Содержание к диссертации
Введение
I Обзор литературы 6
I.1. Биологическая модель ускоренного старения 6
I.2. Сперматогенез у млекопитающих 9
I.3. Карнозин- природный антиоксидант и геропротектор 21
II Материал и методы 27
II.1. Объекты исследований 27
II.2. Фиксация материала и приготовление препаратов 28
II.3. Окрашивание препаратов 28
II.4. Цитогенетические методы 29
ІІ.4.1. Метод учёта сперматогониальных и мейотических микроядер 29
II.4.2. Метод учёта аномалий форм головок спермиев (АГС).30
II.5. Микроспектрофотометрия 31
II.6. Статистическая обработка данных 32
III Результаты исследований 33
III. 1. Скорость роста животных 33
III.2. Динамика возрастзависимых изменений массы семенников..,.34
III.3. Возрастные изменения абсолютного числа клеток сперматогенного эпителия у мышей линий SAMP1 и SAMR1 37
III.4. Гистологическое исследование структуры семенных канальцев у разновозрастных мышей линий SAMP1 и SAMR1 44
III.5. Цито генетический анализ сперматогенеза у мышей линий SAMPIHSAMRI 51
III.5.1. Морфология ядерных и хромосомных нарушений в развивающихся сперматогенных клетках мышей линий SAM 51
III.5.2. Оценка частоты возникновения спонтанных микроядерных аберраций в сперматогониальных клетках...55 Ш.5.3. Оценка частоты возникновения спонтанных микроядерных аберраций в ранних постмейотических клетках (округлых сперматидах) 57
III.6. Сперматогенез у мышей-долгожителей SAMP1, склонных к ускоренному старению 58
III.б.1.Количественный анализ 59
III.6.2. Морфо-гистологический анализ 59
III.б.З. Цитогенетический анализ 60
III.7. Влияние карнозина на развитие мужских половых клеток мышей линий SAMP1 и SAMR.1 65
III.7.1. Количественные и качественно-морфологические изменения сперматогенеза мышей SAM под влиянием карнозина 65
III.7.2. Влияние карнозина на частоту встречаемости генетически аномальных половых клеток в семенниках мышей SAM 69
IV Обсуждение результатов 72
IV. 1. Количественная характеристика сперматогенного эпителия у мышей линий SAM 72
IV.2 Качественный морфо-гисто логический анализ сперматогенеза мышей линий SAM 75
IV.3. Цитогенетический анализ сперматогенеза мышей линий SAM 78
Выводы 86
Список литературы 88
- Сперматогенез у млекопитающих
- Окрашивание препаратов
- Возрастные изменения абсолютного числа клеток сперматогенного эпителия у мышей линий SAMP1 и SAMR1
- Сперматогенез у мышей-долгожителей SAMP1, склонных к ускоренному старению
Введение к работе
Модель ускоренно стареющих мышей (SAM, senescence-accelerated mouse), впервые разработанная японскими исследователями из Университета Киото (Takeda et al., 1981, 1997) в ходе селективного инбридинга животных, произошедших от случайного скрещивания американских мышей линии AKR/J, страдающих наследственной формой лейкемии, с мышами неизвестного происхождения, ввела в поле зрения генетиков и биологов совершенно новое явление, а именно: наследуемое в поколениях сверхбыстрое угасание жизненно важных функций вследствие нарастания за короткое время частот мутаций, неустойчивостей и напряженностей в работе ферментных комплексов, участвующих, как известно, во многих внутриклеточных метаболических процессах и в формировании структур, повышенной чувствительности к изменениям условий окружающей среды.
В дальнейшем инбредные мыши SAM были разделены на две основные группы-серии: мышей, склонных к ускоренному старению {senescence-accelerated mouse prone, линии SAMP1) и мышей, устойчивых к ускоренному старению (senescence-accelerated mouse resistant, линии SAMR). И хотя мыши линий SAMP и линий SAMR родственны, имеют одно и то же происхождение, они отличаются друг от друга по срокам жизни. Для первых средняя продолжительность жизни составляет 9,7 мес, а максимальная - 15 мес, для вторых - соответственно, 18,3 и 24 мес.
Ценность модели SAM заключается в том, что она открывает большие возможности для раскрытия причин катастрофического сокращения продолжительности жизни и возникновения различных патологических состояний. С другой стороны, познание специфических, нелинейных закономерностей, действующих в системе ускоренно стареющих мышей, имеет значение не только для общей теории старения, но и для понимания природы сверхбыстрых процессов и их роли в развитии и эволюции.
Еще большее значение, на наш взгляд, биологическая модель ускоренного старения может иметь в исследованиях, проводимых в рамках фармакологической стратегии, направленной на повышение жизнеспособности, улучшения качества жизни и ее продления. Ясно, что обнаружение биологически активных соединений, способных упорядочивать уклонившиеся от линейного развития клеточные системы, усиливать репродуктивный потенциал, изменять облик организма, и, наконец, отодвигать старение и смерть на более поздние стадии индивидуального развития, будет крупным научным успехом.
Сперматогенез - сложная динамическая система развития мужских половых клеток. В тотальном плане спермато генная система генетически строго детерминирована, упорядочена, устойчива. Она жестко подчиняется пространственно-временным закономерностям, функционально взаимодействует с соседними специализированными структурами соматического типа. Морфологические нарушения в ней локальны и незначительны. Сперматогенез включает в себя такие процессы-явления как самообновление и коммитация стволовых клеток, пролиферация и клеточная гибель, репарации и регенерации, мейоз и дифференцировки (Данилова, 1982; Райцина, 1982; Захидов, 1998). В настоящее время детальное и глубокое изучение этих фундаментальных биологических явлений на экспериментальных генетических (мутационных) моделях способно принести новые ключи для быстрого роста наших знаний о регуляторных механизмах, лежащих в основе процессов становления, размножения, роста и созревания сперм ато генных клеток, скрытых линиях их развития, а также о причинах мужского бесплодия, генетических и репродуктивных рисках, возникающих под влиянием тех или иных воздействий, в том числе и под влиянием времени. Вообще с теоретической точки зрения совершенно очевидна актуальность любых исследований проблем гаметогенеза, как в норме, так и в состояниях, не отвечающих оптимальным. Ведь именно половые клетки связывают поколения, противостоят беспорядку и тем самым гарантируют непрерывность жизненного процесса и бессмертие генов.
Поэтому систематические и системные (комплексные) исследования сперматогенеза у ускоренно стареющих мышей, в том числе и с привлечением
экспериментальных подходов, важны и необходимы, поскольку хорошо известно, что системы с ускорением развиваются неустойчиво, неравномерно, непредсказуемо. Ранее уже было показано (Захидов и др., 1999, 2000, Урываева и др., 1999), что мыши линий SAM характеризуются высоким уровнем генетической нестабильности соматических и половых клеток. Все это заставило нас сделать новые шаги в направлении наращивания фактологического материала, объединение которого позволит составить более полную и рациональную картину течения сперматогенеза в условиях ускоренного темпа развития биологических процессов, а заодно подготовить надежную теоретическую основу для развертывания в будущем широких экспериментальных исследований.
Цель настоящего исследования — сравнительное и экспериментальное изучение возрастной динамики сперматогенеза у мышей линии SAMP1, склонных к ускоренному старению, и мышей линии SAMR1, устойчивых к ускоренному старению.
Цель исследования предусматривает решение следующих основных задач:
- количественная характеристика возрастзависимых изменений клеток
сперматогенного эпителия;
качественное, морфологическое описание возрастзависимых изменений пространственной организации сперматогенной структуры.
онтогенетическое изучение интенсивности спонтанного хромосомного мутагенеза в системе развития мужских половых клеток;
- изучение особенностей сперматогенного процесса у мышей-долгожителей
SAMP1;
- установление закономерностей развития мужских половых клеток у ускоренно
стареющих мышей, подвергшихся влиянию биологически активного
соединения, антиоксиданта карнозина.
Сперматогенез у млекопитающих
Сперматогенез - это сложный процесс клеточной дифференцировки, возникший в результате длительной эволюции и характеризующийся строгой временной и пространственной организацией (см. напр. Райцина, 1982; Захидов, 1998). У млекопитающих дифференцировка мужских половых клеток начинается сразу же после заселения зачатков гонад первичными половыми клетками (ППК). ППК млекопитающих обособляются в ходе индивидуального развития рано, ещё до образования первых сомитов. Эти клетки, обладающие чёткими морфологическими признаками, обнаруживаются сначала в первичной эктодерме, но почти сразу же мигрируют в заднюю часть внезародышевой энтодермы (ткань желточного мешка). Затем они перемещаются по кишечной энтодерме в брыжейку, а оттуда - в образованные целомическим эпителием половые валики. Миграция
ППК происходит как пассивно (вместе с перемещающимися клеточными пластами во время гаструляции, а у птиц ещё и с током крови), так и путём активного движения. Считается, что для ППК большинства млекопитающих свойственно размножение в период миграции. Так, у зародышей мышей число ППК в ходе передвижения к половым валикам увеличивается более чем в 50 раз. А после внедрения ППК в зачатки гонад пролиферация этих клеток становится ещё более активной (Райцина, 1982). Первичные половые клетки заселяют зачаток гонады у мышей примерно на 13-й день внутриутробного развития (Koji, 2001).
Эти активно делящиеся внутри дифференцирующихся мужских гонад клетки называются гоноцитами или Т-пресперматогониями. Они располагаются в просвете клеточных канальцев. Не переставая делиться, гоноциты медленно мигрируют по направлению к базальной мембране. Большая их часть обречена на дегенерацию и будет фагоцитирована клетками Сертоли, всего 2 — 4% клеток достигнет базальной мембраны и трансформируется в стволовые сперматогенные клетки или сперматогонии Ао. Незадолго до рождения животного мужские половые клетки перестают делиться, с тем чтобы вскоре после рождения начать вторую волну пролиферации или собственно сперматогенез (Райцина, 1982; Захидов, 1998).
Первая стадия сперматогенеза — стадия размножения. Стволовые сперматогонии, делясь, могут дать начало либо себе подобным, либо спер матого ниям типа А-спаренные (Асп), соединенным цито плазматическим и мостиками. С этого момента все дальнейшие клеточные деления будут неполными, и мужские половые клетки будут развиваться в синцитиальных клонах. Функциональное значение синцитиального развития мужских половых клеток, описанного в 1961 г. Фосеттом (Fawcett), до сих пор является предметом дискуссии. Возможно, таким образом обеспечивается синхронность развития клеток и клеточных делений, а также равномерное распределение продуктов экспрессии генов (Данилова, 1982; Захидов, 1998). Последнее нашло своё подтверждение в опытах с гемизиготными трансгенными животными (Braim et al., 1989, цит, по Захидов, 1998). Интересное объяснение данного явления предложил До кинз (Dawkins, 1982). Согласно его гипотезе необходимость равномерногораспределения белковых продуктов (также как и выключения генома мужских гамет) связана с генетической неоднородностью постмейотических клеток и призвана минимизировать генетически обусловленные различия между сперматозоидами, поскольку мутации, приводящие к большей жизнеспособности гамет, в дальнейшем могут оказаться вредными для организмов.
В результате нескольких последовательных делений сперматогониев Асп образуется синцитий сперматогониев типа А-групповые (Агр) - ещё недифференцированных клеток. Началом дифференцировки считается превращение сперматогониев Агр в сперматогонии типа А1 (Захидов, 1998). Сперматогонии типов А1, А2, A3, А4 последовательно сменяют друг друга в ходе митотических делений. Эти сперматогонии сходны по строению со стволовыми, однако по мере их развития происходит постепенная конденсация хроматина, уменьшение размеров ядра и клетки в целом (Данилова, 1982; Райцина, 1982). Деление сперматогониев типа А4 приводит к образованию сперматогониев так называемого промежуточного типа, которые, в свою очередь, дают начало сперматогониям типа В. Это последний в ряду сперматогониальных митозов. Деление сперматогониев типа В образует качественно новые клетки -сперматоциты первого порядка (сперматоциты I), вступающие в мейоз.
Показано, что эмбриональный семенник секретирует вещество, ингибирующее мейоз в половых клетках, соответственно, переход к редукционному делению совершается только в постнатальный период, после того, как семенник, по мере роста и дифференцировки, теряет способность блокировать мейоз, а клетки rete testis и эпидидимиса начинают вырабатывать фактор, индуцирующий вступление клеток в профазу I (Grinsted et al., 1979, цит. по Райцина, 1982).Мейоз - ключевое событие гаметогенеза. Профаза I мейоза, называемая также стадией роста, подразделяется на следующие стадии: прелептотена, лептотена, зиготена, пахитена, диплотена и диакинез и является самой продолжительной по времени стадией развития мужских половых клеток, во время которой происходят сложные биохимические и генетические процессы, связанные со структурными преобразованиями хроматина, образованием тетрад,формированием синаптонемального комплекса и кроссинговером (Захидов, 1998). После двух делений созревания - редукционного и эквационного - из каждого сперматоцита I образуется четыре гаплоидные и генетически неоднородные сперматиды, которые больше не делятся и вступают в терминальную стадию дифференцировки - спермиогенез.
Спермиогенез - это последовательность глубоких биохимических и морфологических преобразований, приводящих к образованию из ранних — округлых - сперматид зрелых сперматозоидов. Вот лишь основные их них: изменение структуры ядра, конденсация хроматина и выключение генома сперматиды, образование акросомы, формирование локомоторного аппарата, сбрасывание большей части цитоплазмы и, как следствие, резкое уменьшение объёма клетки (Данилова, 1982; Райцина, 1982, Захидов, 1998). Важнейшее значение для стабилизации и конденсации хроматина имеет смена типов основных ядерных белков в спермиогенезе: гистоны соматического и мейотического типов замещаются протаминоподобными белками, богатыми аргинином и цистеином, имеющими большее сродство к ДНК (Данилова, 1982; Костомарова, Князева, 1982).Морфологически зрелые сперматозоиды выходят в просвет семенных канальцев, а затем в эпидидимис, где мужские гаметы окончательно формируются на биохимическом уровне, приобретают двигательную активность и оплодотворяющую способность (Захидов, 1998).Все этапы сперматогенеза проходят при участии и под контролем клеток
Окрашивание препаратов
Препараты, предназначенные для цитогенетических исследований и цитофотометрического анализа содержания ДНК, окрашивали по Фёльгену: гидролиз в 5N НС1 при 37С в течение 12 минут с последующей инкубацией в реактиве Шиффа в течение 1 часа при комнатной температуре.Гистологические срезы окрашивали гематоксилин-эозином. Микроядерные структуры — это хромосомные фрагменты или целые хромосомы, не включившиеся после клеточных делений — митотических или мейотических — в дочерние посттелофазные ядра. Они обычно располагаются дискретно в непосредственной близости от основного ядра, либо остаются тонко связанными с ним. В зависимости от своего происхождения микроядра могут иметь мелкие либо крупные размеры. Обрывки хромосом обычно возникают в результате нарушения связности хромосомной нити, в то время как микроядра на уровне отдельных целых хромосом могут возникать в результате нарушений аппарата деления. Образование крупных микроядер может происходить и в результате объединения в одно целое небольших микроблоков хромосомного материала. Уместно также вспомнить о том, что на генетическую стабильность и, как следствие, на образование микроядер могут влиять вирусы и прочие генетические паразиты, находящиеся в протоплазматической среде (Рапопорт, 1965).
Например, один из генов вируса иммунодефицита человека, Vpr, нарушая клеточный цикл, вызывает анеуплоидшо, хромосомные поломки и амплификацию генов, в результате чего могут возникать микроядерные аберрации (Shimura et al., 1999). Известно, что микроядерные структуры могут обладать сравнительно высоким уровнем устойчивости, способны сохранять на протяжении нескольких клеточных поколений свою целостность, реплицировать ДНК и синтезировать РНК. Микроядерный тест впервые был разработан в 1975 г. на клетках костного мозга мыши (Schmid, 1975). Затем он с успехом был использован и на других пролиферирующих клеточных системах: буккальный эпителий, лимфоциты, клетки сперматогенного эпителия и т. д., как in vivo, так и in vitro (Headle et al., 1983; Захидов, 1993). Для количественного цитогенетического анализа хромосомных мутаций этот метод значительно удобнее и производительнее, чем классический метод анализа метафазных хромосом - трудоёмкий и требующий больших затрат времени. Обычно в экспериментальных исследованиях по оценке мутагенных воздействий химических и физических агентов необходимо проанализировать от 1500 до 2000 метафазных пластинок, что занимает 10 человеко-дней (Hacker-Klom, 1995), тогда как с помощью метода учёта микроядер за 1 час оператор может подсчитать не менее 8000 клеток (Захидов, 1993). Поэтому в настоящее время микроядерные тесты находят широкое применение в мутационной генетике и генетической токсикологии. Частота встречаемости сперматогенных клеток с микроядрами у грызунов в норме составляет 2 - 4 на 1000 клеток. При воздействии мутагенных факторов химической и физической природы относительное число таких аберрантных половых клеток достоверно и воспроизводимо возрастает в несколько раз {Захидов, 1993). В настоящей работе определяли частоту встречаемости мужских половых клеток {сперматогониев и округлых сперматид) с микроядрами у мышей SAM разных возрастов. На окрашенных по Фёльгену препаратах просматривали не менее 500 сперматогониев и не менее 1000 округлых сперматид от каждого животного (фотомикроскоп «Оптон»,
Германия, при увеличении об. ЮОх, ок. 10х). Число генетически аномальных клеток выражали в промилле. Другой подход к оценке меры неупорядоченности наследственного материала в сперматогенных клетках, который мы использовали, - это метод учёта аномалий форм головок спермиев (АГС), разработанный в 1978 г. Уиробеком и Брюсом (Wirobek, Bruce, 1978). Как свидетельствуют литературные данные, в последние годы этот метод широко используется для выяснения уровня точечных мутаций и микроделеций при изучении явлений спонтанного и индуцированного мутагенеза. Известно, что формообразование мужских гамет контролируется многими генами на диплоидном уровне, расположенными в разных участках генома. Соответственно, частота нарушений этого процесса является хорошим отражением уровня точечных повреждений ДНК. Конечно, не исключается возможность, что увеличение частот АГС может происходить не только вследствие мелких генных изменений, но иногда и в результате анеуплоидии и крупных хромосомных перестроек: делений, транслокаций, инверсий. Появление аномальных форм в популяции зрелых сперматозоидов рассматривается как результат генетических нарушений в сперматоцитах I порядка (стадия прелептотены-лептотены) и сперматогониальных клетках. Процент морфологически атипичных спермиев постоянен у разных линий мышей. У гибридов СВАхВ157/С6 их уровень колеблется от 1 до 4%. При воздействии разнообразных мутагенов относительное количество тератогенных гамет достоверно и воспроизводимо возрастает. Все изученные мутагены дали положительные результаты в этой тест-системе. В нашей работе для определения частоты встречаемости тестикулярних и эпидидимиальных спермиев с морфологически аномальными головками просматривали не менее 500 клеток от каждого животного. Число аномальных сперматозоидов выражали в процентах. П.5.
Микроспектрофотометрия. Количественную оценку содержания ДНК-фуксина в спермиогенных клетках проводили с помощью метода прямой сканирующей денситометрии (при длине волны X = 540 нм). Для этого был использован микроденситометр Виккерс-М86 (Англия), работающий по принципу бегающего луча. Количество ДНК-фуксина измеряли дифференциальным методом, вычитая из интегральной плотности объекта интегральную плотность фона такой же площади (Агроскин и др., 1977,Захидов, 1993). Полученные в ходе работы численные данные обрабатывались с помощью статистического пакета SPSS, При этом для определения достоверности различий средних использовались параметрический критерий Стьюдента и непараметрический критерий Вилкоксона для стандартного 5%-ного уровня значимости.
Возрастные изменения абсолютного числа клеток сперматогенного эпителия у мышей линий SAMP1 и SAMR1
Первое, что обращает на себя внимание при анализе временного развития сперматогониальной популяции в семенниках мышей SAMP1 и SAMR1 - это отчетливый, достоверно нарастающий волнообразный характер возрастзависимыхизменений числа ранних половых клеток. Второе - более высокое общее число сперматогониев у мышей, склонных к ускоренному старению в сравнении с мышами, устойчивыми к ускоренному старению - в среднем на 20%.На ранних стадиях индивидуального развития в гонадах мышей обеих линий число пахитенных сперматоцитов постепенно увеличивается, достигая в 2 -З мес возрасте максимальных значений. Затем к 6 - 7 мес у мышей SAMP1 и SAMR1 число этих клеток заметно снижается - соответственно, на 25 и 20%. Далее число пахитенных сперматоцитов у мышей SAMP1, достигших 14 - 15 мес возраста, уменьшается еще на 35%, но стабилизируется, практически не меняется у мышей SAMR.1 в отрезке времени от 6 до 19 мес включительно.Динамика возрастзависимого изменения числа округлых сперматид в гонадах мышей SAMP1 и SAMR1 практически одинакова в течение всего исследованного периода развития. Максимальное количество таких клеток выявляется у 2 - 3 мес животных, оно не изменяется до 9-10 мес и затем снижается у мышей старше одного года.
У склонных к ускоренному старению мышей в возрасте 2-3 мес число тестикулярных спермиев достигает максимального значения, сохраняется на этом уровне до 9 - 10 мес и затем достоверно снижается. Иная динамика характерна для устойчивых к ускоренному старению мышей. Если в семенниках мышей SAMP1 в возрасте 1 мес уже появляются спермин, то у мышей SAMR1 их еще нет. У 2 - 3 мес мышей SAMR1 число тестикулярних спермиев достоверно ниже, чем у SAMP1. По-видимому, эти факты связаны с тем, что у мышей, склонных к ускоренному старению, все физиологические процессы ускорены и половое созревание наступает несколько раньше. Во всех последующих возрастных группах число сперматозоидов в семенниках самцов линий SAMP1 и SAMR1 принципиально не различается, к 6 - 7 мес оно достигает у линии SAMR1 максимальных значений, равных таковым для мышей SAMP1, и затем постепенно снижается.У мышей SAMP1 и SAMR1 абсолютное число вспомогательных соматических клеток Сертоли увеличивается в период от 14 дн. до 2 - 3 мес, а затем практически не изменяется. Исключение составляет возрастная группа 14-15 мес мышей, склонных к ускоренному старению. Но здесь нужно отметить, что среднее значение величины, характеризующей как бы существенное увеличение числа клеток Сертоли у 14 - 15 мес мышей линии SAMP1 по сравнению с предыдущими группами более, чем в 1,5 раза, в действительности не отражает истинного положения вещей, поскольку при таком малом размере выборки любое резкое индивидуальное отклонение отдельной особи сильно влияет на конечный средний результат.
Для характеристики интенсивности сперматогенного процесса у разновозрастных ускоренно стареющих мышей мы использовали также такой показатель, как отношение суммарного числа клеток (сперматогониев, пахитенныхсперматоцитов, сперматид и спермиев, клеток Сертоли) к абсолютному весу семенника. Оказалось, что как у мышей SAMP1, так и у мышей SAMR1 этот онтометрический показатель заметно снижается в период 2 нед - І мес, но вновь достигает своего прежнего уровня (SAMP1) или превосходит его (SAMR1) в 2 - 3 мес возрасте, после чего у первых он снова снижается (на 30, 36, 14 %, соответственно, в 6 - 7, 9 - 10 и 14 - 16 мес возрастах), тогда как у вторых остается неизменным. Резкий катастрофический характер изменения суммарного числа клеток, приходящихся на единицу веса семенника, в первый месяц жизни животных находится в полном соответствии со свойственной первой волне сперматогенеза массовой гибелью клеток. Поскольку у мышей, склонных к ускоренному старению, максимальное снижение суммарного числа клеток по времени совпадает с максимальным увеличением веса семенников (9 - 10 мес), то последнее должно быть отнесено за счет увеличения объема интерстициальной ткани и/или утолщения белочной оболочки. Обратная корреляция между значительным снижением числа сперматогенных клеток и увеличением толщины белочной оболочки была установлена у крыс, чьи семенники подверглись локальному рентгеновскому облучению (Кур носова, 1987).
Для того чтобы охарактеризовать возрастную динамику развития мужских половых клеток и оценить клеточные потери в ходе дифференцировки гамет у мышей изучаемых линий были рассчитаны соотношения между теми типами сперматогенных клеток, которые являются соседними этапами на пути образования зрелого сперматозоида. Соответственно, это было соотношение между числом спер мато гониев и пахитенных сперматоцитов, пахитенных сперматоцитов и округлых сперматид, округлых сперматид и тестикулярных спермиев.Как видно из табл. 2, наиболее заметные различия между линиями мышей в соотношениях различных типов клеток наблюдаются у животных в возрасте 1 мес, то есть приходятся на период первой волны сперматогенеза. Отношение числа округлых сперматид к пахитенным сперматоцитам у мышей линии SAMP1 данной возрастной категории примерно в два раза выше, чем у SAMR1, при том что отношение сперматогониев к пахитенным сперматоцитам у SAMP1 в это время несколько выше по сравнению с SAMR1. Это может быть связано с более раннимначалом первой волны сперматогенеза у SAMP1. Впрочем, придавать этим различиям большое значение в данном случае вряд ли стоит. Первая волна сперматогенеза, как правило, протекает аномально.
С наступлением половой зрелости, начиная с возраста 2-3 мес, рассмотренные соотношения типов клеток мало различаются у мышей обеих линий. И лишь в возрасте 14-16 мес отношение сперматогониев к пахитенным сперматоцитам различается у мышей двух линий на треть: 1:0,6 у мышей SAMP1 и 1:0,9 у мышей SAMR1. Самцы SAMR1 достигнут соотношения 1:0,6 только в следующей возрастной группе 19 мес. Таким образом, понижение числа сперматоцитов относительно сперматогониев у линии SAMP1 начинается раньше, что косвенно подтверждает наши предположения о более раннем угасании сперматогенеза у этих мышей.Следует также отметить, что начиная с возрастной группы 6-7 мес, отношение пахитенных сперматоцитов к округлым сперматидам, как у SAMP1, так и у SAMR1, приближается к теоретически ожидаемому 1:4,
Сперматогенез у мышей-долгожителей SAMP1, склонных к ускоренному старению
Суммированные результаты количественной оценки клеток сперматогенного эпителия у ускоренно стареющих мышей SAMP1 представлены на рис.12, из которого видно, что в гонадах 18-28 мес самцов число сперматогониев (стволовые + дифференцирующиеся), пахитенных спермато цито в, округлых сперматид и спермиев существенно ниже, чем у взятых для сравнения молодых половозрелых 2-3 мес и 14 - 15 мес самцов; различия статистически достоверны (при р 0.05). Между тем нельзя не заметить, что уже у 14 - 15 мес животных на фоне все еще численно стабильного спермато гениального компартмента под влиянием эффекта старения наступает изменение в меиотическом звене сперматогенного процесса, о чем сигнализирует достоверно значимое уменьшение числа пахитенных сперматоцитов. Что касается соматических многофункциональных клеток Сертоли, интегрированных в сперматогенную структуру и в этой связи подчиняющихся системному закону, то проведенные подсчеты показали, что со временем данная клеточная популяция практически не изменяется. У 18-28 мес мышей в семенных канальцах открывается сложная, хаотическая картина развития половых клеток. В большинстве случаев структура сперматогенного эпителия глубоко изменяется, теряет стройность и пространственную упорядоченность, атомизируется (рис. 13 а,б). По степени поврежденности сперматогенного эпителия в данной возрастной группе установлены как весьма сильные индивидуальные различия, так и различия между канальцами в пределах гонады. Любопытно отметить, что удельный вес деструктивных канальцев был больше у самых молодых (18 мес) мышей-долгожителей. Рис. 13. Гистологогические срезы семенников мышей линии SAMP1 в возрасте 18-28 мес (а, б); в, г - семенные канальцы эмбрионального типа, обнаруженные в сети семенника (rete testis) 28-мес самца. Сл - слущивания, От - отслоения, Ан - канальцы с аномальной структурой, МКС - молодые клетки Сертоли, КЭТ - канальцы эмбрионального типа, Г - клетки, напоминающие гоноциты. У одного, самого старого самца (28 мес) в области сети семенника (rete testis) было отмечено формирование канальцев, по структуре схожих с канальцами эмбрионального типа. Они содержали клетки, напоминающие гоноциты и молодые клетки Сертоли (рис. 13, в,г). Цитогенетический микроядерный анализ показал, что в семенниках мышей-долгожителей SAMP1 частоты встречаемости аберрантных сперматогониев и округлых сперматид составляют соответственно 37, 32, 31, 28, 50%о (35 ± 3,9) и 52, 27, 23, 24, 25%o (30,2 + 5,5). Как уже было показано выше, частота встречаемости аберрантных ядер в популяциях сперматогониев и округлых сперматид у мышей SAMP1 в возрасте 14 - 15 мес, составляла, соответственно, 18,8 + 5,2%о и 15,1± 3,9%о. Таким образом, у животных, достигших возраста 18-28 мес, уровень герминативных хромосомных мутаций увеличивается примерно в 2 раза по сравнению с предыдущей возрастной группой.
Подсчеты частоты встречаемости спермиев с нарушенной морфологией головок у мышей-долгожителей SAMP1 дали далеко не одинаковые результаты. У трех изученных самцов в возрасте 20, 22, 28 мес число аномальных гамет не выходило за рамки нормы, установленной для мышей разных линий, составляя, соответственно, 1,6, 2,8 и 2,9%; у двух других самцов (18 мес) наблюдался 100%-й выход спермиев с разнообразными нарушениями структуры ядер. Надо сказать, что 100%-ная мутабильность по критерию аномалий головок спермиев, возникающих, как правило, вследствие тонких мутационных изменений и/или микроделеций в сперматогониях или профазных сперматоцитах, ранее не отмечалась даже при экспериментально индуцированном мутагенезе (Захидов, 1993). В литературе сообщения о подобных наблюдениях крайне редки. Например, 100% аномалий форм головок было обнаружено у мышей, гомозиготных по рецессивному гену AZH/AZH, и такие гаметы обладали заметно сниженной оплодотворяющей способностью (Mendoza-Lujambio et зі., 2002). Рис. 14. Головки тестикулярних спермиев мышей-дологожителей SAMP1: Н - нормальные, АГС -аномальные (I - "головастики" и "копьевидные", II - "гвозди со шляпками и без шляпок", III -"треугольники", IY - «мини»). Окраска по Фельгену. Увеличение: об. 100х, ок. 10х. На рис.14 показан весь спектр аномальных форм головок спермиев, условно разделенных на несколько типов. Среди этого качественного многообразия гамет особый интерес вызывают сильно редуцированные структуры игловидной формы, так называемые миниспермии. Предположительно их происхождение связано с мейотическими микроядрами, которые в силу особой природы синцития могут быть вовлечены в процесс дифференцировки постмейотических клеток. Одной из особенностей этого процесса, как известно, является удлинение ядер. С другой
Похожие диссертации на Изучение сперматогенеза у мышей с ускоренным старением
