Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Современные аспекты синэкологии симбиотических микроорганизмов толстой кишки человека и принципы коррекции микробиоты с помощью препаратов из штаммов-симбионтов 16
1.1. Видовая структура биотических сообществ 16
1.2. Симбиотические сообщества как объекты биоэкологических исследований 20
1.3. Роль микробиоты в процессе жизнедеятельности макроорганизма 24
1.4. Структурная организация микробиоценоза пищеварительного тракта 30
1.5. Функции нормальной микрофлоры пищеварительного тракта 33
1.6. Формирование микрофлоры у детей 35
1.7. Качественный и количественный состав нормальной микрофлоры ЖКТ 38
1.8. Дисбиоз кишечника 44
1.9. Средства коррекции микрофлоры 48
1.10. Молекулярно-биологические методы для индикации, идентификации пробиотических микроорганизмов и типирования промышленно-значимых штаммов 55
1.11. Современные принципы коррекции дисбиозов различных биотопов организма человека 62
Собственные исследования
Глава 2. Материалы и методы исследований 65
2.1. Дизайн исследования 65
2.2. Объем экспериментальных данных 66
2.3. Методы изучения видового состава и численности симбиотических микроорганизмов 69
2.3.1. Классические микробиологические методы 70
2.3.2. Методика молекулярно-генетического анализа 86
2.3.3. Метод экспертных оценок 89
2.3.4. Клинические методы исследований, использованные в работе для оценки эффективности пробиотиков 90
2.3.5. Методы статистического анализа 91
2.3.6. Методы ранговых распеределений 92
2.3.7. Методы экологического анализа 92
Глава 3. Синэкологический анализ симбиотичнской микробиоты толстой кишки людей разных возрастных групп 94
3.1. Выбор параметров оценки состояния микробиоценоза толстой кишки 95
3.2. Особенности возрастной динамики численности симбиотических микроорганизмов толстой кишки «здоровых» людей 103
3.2.1. Характеристика микрофлоры просвета толстой кишки «здоровых» детей 103
3.2.2. Характеристика микрофлоры просвета толстой кишки «здоровых» взрослых 120
3.3. Особенности возрастной динамики численности симбиотических микроорганизмов толстой кишки «больных» людей 130
3.4. Сравнение возрастной динамики численности симбиотических микроорганизмов толстой кишки «здоровых» и «больных» людей 134
3.4.1. Сравнительная характеристика микрофлоры просвета толстой кишки «здоровых» и «больных» детей 134
3.4.2. Сравнительная характеристика микрофлоры просвета толстой кишки «здоровых» и «больных» взрослых 154
3.5. Синэкологический анализ микробиоценозов толстой кишки «здоровых» и «больных» людей разных возрастных групп 166
3.5.1. Анализ ранговых распределений 167
3.5.2. Результаты кластеризации исходного массива данных бактериологических исследований 186
3.5.3. Результаты статистического анализа с использованием критериев Манна-Уитни и Краскала-Уоллиса 190
3.5.4. Анализ видового разнообразия 194
Глава 4. Теоретические и экспериментальные основы отбора производственных штаммов-продуцентов пробиотиков 202
4.1. Изучение биологических свойств штаммов-продуцентов пробиотиков 203
4.1.1. Определение антагонистической активности пробиотических штаммов лактобацилл 203
4.1.2. Изучение биосовместимости штаммов лактобацилл и бифидобактерий 211
4.1.3. Определение антагонистической активности лактобацилл к грибам рода Candida 221
4.1.4. Изучение выживаемости молочнокислых бактерий в кислой среде 223
4.1.5. Характеристика антибиотикорезистентности стартерных культур пробиотиков 224
4.2. Молекулярно-генетическая идентификация штаммов-продуцентов. 232
4.2.1. Разработка методики индикации бактерий рода Lactobacillus и Bifidobacterium на основе ПЦР гена 16S рРНК 233
4.2.2. Разработка методики видовой идентификации лактобацилл с использованием гнездового варианта ПЦР 241
4.2.3. Изучение динамики роста лактобацилл в аксеничной и смешанной культуре 245
4.2.4. Разработка алгоритма контроля динамики культивирования лактобацилл в смешанной культуре методом ПЦР 249
Глава 5. Конструирование новых жидких пробиотиков как средств коррекции микробной экосистемы человека 259
5.1. Конструирование и разработка технологии производства жидкого бактериального концентрата на основе лактобацилл «LL-комплекс» 261
5.2. Конструирование и разработка технологии производства пробиотика в форме БАД к пище на основе лакто-и бифидобактерий «LB-комплекс» 266
5.3. Конструирование и разработка технологии производства жидкого бактериального концентрата на основе лакто-и бифидобактерий «LB-комплекс S» 275 Глава 6. Бактериологическая и клиническая эффективность созданных жидких пробиотиков 281
6.1. Изучение эффективности включения синбиотика «LL-комплекс» в схемы лечения гастродуоденальной и аллергологической патологии у детей 281
6.2. Изучение эффективности включения синбиотика «LL-комплекс» в программы лечения воспалительных заболеваний органов малого таза (ВЗОМТ), осложненных кандидозом 285
6.3. Анализ результатов использования нового симбиотика «LB-комплекс» в лечебных программах выхаживания недоношенных новорожденных в педиатрическом стационаре 291
6.4. Эффективность включения пробиотиков «LB-комплекс» и «LL-комплекс» в программы оздоровления беременных женщин и детей на территории Г.Н.Новгорода 295
6.5. Эффективность использования пробиотика «LB-комплекс» в системе оздоровительно-реабилитационных мероприятий вДОУ 301
6.6. Оценка эффективности использования БАД к пище «LB-комплекс» в схемах антихеликобактерной терапии 304
6.7. Изучение эффективности включения симбиотика «LB-комплекс S» в алгоритм лечения туберкулезной инфекции у детей 314
6.8. Изучение эффективности использования симбиотика «LB-комплекс S» в программе оздоровления студентов старших курсов медицинского ВУЗа 320
Глава 7. Разработка алгоритма комплексной коррекции дисбиозной микробиоты желудочно-кишечного и репродуктивного тракта человека 325
Заключение 332
Выводы 338
Список цитированной литературы 341
- Роль микробиоты в процессе жизнедеятельности макроорганизма
- Клинические методы исследований, использованные в работе для оценки эффективности пробиотиков
- Особенности возрастной динамики численности симбиотических микроорганизмов толстой кишки «больных» людей
- Разработка методики видовой идентификации лактобацилл с использованием гнездового варианта ПЦР
Введение к работе
Актуальность работы. Изучение микробной эндоэкологии человека (микроэкологии) относится к одному из наиболее актуальных направлений прикладных и фундаментальных исследований в области экологии, биологии, и медицины. Это связано с важной ролью, которую играет микробиота в жизнедеятельности макроорганизма, а также с повсеместно наблюдаемыми изменениями экологии микроорганизмов, повлекшими нарастание удельного веса заболеваний, вызываемых микробами-оппортунистами. В связи с этим большой интерес представляет изучение видового разнообразия и структуры сообщества симбиотических микроорганизмов человека. В организме человека наибольшим видовым богатством характеризуется микробное сообщество толстой кишки. Известно, что нет ни одной функции макроорганизма, на которую прямо или косвенно не влиял бы микробиоценоз этого биотопа (Ткаченко, 2009).
Следует отметить, что, несмотря на большое количество работ, посвященных микробиоценозам кишечника, изучением качественного и количественного состава микрофлоры толстой кишки у «здоровых» людей разных возрастных групп занималось не так много исследователей, а выбранные группы «здоровых» были довольно малочисленны. Это обусловлено тем, что понятие «здоровье» не имеет четкого определения и носит, скорее, философский характер, в связи с чем затруднительно формировать группы «действительно здоровых» людей для определения «нормальных» показателей микрофлоры. Фактически это десять крупных исследований (Перетц, 1955; Геймберг, 1964; Гончарова, Вилыпанская, 1968; Ленцнер, 1968; Haenel, 1970; Марко, 1970; Лизько, 1970; Куваева,1976; Эпштейн-Литвак, Вилыпанская, 1977; Козлова, 1978). В большое количество монографий по этой тематике, выпущенных в последние годы, включены результаты именно этих исследований, они же обобщены в ОСТ 91500.11.0004-2003 «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника». Другой аспект этой темы сводится к частным вопросам: частоте обнаружения того или иного вида микроорганизмов в микробиоте, изучению микрофлоры определенных возрастных групп при различной патологии и т.п. В этих исследованиях за показатели «нормы» до сих пор принимают данные 50-70гг. прошлого века.
В настоящее время появились новые доступные высокотехнологичные методы исследований, позволяющие более подробно изучать видовую структуру симбиотических сообществ микробиоты организма человека. Современные информационные технологии дают возможность структурировать обширные базы данных, оценивать как множество единичных показателей, так и их совокупность в многомерном пространстве показателей, проводить статистический и экологический
анализ. В частности, экологический анализ успешно применен при изучении эндоэкологии симбиотических сообществ микробиоценоза миндалин человека (Бухарин и др., 2011). Однако масштабные исследования видовой структуры симбиотических сообществ микробиоценозов толстой кишки человека до настоящего времени не проводились. В связи с этим актуальным вопросом является изучение закономерностей, управляющих динамикой численности популяций микроорганизмов в составе микробиоты, ее пространственной и видовой структурой, изучение разнообразных типов межпопуляционных отношений, обеспечивающее образование сообществ как систем с относительно стабильным видовым составом. Понимание и теоретическое осмысление экологических закономерностей функционирования симбиотической микрофлоры является необходимой предпосылкой для развития и совершенствования способов влияния на ее формирование и нормализацию с помощью различных форм пробиотиков из представителей резидентной микрофлоры. Широкое распространение дисбиотических нарушений ставит на повестку дня важность разработки методов комплексной коррекции микробиоты, направленных не только на восстановление эволюционно обусловленных микробных популяций, но и обеспечивающих воздействие на макроорганизм в целом.
Цель работы: на основании изучения экологических закономерностей формирования сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки «здоровых» и «больных» людей разных возрастных групп, проживающих на территории крупного промышленного мегаполиса, создать новые пробиотики в форме бактериальных концентратов, восстанавливающие эволюционно обусловленную микробиоту человека. Задачи исследования:
-
Изучить видовую структуру сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки «здоровых» и «больных» людей разных возрастных групп (от периода новорожденное до старости), проживающих на территории города Нижнего Новгорода.
-
Провести выбор параметров оценки состояния микробиоценозов толстой кишки.
-
Создать базу данных результатов исследования качественного и количественного состава микрофлоры толстой кишки «больных» и «здоровых» людей разных возрастных групп, и систему управления базой данных для сбора, хранения, статистической обработки и графического представления данных.
-
На основе анализа результатов структурирования базы данных произвести отбор видов микроорганизмов, перспективных в качестве стартерных культур пробиотиков.
5. Изучить биологические и молекулярно-генетические свойства
микроорганизмов продуцентов пробиотиков с целью подбора производственно
перспективных штаммов.
6. Сконструировать новые пробиотики для коррекции микробиоты человека и
отработать технологии их производств.
7. Оценить эффективность введения новых пробиотиков в комплексы
профилактических, лечебно-оздоровительных и реабилитационных мероприятий у
разных возрастных групп населения с различными нозологическими формами
заболеваний, протекающих на фоне «дисбиозной» микробиоты.
8. Разработать алгоритмы комплексной коррекции микробиоты желудочно-
кишечного тракта разных возрастных групп населения.
Научная новизна. Впервые создана база данных результатов бактериологических исследований качественного и количественного состава микрофлоры толстой кишки «здоровых» и «больных» людей разных возрастных групп, проживающих на территории г. Нижнего Новгорода, и система управления базой данных, позволившая провести синэкологический анализ сообществ симбиотических микроорганизмов (Свидетельство о госрегистрации № 2011614233 РФ). Доказано, что в процессе формирования микрофлоры кишечника человека участвуют как аэробные, так и анаэробные микроорганизмы, причем в равных соотношениях с первого часа жизни, процесс нарастания анаэробной компоненты (представители родов Lactobacillus, Lactococcus и Bifidobacterium) идет параллельно с ростом условно-патогенных микроорганизмов и кишечной палочки, минуя стадию «трансформации». С наибольшей частотой 92% оппортунистические микроорганизмы в значимых количествах (> 105 КОЕ/г) выделяются в группе «здоровых» детей в возрасте от одного месяца до года. Частота обнаружения УПМ в микрофлоре толстой кишки здорового человека начинает снижаться после первого года жизни и составляет 18% в возрастной группе 60 лет и старше. Доказано, что общее количество симбиотических микроорганизмов различных видов, выделяемых из толстой кишки «здоровых» людей во всех возрастных группах, на один-два порядка выше, чем у больных (р<0,05), за исключением группы 60 лет и старше.
Впервые на основе гнездовой ПНР гена 16S рРНК разработана методика индикации и идентификации симбиотических видов бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium и алгоритм контроля динамики роста стартерных культур при совместном периодическом и непрерывном культивировании (патент РФ № 2375459, 2008).
Впервые выявлен феномен симбиоза по типу мутуализма двух штаммов L.
plantarum 8 RA-3 и L. fermentum 39, обуславливающий более высокую анти-микотическую активность штаммов, выращенных в совместной культуре, чем при монокультивированиии (Патент РФ №2280465, 2004).
В результате углубленного изучения биологических свойств штаммов-продуцентов впервые создан ряд гипоаллергенных жидких сим- и синбиотиков на основе гидролизатов белка: «LL-комплекс», «LB-комплекс» и «LB-комплекс S» (Патент РФ №2280465, 2004; патент РФ №2192269, 2000 г), причем микробный консорциум стартерных культур подобран с учетом хромосомно опосредованной резистентности отдельных штаммов к антибиотикам 14 фармакологических групп, наиболее часто используемых в клинической практике, что делает возможным применение пробиотиков на фоне антибактериальных препаратов в комплексной терапии различных нозологических форм заболеваний.
Впервые разработан алгоритм коррекции дисбиоза желудочно- кишечного и репродуктивного трактов человека, осложняющего течение основного заболевания. Сформулированы основные направления комплекса мероприятий, направленных на коррекцию нарушений видовой структуры и восстановление численности популяции симбиотической резидентной микрофлоры (патент РФ №2193398, 2002).
Научно-практическая значимость работы. В ходе выполнения работы получены новые знания о формировании симбиотической микробиоты желудочно-кишечного тракта человека, выявлены возрастные особенности качественного и количественного состава микрофлоры толстой кишки «здоровых» людей, проживающих на территории мегаполиса. Полученные данные о формировании и особенностях микрофлоры людей разных возрастных групп при различных функциональных состояниях могут быть использованы для коррекции существующих критериев оценки состояния микробиоценозов человека.
Результаты работы востребованы научными, учебными, лечебно-профилактическими учреждениями и организациями ме дико-биологического профиля. Полученные теоретические данные используются в учебном процессе на кафедре профилактической медицины ФПКВ ГБОУ ВПО «Нижегородской медицинской академии» Минздрава РФ в циклах усовершенствования и повышения квалификации врачей.
В результате изучения комплекса биологических и молекулярно-генетических свойств культур лакто- и бифидобактерий отобраны штаммы-продуценты пробиотиков и использованы в качестве стартерных культур во вновь разработанных жидких сим- и синбиотиках «LL-комплекс», «LB-комплекс», «LB-комплекс S». Разработаны технологии, оформлены пакеты нормативно-технической документации и создано производство. Алгоритм комплексной коррекции микробиоты с включением в качестве пробиотической составляющей диетотерапии новых жидких бактериальных концентратов используется в девяти лечебно-профилактических учреждениях г. Н.Новгорода в программах лечения больных с различными нозологическими формами заболеваний, осложненных дисбиозом.
Утверждены и используются на местном уровне методические рекомендации «Совершенствование санитарно-эпидемиологического надзора в акушерско-педиатрических стационарах с целью снижения младенческой заболеваемости», 1999г. и пособие для врачей «Использование бактериальных препаратов и продуктов лечебного питания», 2000 г.
Положения, выносимые на защиту:
1. В период постнатального онтогенеза здорового человека (0-60 лет) происходят
статистически значимые изменения видовой структуры микрофлоры толстой кишки,
характерные для определенных возрастных групп, требующие для правильной
оценки состояния микрофлоры подразделение каждой из крупных возрастных групп
(0-1 год и 1год - 60 лет по ОСТ 91500.11.0004-2003) минимум на 3 подгруппы: 24
часа - 6 суток, 7-29 суток, 1-11 месяцев и 1год - 6 лет, 7-17 лет, 18-60 лет.
2. В процессе формирования микрофлоры кишечника человека, начиная с
первого часа жизни, в равных соотношениях участвуют как аэробные (E.coli,
Enterococcus spp., УПМ семейств Staphylococcaceae, Enterobacteriaceae), так и
анаэробные микроорганизмы (Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp., L.lactis), минуя
стадию «трансформации».
-
С наибольшей частотой оппортунистические микроорганизмы в значимых количествах (> 105 КОЕ/г) выделяются у «здоровых» детей в возрастной группе 1-11 месяцев с последующим резким снижением в возрасте от года до 17 лет, с дальнейшим сохранением стабильно невысокой частоты выделения у взрослых.
-
Численность бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium, а также Е. coli, Enterococcus spp, S.epidremidis, S. aureus, Klebsiella spp., Citrobacter spp., Proteus spp., Enterobacter spp. относится к «информационно-значимым показателям», поскольку их численность статистически значимо различается у «здоровых» и «больных» людей одного возраста и между возрастными группами, что позволяет верифицировать классификационные решения по разделению пациентов на категории «здоровые» и «больные» с учетом возраста в многомерном пространстве показателей.
5. Видовая структура сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки человека, представленных фиксированным набором клинически значимых культивируемых видов, может быть описана в рамках экологического анализа при помощи канонических индексов и показателей экологического разнообразия, что свидетельствует о применимости положений современной теоретической экологии к характеристике микробиоценозов макроорганизма.
6. Выявлен феномен усиления антагонистической активности по отношению к
грибам вида С. albicans совместно выращенной композиции штаммов лактобацилл
L.plantarum 8RA-3 и L.fermentum 39 по сравнению с их аксеничными культурами.
7. Для контроля динамики роста стартерных культур при совместном
периодическом и непрерывном культивировании целесообразно использовать метод
индикации и идентификации симбиотических видов бактерий рода Lactobacillus и Bifidobacterium на основе гнездовой ПЦР гена 16S рРНК.
8. Высокая эффективность дополнения базовой терапии различных нозологических форм заболеваний, осложненных дисбиозами, новыми жидкими мультиштаммовыми пробиотиками из лакто- и бифидобактерий доказывает лидирующее значение последних в обеспечении образования сообществ как систем с относительно стабильным видовым составом у людей разного возраста.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертации доложены на всероссийской конференции с международным участием «Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека» (г. Москва, 1999); всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Гигиена детей и подростков на пороге третьего тысячелетия. Основные направления развития» (г. Москва, 1999); IV международном симпозиуме «Биологически активные добавки к пище: XXI век (г. Москва, 2000); международной конференции, посвященной памяти академика РАМН и АМТН И.Н.Блохиной (г. Москва, 2001); 1-м всероссийском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (г. Москва, 2002); XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», г. Москва, 19-23 апреля, 2004г.; Международной конференция «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы». Форум «Новые технологии. Экология и здоровье», г. Москва, 2-4 июня, 2004.; III съезде Всероссийского общества биотехнологов России, г. Москва, 25-27.10.2005.; 6-м съезде научного общества гастроэнтерологов России, г. Москва, 1-3 февраля 2006; 4-м съезде биотехнологов России, г. Пущине 5-7.12.2006; Международном конгрессе «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты», г. Санкт-Петербург, 15-18.05 2007; Международном форуме «Современные технологии на службе охраны здоровья россиян» в рамках выставки «Медицина+», г. Нижний Новгород, 27.04.2010; круглом столе в рамках конференции, посвященной долгожителям Грузии в Сендайском университете (г.Сендай, Япония), 24.07.2010; конференции Японского общества по молочнокислым бактериям (г.Сендай, Япония), 26-27.07.2010; кафедре микробиологии университета Киорин (Токио), 28.07.2010; международной конференции «Пробиотики и здоровье», г. Ереван, Армения, 05-07.10.2010; Международная конференция «Пробиотики и бактериофаги как альтернатива антибиотиков», Тбилиси, Грузия, 29.06.-04.07.2012; Научно-практический конгресс с международным участием «Актуальные вопросы детской гастроэнтерологии», Киев, 28-29 ноября 2012; XIV Международном медицинском форуме «Технологии профилактики - современный путь развития здравоохранения», Н.Новгород, 28-30 мая 2013.
По материалам диссертации опубликовано 53 работы, из них 28 в изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов, списка цитированной литературы и приложения. Диссертация иллюстрирована 123 рисунками и 63 таблицами. Основной текст изложен на 396 страницах. Библиографический указатель включает 373 источника литературы (282 отечественных и 91 иностранных).
Роль микробиоты в процессе жизнедеятельности макроорганизма
Одним из актуальных направлений экологических исследований в настоящее время является изучение видовой структуры биотических сообществ и закономерностей её организации. Видовая структура сообществ живых организмов включает в себя анализ числа видов (видовое богатство) и их относительных представленностей (видовое разнообразие) (Одум, 1986; Whittaker, 1970; Margalef, 1975). Видовое богатство - простая количественная характеристика сообщества, определяемая абсолютным или относительным числом видов. Видовое разнообразие можно определить как степень различия объектов в изучаемой совокупности. В разнообразии живого можно выделить эволюционное разнообразие, связанное с различием объектов биосферы в различные периоды ее существования; географическое разнообразие организмов в разных их местообитаниях на Земле; объединяющее первые два — таксономическое разнообразие биологических систематик и другие подходы к разнообразию (Мэгарран, 1992).
Более полное представление о сообществе дает учёт относительного обилия видов, для оценки которого в современной экологии используются различные индексы, называемые индексами видового разнообразия (Животовский, 1980; Shannon, 1948; Simpson, 1949; Pielou, 1966). Часто, при оценке такой характеристики сообщества как видовое разнообразие, возникают трудности, связанные со «сложностью и комплексностью самой интерпретируемой величины и отсутствием объективной шкалы отсчёта разнообразия» (Песенко, 1982). Что касается индексов оценки разнообразия, то отдельно, сами по себе, они обладают существенным недостатком, а именно: разные индексы предоставляют информацию об отдельных аспектах разнообразия, что объясняется различиями в чувствительности индексов к видам с определенной представленность (Sager, Hasler, 1969).
Для количественной оценки видовой структуры исследуемых сообществ рассчитывают индексы: видового богатства Маргалефа, видового разнообразия Шеннона, выравненное Пиелу, доминирования Симпсона и др. (Животовский, 1980; Мэгарран, 1992; Маргалеф, 1992).
Измерение разнообразия необходимо, чтобы отслеживать изменения, происходящие в экосистемах; чтобы отличать друг от друга состояния экосистем; чтобы оценивать состояния экосистем на шкале «норма — патология». Задача измерения разнообразия нетривиальна и в первую очередь из-за того, что сообщества — многокомпонентные системы. По одним признакам «выигрывает» одна система, по другим — другая, и требуется способ согласования множества признаков, сосуществующих одновременно (Мэгарран, 1992).
В самом общем виде удобно рассматривать сообщество как объединение групп различающихся по какому-либо признаку организмов. Это могут быть: популяции биологических видов, размерные группы, возрастные когорты, группы физиологически сходных организмов (например, потребляющих одинаковые ресурсы), группы сходных жизненных форм и т.д.
Наиболее полная информация о количественных характеристиках сообщества содержится в «векторе» п = (nbn2,...,nw), где п — численность организмов в /-той группе, aw — общее число выделенных групп. Измерить разнообразие — значит сопоставить вектору п единственное число.
Одним из путей в обосновании выбора тех или иных индексов разнообразия является анализ ранговых распределений численностей видов (Мэгарран, 1992; Пузаченко, 1996; Максимов и др., 1997; Левич, 1980, 1994, 2007, 2009). Ранговое распределение представляет собой преобразованный вектор численностей: наиболее обильной группе присваивается первый номер, следующей по численности группе - второй и так далее до наименее обильной группы, которая имеет номер w, совпадающий с общим числом групп в сообществе.
Левич (1980) пишет, что ранговые распределения также могут рассматриваться как инструмент при анализе состояния сообществ. Непосредственным объектом анализа при этом может быть форма кривой рангового распределения или при неизмененной форме - количественные значения его параметра. Несмотря на то, что одинаковые значения целостных характеристик сообществ могут порождаться разными ранговыми распределениями, последние являются более тонким и чувствительным инструментом изучения состояния экосистем.
В экологии для описания структуры сообщества традиционно применяется целый ряд моделей ранговых распределений: экспоненциальное, гиперболическое, дзета-модель, модель «разломанного стержня» и др. (Левич, 1980; Песенко, 1982).Напомним, что каноническая модель рангового распределения представляет собой формальную зависимость численности вида от его ранга, а параметры моделей представляют собой показатели видового разнообразия (Левич, 1980). Нас интересуют, прежде всего, различные параметризации ранговых распределений, т.е. их формальные модели. По мнению признанного эксперта в этой области А.П. Левича «...при существующей точности оценки численности организмов в группах сообщества: 1) нет смысла применять более чем однопараметрические модели распределений и 2) различные однопараметрические модели эквивалентны в пределах имеющейся точности
Клинические методы исследований, использованные в работе для оценки эффективности пробиотиков
Метод пульс-гель электрофореза является «золотым стандартом» типирования микроорганизмов и обладает очень высокой разрешающей силой, позволяет распознать перестройки генома по типу инсерции, делеции, что ценно для внутриштаммовой характеристики. С помощью компьютеризированной системы сканирования гелей стало возможным создание банка данных профилей PFGE для разных микроорганизмов и работа с ними (Tynkkynen et al., 1999; O Sullivan, 2000).
Данный метод позволяет разделить большие фрагменты ДНК в агарозном геле с использованием электрического поля (Romling et al., 1992). Суть метода заключается в обработке геномной ДНК редкощепящими рестриктазами, разделяющими геном на несколько (5-50) крупных фрагментов, которые затем разгоняют в агарозном геле. Особенность метода заключается в том, что ввиду крупного размера фрагментов все манипуляции (выделение ДНК из клеток), обработка рестриктазами осуществляется непосредственно в агарозных пластинах. Фрагменты, полученные после рестрикции на агарозных пластинах вновь помещаются в гель и затем разделяются с помощью переменного электрического поля. Метод используют для фингерпринтинга изолятов пробиотических бактерий, внутривидового типирования (Шагинян, 2000; Polzin et al., 1993; Tynkkynen etal., 1999).
Анализ сайтов рестрикции с помощью метода полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) является эффективным способом определения вариаций последовательности ДНК. Метод основан на сравнении количества и размеров фрагментов, образующихся в результате гидролиза ДНК эндонуклеазами рестрикции, разрезающими ДНК в специфичных участках из 4 - 6 нуклеотидов. Благодаря высокой специфичности гидролиза, его результаты воспроизводимы - каждый раз образуется определенное количество фрагментов с определенными размерами. Эти фрагменты разделяются электрофорезом в агарозном геле и визуализируются после окраски бромидом этидия (O Sullivan, 2000).
Метод ПДРФ применяют для исследования штаммового состава микроорганизмов рода Lactobacillus и Bifidobacterium в различных биотопах организма человека (Коваленко Бурьяновский, Подгорский, 2000; Лашевский, Коваленко, 2003; Zhong et al, 1998).
Риботипирование - метод геномного фингерпринтинга, представляющий собой наиболее распространенный на данный момент вариант саузерн-блот анализа. Для выполнения риботипирования (создания риботипа) микроорганизма геномная ДНК обрабатывается мелкощепящими рестриктазами. Полученные фрагменты ДНК размером от 1000 до 20 000 п.н. разделяются в агарозном геле и обрабатываются зондом, в качестве которого выступают последовательности генова 16S, 23S или 5S рРНК, а также гипервариабельные нуклеотидные последовательности, рассеянные по геному. Гибридизация может быть проведена непосредственно в геле, либо на нейлоновой или нитроцеллюлозной мембране. Рестрикты, содержащие копии этих генов визуализируются, формируя индивидуальную конфигурацию - риботип (O Sullivan, 2000). Метод широко используется для работы с пробиотическими микроорганизмами (Zhong et al., 1998; Tynkkynen etal., 1999).
Часто для изучения видового разнообразия и внутривидового типирования бактерий рода Lactobacillus применяют метод случайной амплификации полиморфной ДНК (RAPD), основанный на использовании коротких произвольных олигонуклеотидных праймеров длиной 9-10 пар нуклеотидов, которые гибридизуются с ДНК-мишенью при низкой температуре отжига (Kleerebezem, 2004). Суть метода заключается в амплификации случайных последовательностей ДНК-мишени с одного праймера, для которого неизвестно, где на ДНК мишени он имеет участки гомологии, и сколько их. В данном методе стадия рестрикции амплификатов отсутствует, поскольку в процессе амплификации синтезируются фрагменты разной длины, которые разделяют электорофорезом в агарозном геле и анализируют полученные электрофореграммы.
При работе с микроорганизмами молочнокислого брожения метод случайной амплификации полиморфной ДНК применяется более широко, чем метод ПДРФ. Чаще всего этот метод применяют в комплексе с другими методиками при работе с близкородственными видами (Ботина, 2010b; 2010с; Ward, Timmins, 1999; Torriani Felis, Dellaglio, 2001).
Метод TAP-PCR является модификацией RAPD с более высокой чувствительностью. Суть TAP-PCR заключается в параллельной постановке с одним коротким праймером трех реакций амплификации при разной температуре отжига (38, 40 и 42 С) и дальнейшем анализе наработанных фрагментов в агарозном геле и их сравнением. Чувствительность метода высока, как и у метода RAPD, а сравнение трех фореграмм одного штамма увеличивает точность и достоверность анализа (Cusick, 2000; O Sullivan, 2000).
Для изучения видового разнообразия лактобацилл и бифидобактерий различных биотопов организма человека, микробных ассоциаций различных экологических ниш и субстратов эффективно используется метод электрофореза в денатурирующем градиенте геля (PCR-DGGE) (Walter, Tannock, Tilsavaimisjarvi, 2000; Zoetendal, Ben-Amor, Akkermans, 2001; Lopez et al, 2003).
Особенности возрастной динамики численности симбиотических микроорганизмов толстой кишки «больных» людей
Показатели №1, 2, 3 - виды микроорганизмов, встречающиеся в норме у всех возрастных групп «здоровых» людей, представители резидентной микрофлоры кишечника человека (Лизько, 1970; Марко, 1970; Эпштейн-Литвак, Вильшанская, 1977; Панчишина, Олейник, 1977; Блюгер, Паберза, Новицкий, 1981; Грачева, Гончарова, 1986).
Показатель №4 - Clostridium spp., Fusobacterium spp., Peptococcus spp, Peptostreptococcus spp., Eubacterium spp., - значение и роль их в микробиоценозе неоднозначна. Одни авторы регламентируют их количество в норме, другие относят их к УПМ (Марко, 1970; Эпштейн-Литвак, Вильшанская, 1967; Ohkusa, 2002; Hopkins, Macfarlane, 2002; Marcovitch, 2003; Castellarin et al, 2011). Показатель №5 - роль бактероидов до конца не выяснена, но установлено, что они принимают участие в пищеварении, расщепляют желчные кислоты, участвуют в процессе липидного обмена. Отмечено, что заселение кишечника бактероидами происходит после первого полугодия жизни ребенка. Среднее количество в микрофлоре - 1x10 КОЕ/мл (Лизько, 1970; Марко, 1970; Панчишина, Олейник, 1977; Грачева, Гончарова, 1986).
Показатели № 6, 7, 8, 9, 10 - в большинстве случаев представителем резидентной микрофлоры является Escherihia coli. Но так как ее штаммы обладают различной ферментативной активностью и, соответственно, в разной степени влияют на бактерий - симбионтов и на физиологические процессы в толстой кишке, нам представляется важным подразделение Escherihia coli на: лактозопозитивные, лактозодефективные, лактозонегативные и гемолитические. Также целесообразно учитывать и общее количество Escherihia coli. (Красноголовец, 1989).
Показатели №11,12 - В 48% случаев у «здоровых» людей и в 28% - у «больных» - в составе микрофлоры ЖКТ обнаруживается Enterococcus spp. Ряд авторов относит его к резидентной микрофлоре просвета кишечника. Этим объясняется наличие этого показателя в нашем перечне. Но, по данным литературы, известно, что гемолитические штаммы Enterococcus в ассоциациях выступают в отрицательной роли, поэтому необходимо дифференцировать и этот микроорганизм (Марко, 1970; Лизько, 1970; Эпштейн-Литвак, Вилшанская, 1977; Панчишина, Олейник, 1977; Грачева, Гончарова, 1986).
Показатели №13,14 - важную роль в развитии патологических процессов у человека играет представители рода Staphylococcus: группа S.epidermidis spp. и S.aureus. S.epidremidis spp. часто относят к представителям нормофлоры просвета кишечника, в случае если его выделяют в количествах не более 105 КОЕ/г. S .aureus в количествах 105 КОЕ/г и более является этиологическим фактором возникновения патологических процессов (Лизько, 1970; Марко, 1970; Эпштейн-Литвак, Вилшанская, 1977; Панчишина, Олейник, 1977; Блюгер, Паберза, Новицкий, 1981; Красноголовец, 1989; Голосова, Толкачева, 1984; Пинегин и др., 1984; Грачева, Гончарова, 1986; Грачева, Партии, Щербаков, 2003).
Показатели №15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 - представителей семейства Enterobacteriaceae относят к группе условно-патогенных микроорганизмов, в количестве более 10э КОЕ/г могут вызывать патологические процессы в организме человека, выступать как в роли этиологического фактора заболеваний, так и отягощать течение основного заболевания (Марко, 1970; Блюгер, Паберза, Новицкий, 1981; Голосова, Толкачева, 1984; Грачева, Гончарова, 1986; Соколова, Соловьева, 1999; Пивоваров, Королик, 2000; ОСТ 91500.11.0004-2003,2003).
Показатель 21 - редко встречающиеся виды семейства Enterobacteriaceae: Budvicia spp., Buttiauxella spp., Cedecea spp., Edwardsiella spp., Ewingella spp., Kluyvera spp., Leclercia spp., Leminorella spp., Moellerella spp., Obesumbacterium spp., Plesiomonas spp., Pragia spp., Providencia spp., Rahnella spp., Raoultella spp., Tatumella spp., Yokenella spp. (Пивоваров, Королик, 2000; Поздеев, Федоров, 2007).
Показатель №23 - Pseudomonas aeruginosa хоть и входит в группу неферментирующих грамотрицательных микроорганизмов, но мы сочли необходимым выделить её в отдельный показатель, так как она часто является возбудителем внутрибольничных инфекций (Иванов, 2006; Воробьева и др., 2009).
Показатель №24 - микроорганизмы, входящие в группу неферментирующих грамотрицательных микроорганизмов (НГОБ) -Pseudomonas spp., Burkcholderia spp., Acinetobacter spp., Alcaligenes spp., Stenotrophomonas spp., Chryseobacterium spp. и др. - могут быть транзиторными, но при иммунодефицитных состояниях макроорганизма могут выступать этиологическим фактором того или иного заболевания или отягощать течение основного заболевания (Воробьева и др., 2009) Показатель №25 - Candida spp. у людей обнаруживаются при кандидоносительстве, кандидозном дисбиозе и кандидозе, как отдельной нозологической форме заболевания. Выделение в количестве болееЮ4КОЕ/г является показателем какого-либо патологического процесса. Наиболее часто встречающийся вид - С.albicans (Шевяков и др., 2007).
Показатель №26 - «дрожжевые» клетки - грибы других родов (Saccharomyces spp., Kluyveromyces spp., Pichia spp. и др.), встречаются реже, чем Candida spp, могут выступать в роли транзиторных микроорганизмов, поступая с пищей, но в случае иммунодефицитов могут вызывать патологические процессы (Авалуева и др., 2010).
Показатели №27, 28, 29 - группа патогенных микроорганизмов, вызывающих кишечные инфекции. (Клиническая и лабораторная аналитика, 2003; Поздеев, Федоров, 2007).
Нами был исследован качественный и количественный состав микрофлоры просвета толстой кишки 3268 людей различных возрастных групп, как «здоровых», так и «больных», всего проведено 5837 анализов.
Эти данные были занесены в электронные таблицы соответственно 29 выбранным показателям. Была создана электронная база данных.
Для управления базой данных был разработан программный продукт, позволяющий обрабатывать и систематизировать результаты бактериологических исследований качественного и количественного состава микрофлоры желудочно-кишечного тракта из базы данных - система управления базой данных (СУБД) «Автоматизированная система микробиологического мониторинга микробиоценозов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ)», которая написана на языке FoxPro в среде программирования Microsoft Visual FoxPro 8.0 (файл-серверная реляционная СУБД) в рамках операционной системы Windows.
На этапе инфологического проектирования было выделено 5 основных сущностей: человек, возрастная группа, лечебное учреждение, в котором обследовался пациент, микроорганизм, анализ. Для проектирования был выбран метод сущность-связь. Доступ к базе программно организован таким образом, что пользователь может модифицировать и обрабатывать данные на уровне доступного и понятного ему графического интерфейса. Для удобства работы в программный продукт также встроено руководство пользователя, где можно найти всю необходимую информацию о работе с программой.
Разработка методики видовой идентификации лактобацилл с использованием гнездового варианта ПЦР
Дети в возрасте от 24 до 167 часов (24ч. - 6с). В группу детей в возрасте 1с. - 6с. были включены 444 ребенка. Они были разделены на подгруппу здоровых детей (194 человека, их микрофлора была описана выше) и подгруппу риска по развитию гнойно-воспалительных заболеваний (250 человек) по клиническим показателям состояния здоровья и анамнезу.
Бифидофлора не сформировалась в подгруппе риска по развитию ГВЗ у 30% (75) детей. Бифидобактерии обнаруживались в количестве 1х1(ГКОЕ/гу-4%(10) детей, 1хЮ5КОЕ/г - 4% (10), 1хЮ6КОЕ/г - у 12% (30) детей, 1хЮ7КОЕ/г - 16% (40) человек, 1х108КОЕ/г - у 10% (25), 1хЮ9КОЕ/г - у 18% (45) детей, 1х1010КОЕ/г - у 6% (15) ребенка. В подгруппе здоровых детей бифидофлора не сформировалась у 40,9% (79) человек. Бифидобактерии обнаруживались в 2,3% случаев (по 4 ребенка) в количествах lxl0zKOE/r, 1хЮ3КОЕ/г и 1хЮ4КОЕ/г, в 1хЮ5КОЕ/г выявлялись у 9,1% (18) детей, в 1х10КОЕ/г и 1х10 КОЕ/г выделялись у 6,8% детей (по 13 ребенка), в 1хЮ8КОЕ/г - у 4,5% (9 детей), в 1хЮ9КОЕ/г - у 20,5% (40) человек, в 1хЮ10КОЕ/г - у 4,5% (9 детей) обследованных, (рис. 27).
Лактофлора была не сформирована у 26% (65) человек в подгруппе риска по ГВЗ, у остальных детей из этой подгруппы выделялась в количестве ІхІО КОЕ/г у 2% (5 человек), в 1х104КОЕ/г - 2% (5 детей), в 1х106КОЕ/г -22% (55 детей), в 1хЮ7КОЕ/г - у 6% (15 человек), в 1хЮ8КОЕ/г - у 24% (60 детей), в 1хЮ9КОЕ/г у 10% (25 человек), 1хЮ0КОЕ/г у 8% (20) обследованных. В подгруппе здоровых детей лактофлора не сформировалась у 45,5% (88 человек) детей. Лактобациллы выделялись в количестве 1хЮ5КОЕ/г у 6,8% (13 детей), 1хЮ6КОЕ/г - у 27,3% (53) детей, в 1х107КОЕ/г у 6,8% (13) человек, в 1хЮ8КОЕ/г - у 4,5% (9) новорожденных, в 1хЮ9КОЕ/г - у 6,8% (13) детей, в 1хЮ0КОЕ/г - у 2,3% (4) обследованных, (рис. 28).
Достоверных различий в процессе формирования облигатной анаэробной флоры в двух подгруппах не выявлено (р 0,05).
В микрофлоре кишечника детей данной возрастной группы условно-патогенные микроорганизмы выделялись с большой частотой в значимых количествах. В подгруппе больных детей наиболее часто выделялись Klebsiella spp. 62% (155), S.aureus 28% (70), P.mirabilis 28% (70), S.epidermidis - 22% (55), M.morganii - 10% (25). В подгруппе здоровых детей наиболее часто обнаруживались S.epidermidis - 43% (108), Klebsiella spp. -18% (45), S.aureus - 11% (28). (рис. 29).
Частота обнаружения микроорганизмов различных видов у новорожденных в возрасте 24ч. - 6с, N=444: п3=194, пр=250.
При сравнении частоты обнаружения УПМ в микрофлоре новорожденных двух подгрупп установлено достоверно более частое выделение в микрофлоре детей из группы риска по развитию ГВЗ микроорганизмов родов Klebsiella, Proteus, Morganella, S.aureus. (p 0,05).
В ассоциациях УПМ выделялись в подгруппе здоровых детей по 2 вида у 13,6% (26) обследованных, в подгруппе риска по ГВЗ по 2 вида - у 22% (55 человек), по 3 вида - 14% (35 детей), по 4 и более - 4% (10 человек) (рис. 30).
По данным бактериологического исследования фекалий нормальное формирование микробиоценоза кишечника обнаружено у 31,9% детей (142 человека), а 68,1% (302 ребенка) составили группу риска по развитию дисбиотических нарушений микрофлоры (рис. 31).
Процесс формирования микрофлоры в данной возрастной группе расценивался как нормальный у 68,2% (303) здоровых детей, у 31,8% (141) здоровых новорожденных обнаружено дисбиотическое состояние первой степени. У всех детей из группы риска по развитию ГВЗ (250) установлено нарушение процесса формирования микрофлоры - дисбиотическое состояние первой степени.
Дети в возрасте от 7 до 29 дней (7с. - 29с.). В группу включено 358 детей, 178 из них отнесены в подгруппу «больные» и 180 - «здоровые».
Лактобациллы в значимых количествах ( 10 КОЕ/г) отсутствовали у 44,9% (80 человек) в подгруппе больных детей. В количестве 1хЮ8КОЕ/г обнаруживались у 12,8% (23 человек), 1хЮ9КОЕ/г у 10,3% (18), 1х1010КОЕ/г - у 9% (16 человек). В подгруппе здоровых новорожденных лактобациллы в значимых количествах отсутствовали у 29,2% (52 человека). В количестве 1хЮ8КОЕ/г определялись у 25% (45 детей), 1х109КОЕ/г - у 29,2% (52 человека), 1хЮ,0КОЕ/г-у 4,2% (7 детей) (рис. 32).
Характеристика лактофлоры новорожденных в возрасте 7с. - 29с, N=358: п,= 180, пб=178. Бифидобактерии в значимых количествах ( 1х106КОЕ/г) в подгруппе больных не выделялись у 38,5%) (69 детей), в количестве 1хЮ8КОЕ/г обнаруживались у 12,8% (23 человека), 1хЮ9КОЕ/г - у 12,8% (23 ребенка), 1хЮ10КОЕ/г - у 7,7%) (14 детей). В подгруппе здоровых в значимых количествах бифидобактерии не определялись у 20,8% (37 человек), в о Q количестве 1x10 КОЕ/г выделялись у 25% (45 детей), 1x10 КОЕ/г - у 33,3% (59 человек), 1хЮ10КОЕ/г - у 8,3% (15 детей) (рис. 33). Рис. 33. Характеристика бифидофлоры новорожденных в возрасте 7с. - 29с, N=358: п3=180пб=178. Спектр выделяемых УПМ в этой возрастной группе довольно широк.(рис.) Наиболее часто в подгруппе больных обнаруживались Klebsiella spp. - 41% (73), S.epidermidis - 32% (57), P.mirabilis 15% (27), C.albicans 14% (25), S.aureus 12% (21). В подгруппе здоровых детей с одинаковой частотой 25% определялись Klebsiella spp., S.epidermidis, S.aureus (рис. 34). Частота обнаружения микроорганизмов различных видов у новорожденных в возрасте 7с. - 29с, КОЕ 105 и более, N=358: п3=180, пб=178.
УПМ в ассоциациях выделялись в подгруппе больных детей у 22,1% (39) обследованных детей, в подгруппе здоровых у 12,5% (23) (рис. 34) .Причем в подгруппе здоровых детей не выделялись ассоциации УПМ по 4 вида и более (рис. 35). ассоциации из 2 видов УПМ из 3 видов УПМ здоровые больные" из 4 и более видов УПМ Рис. 35. Частота обнаружения ассоциаций УПМ у новорожденных в возрасте 7с. - 29с, N=358:n3=180, пб=178. 141 По степени дисбиотических нарушений микрофлоры кишечника подгруппы характеризовались следующим образом: в подгруппе здоровых детей в возрасте 7с. - 29с. нарушение формирования микробиоценоза 1 степени определялось в 25% случаев (45 человек), у остальных детей микробный пейзаж определен как нормальный (рис 36).
