК. Содержание ДНК определяли в биомассе, полученной после культивирования на оптимизированной среде лишенной твердой фазы. Экспериментально было установлено, что в среднем 1 мг абсолютно сухого мицелия гриба Trichoderma longibrachiatum 7-26, содержит 1,267 мкг ДНК. Это соотношение использовали при определении биомассы на оптимизированной среде.
Исследование кинетики роста и синтеза целлюлазы Trichoderma longibrachiatum 7-26 показало, что максимум синтеза целлюлаз отмечается в постэкспоненциальную фазу роста гриба. Максимальная скорость роста, равная 0,10 ч" на среде Б наблюдается на 36 ч культивирования (рис.46).
