Аналитические и технологические исследования по разработке новых препаратов на основе коры сирени обыкновенной [Электронный ресурс] Климова Инна Юрьевна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Сирень обыкновенная - перспективный источник для получения нейротропных и иммуномодулирующих препаратов 11

1.1. Историческая справка 12

1.2. Ботанико-фармакогностическая характеристика 16

1.3. Химический состав сирени обыкновенной 18

1.4. Стандартизация ЛРС, содержащего сирингин 23

1.4.1. Стандартизация сырья элеутерококка колючего 25

1.4.2. Стандартизация сырья сирени обыкновенной 26

1.4. Теоретическое обоснование разработки нейротропных и иммуномодулирующих препаратов на основе коры сирени обыкновенной 29

Глава 2. Характеристика объектов и методов исследования... 37

2.1. Объекты исследования 37

2.2. Методы исследования 38

2.2.1. Методы микроскопических исследований ЛРС 38

2.2.2. Методы, использованные для установления строения и идентификации выделенных соединений 40

2.2.3. Методы, использованные для получения лекарственных средств и определения числовых показателей 44

2.2.4. Материалы и методы медико-биологических исследований 46

Глава 3. Исследование химического состава лекарственного сырья сирени обыкновенной 53

3.1. Сравнительное изучение химического состава различных органов сирени обыкновенной 53

3.2. Выделение веществ из коры сирени обыкновенной 57

3.3. Изучение химического структуры и определение физико-химической характеристики выделенных соединений 60

Глава 4. Стандартизация сырья и препаратов сирени обыкновенной 67

4.1. Сырье «Сирени обыкновенной кора» 68

4.2. Качественный анализ сырья и препаратов 70

4.2.1. ТСХ анализ

4.2.2. Спектрофотометрия 75

4.2.3. ВЭЖХ анализ 77

4.3. Количественное определение сирингина в сырье и препаратах 79

4.3.1. Хроматоспектрофотометрия (метод 1) 80

4.3.2. ВЭЖХ-анализ (метод 2) 84

Глава 5. Исследования по обоснованию целесообразности создания фитопрепаратов на основе коры сирени 92

5.1. Разработка технологических способов получения новых фитопрепаратов 93

5.1.1. Разработка препарата «Сирени настойка» 94

5.1.2. Разработка препарата «Сирени сироп» 98

5.2. Обоснование использования разработанных препаратов в медицинской практике 100

5.2.1. Изучение острой и хронической токсичности 101

5.2.2. Изучение нейротропного действия 104

5.2.3. Изучение иммунотропного действия 106

Общие выводы 108

Список литературы 1 10

Приложения 131

• Теоретическое обоснование разработки нейротропных и иммуномодулирующих препаратов на основе коры сирени обыкновенной
• Методы, использованные для установления строения и идентификации выделенных соединений
• Изучение химического структуры и определение физико-химической характеристики выделенных соединений
• Количественное определение сирингина в сырье и препаратах

Введение к работе

Актуальность темы. Расширение ассортимента группы тонизирующих и иммуномодулирующих лекарственных средств (ЛС) путем внедрения в медицинскую практику новых отечественных фитопрепаратов, безопасных, эффективных и доступных по цене широким слоям населения, является социально и экономически важным направлением в современной фармации.

Большинство применяемых препаратов вышеуказанного спектра действия являются индивидуальными химическими веществами, которые нередко грубо вмешиваются в деятельность нервной и иммунной систем и вызывают целый ряд побочных эффектов [85, 95, 97, 104]. В этом плане в качестве сырьевых источников получения мягких тонизирующих и иммуномодулирующих препаратов представляют интерес лекарственные растения, у которых основная группа биологически активных соединений (БАС) представлена фенилпропаноидами [26, 48,61,69, 112].

В частности, при фитохимическом изучении сирени обыкновенной (Syringa vulgaris L., Oleaceae) выявлено, что доминирующим БАС коры данного растения является циннамилгликозид сирингин (элеутерозид В) [64, 73, 75, 77], который был предложен учеными СамГМУ и ВШЇАРа в качестве государственного стандартного образца (ГСО) для стандартизации сырья и препаратов элеутерококка колючего (Запесочная Г.Г., Куркин В.А., 1996). Кроме того, данными исследователями установлено, что содержание сирингина в коре сирени на порядок больше такового в корневищах элеутерококка (ОД %) [79, 113], поэтому именно кора сирени обыкновенной предложена в качестве источника получения ГСО сирингина (В ФС 42-2088-92).

Указанное соединение данного растения обусловливает адаптогенные и им-муномодулирующие свойства препаратов элеутерококка колючего (экстракт элеутерококка сухой и экстракт элеутерококка жидкий) [40, 79, 78], что позволяет

5 по аналогии с ними прогнозировать подобный спектр фармакологической активности и для препаратов сирени обыкновенной. Кроме того, высока вероятность, что эффективность новых препаратов будет выше, так как ранее было указано содержание сирингина в коре сирени обыкновенной на порядок выше такового в корневищах элеутерококка {Eleutherococcus senticosus Maxim, Araliaceae) [79].

Оценка качества лекарственного растительного сырья (ЛРС) сирени обыкновенной осуществляется в соответствии с ВФС 42-2106-92 «Кора сирени обыкновенной» также по содержанию сирингина.

Необходимость совершенствования нормативной базы возникает в связи с тем, что современные тенденции развития методов стандартизации лекарственных средств служат предпосылкой для формирования новых фармакопейных требований к их качеству (Арзамасцев А.П., 2000; Багирова В.Л., 2001).

В отношении обсуждаемого объекта целесообразным представляется пересмотр разделов «Качественные реакции» и «Количественное определение», что обусловлено расширением спектра представлений о химическом составе и повышением уровня требований к объективности и унифицированности методов анализа сырья, фитосубстанций и лекарственных средств, а также включения некоторых новых разделов (Самылина И.А., 1995). Решение вопросов стандартизации новых лекарственных средств замыкается на разработке объективных и унифицированных методов анализа сырья и препаратов по ведущей группе БАС (Куркин В.А., 2002; 2004).

Таким образом, представляется актуальным дальнейшее фитохимическое исследование сырья сирени обыкновенной, в плане разработки новых препаратов на ее основе, обладающих иммуномодулирующими и тонизирующими свойствами, а также поиск новых путей к решению проблемы химической стандартизации сырья и препаратов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение аналитических и технологических аспектов разработки новых лекарственных средств на основе коры сирени обыкновенной, обладающих тонизирующими и иммуномодулирующими свойствами.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

8. Изучение химического состава коры сирени обыкновенной произрастающей в Самарской области.

9. Разработка подходов к стандартизации сырья и препаратов коры сирени обыкновенной с позиций определения ведущей группы БАС и с учетом принципа унификации методик в ряду ЛРС - субстанция - лекарственная

10. Ijkqpa&oTKa методик качественного анализа ЛРС «Кора сирени обыкновенной».

11. Разработка методик количественного анализа коры сирени обыкновенной.

12. Разработка методик качественного и количественного анализа препаратов «Сирени настойка» и «Сирени сироп».

13. Разработка и изучение в процессе хранения числовых показателей препаратов: «Сирени настойка» и «Сирени сироп».

14. Обоснование целесообразности внедрения новых лекарственных препаратов «Сирени настойка» и «Сирени сироп» в качестве тонизирующих и иммуномо-дулирующих средств в медицинскую практику.

15. Разработка и оформление соответствующей нормативной документации.

Научная новизна: В результате изучения химического состава коры сирени обыкновенной (Syringa vulgaris. L.), произрастающей в Самарской области, выделено и идентифицировано 9 индивидуальных соединений, относящихся к фе-нольным соединениям. Установление структуры и изучение физико-химических свойств выделенных соединений проводилось методами УФ-, Н-ЯМР-спектроскопией и масс-спектрометрией, наряду с традиционными методами хи-

7 мического анализа. Для коры сирени обыкновенной произрастающей в Самарской области данные соединения выделены впервые.

Показана целесообразность проведения стандартизации сырья и препаратов сирени обыкновенной по ведущей группе БАС - фенилпропаноидам, и в частности, по содержанию сирингина.

Разработаны новые унифицированные методики качественного и количественного анализа сырья «Сирени обыкновенной кора» и препаратов «Сирени настойка» и «Сирени сироп» с использованием ГСО сирингина методами тонкослойной хроматографии (ТСХ), спектрофотометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

На основе изучения химического состава сырья и с учетом методологических подходов по выделению целевой группы действующих веществ выполнены фитохимические и аналитические исследования по разработке новых ЛС «Сирени настойка» и «Сирени сироп».

Практическая значимость: Разработаны методики качественного и количественного анализа коры и препаратов сирени обыкновенной основанные на обнаружении и количественного определения доминирующего фенилпропанои-да - сирингина - с использованием методов ТСХ, спектрофотометрии и ВЭЖХ.

Определены и изучены в процессе хранения числовые показатели качества препаратов «Сирени настойка» и «Сирени сироп», в том числе «Содержание сирингина», «Сухой остаток», «Концентрация спирта», «Микробиологическая чистота», а также установлены сроки годности.

Показана на доклиническом этапе целесообразность использования разработанных препаратов «Сирени настойка» и «Сирени сироп» в качестве тонизирующих и иммуномодулирующих средств в медицинской практике.

Оформлен и принят к рассмотрению в Фармакопейный государственный комитет Министерства здравоохранения и социального развития РФ проект ФС

8 «Сирени обыкновенной кора» (письмо № 131 от 27.01.05) для включения в ГФ

XII РФ, а также подготовлены проекты ФСП «Сирени настойка» и ФСП «Сирени

сироп».

Результаты исследований используются в научных изысканиях и в учебном процессе на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии Самарского государственного медицинского университета (акты внедрения от 15.06.2005).

Положения, выдвигаемые на защиту:

16. Результаты изучения химического состава коры сирени обыкновенной, произрастающей в Самарской области.

17. Данные исследований по разработке методов стандартизации сырья и препаратов сирени обыкновенной. ₍

18. Методики качественного и количественного анализа ЛРС и препаратов «Сирени настойка» и «Сирени сироп» с использованием ГСО сирингина.

19. Результаты разработки и определения показателей качества ЛРС и препаратов «Сирени настойка», «Сирени сироп».

20. Технология получения препаратов «Сирени настойка» и «Сирени сироп».

21. Результаты доклинических исследований новых лекарственных средств на основе коры сирени обыкновенной.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «Самарский государственным медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (Государственная регистрация № 01200105332) и Республиканских программ:

1. «Совершенствование лекарственного обеспечения населения и лечебно-профилактических учреждений в рыночных условиях» по теме: «Создание лекарственных средств природного происхождения антимикробного,

9 адаптогенного и гепатопротекторного действия» (Государственная регистрация

№01990005277).

2. «Разработка методик качественного и количественного анализа сырья и препаратов лекарственных растений, содержащих фенилпропаноиды и флаво-ноиды» (Государственная регистрация № 01990005277).

Апробация работы и публикации Материалы работы доложены и обсуждены на XXII международной конференции по полифенолам (Хельсинки, 2004); на IV Международном симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования" (Пущино, 2004); на IX и XI Российских национальных конгрессах "Человек и лекарство" (Москва, 2002-2004); на VI и VII Всероссийском конгрессе "Экология и здоровье человека" (Самара, 2001; 2002); на Межрегиональной конференции «Аспирантские чтения» (Самара 2002; 2003; 2004); на VI Симпозиуме по фенольным соединениям (Москва, 2004); на 58-й Межрегиональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2003);

Основное содержание диссертации опубликовано в 16 научных работах.

Объем и структура работы: Диссертационная работа изложена на 132 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц, 9 рисунков. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания объектов и методов исследования, 3-х глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждение, общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 202 источника, из которых 71 на иностранных языках.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, отмечена новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту.

Теоретическое обоснование разработки нейротропных и иммуномодулирующих препаратов на основе коры сирени обыкновенной

Одной из важнейшей задач современной фармации является расширение отечественного ассортимента препаратов с адаптогенной, тонизирующей и им-муномодулирующей активностью. Это обусловлено рядом факторов современного напряженного ритма жизни населения, неблагоприятной экологической обстановкой, а также перемещениями людей, связанных с сезонными работами и миграциями в новые районы, зачастую с необычными для организма климатическими условиями. Истощение адаптационных механизмов и повреждающие факторы формируют общие звенья патогенеза различных нервно-психических заболеваний, ослабления иммунной системы (иммунодефициты, опухоли), угнетения антиоксидантной и антитоксической функции печени, развития гипертонии, диабета и многих других нозологии, в основе которых лежат структурные нарушения клеток и их функционирования [59, 97, 135]. Таким образом, возникает проблема повышения неспецифической резистентности организма.

Общепризнанно, что сопротивляемость повреждающим агентам выше у людей, тренированных к физическим нагрузкам, холоду и т.д. Однако этот путь повышения адаптационных способностей организма довольно длителен и не всегда приемлем в отношении больных. Для этих целей применяют специальные пищевые рационы и фармакологические средства, с помощью которых достигаются желаемые результаты за сравнительно короткое время [7, 18, 126]. К «иммунотропным лекарственным средствам» относят препараты корректирующие процессы иммунитета (иммуномодуляторы, иммунокорректоры) (Машковский М.Д., 2000). Множество препаратов, действующих на иммунную систему подразделяют на три группы [21, 24, 32]: Группа 1 - лекарственные средства с четко охарактеризованным направленным действием на иммунную систему (циклоспорин A, FK 505, антитела, цито-кинин и др.). Курс лечения данными препаратами проводится под обязательным иммунологическим контролем. Группа 2 - средства более широкого действия на разные параметры иммунной системы (препараты тимуса, костного мозга, диуцифон, нуклеонат натрия, и др.). Иммунологический контроль лечения проводится более простыми тестами. Группа 3 - адаптогены или подобные им средства с возможным действием на иммунную систему (растительные (элеуторокок, эхинцея), витамины и т.п.) без обязательных требовании к иммунологическому контролю.

Своевременный прием адаптогеннов (в утреннее и обеденное время) позволяет восстановить суточные биоритмы, снизить развитие соматической патологии, вызванной психогенными факторами, улучшить качество жизни, смягчить в условиях дезаптации отрицательное воздействие на человека стрессовых ситуаций, а также неблагоприятных экологических и производственных факторов.

Многочисленные исследования [21, 24, 95, 97, 104] показали, что синтетические препараты 1 и 2 групп грубо вмешиваются в деятельность иммунной системы и оказывают токсическое действие на органы и системы организма (нервную, эндокринную, кроветворную) [85, 95, 97, 104]. Более того, при систематическом приеме данных групп ЛС, часто наблюдается развитие состояния имму-нодепрессии после первоначально положительного эффекта [21, 97, 116]. Таким образом, возникает потребность в препаратах безопасных для организма, удобных в применении и экономически доступных для массового потребителя, что позволит реально использовать лечебно-профилактические средства на основе иммуномодуляторов для профилактики наиболее распространенных заболеваний: злокачественных новообразований, атеросклероза, хронических инфекций и ряда других патологических процессов.

Перечисленным выше требованиям отвечают некоторые классы химических соединений, которые широко распространены в природных источниках -прежде всего каротиноиды, токоферолы, некоторые водорастворимые витамины. макро- и микроэлементы, полисахариды и др. [6, 11, 18, 24, 59, 97, 126, 135].

В этом плане, интерес представляет относительно новый класс природных соединений - фенилпропаноиды (Куркин В.А., 1992). Они обладают разнообразными биологическими свойствами, что дает основание для создания на их основе эффективных тонизирующих, иммуностимулирующих, гепатопротектор-ных, антибластомных, антимикробных и противовоспалительных препаратов [27, 61, 70, 75, 85, 112]. Особый интерес представляют гликозиды коричных спиртов (табл. 3), которые обладают выраженными иммуномодулирующими и стимулирующими свойствами [15, 25, 95]. При этом выявлена зависимость между биологической активностью и структурой фенилпропаноидов [79, 230, 309].

Растительные препараты обладают низкой токсичностью при достаточно высокой эффективности, широким спектром терапевтического действия, комплексным органопротекторным действием на организм, отличаются минимумом побочных эффектов и относителной дешевизной по сравнению с синтетическими препаратами. При этом наряду с применением фармакопейных растений идет целенаправленный поиск новых лекарственных растений, перспективных для создания на их основе эффективных ЛС обладающих более мягкими адаптоген-ным, тонизирующим и иммуностимулирующим действиями.

Методы, использованные для установления строения и идентификации выделенных соединений

Отсутствие примесей в получаемых соединениях контролировали методом тонкослойно-хроматографического (ТСХ) анализа в нескольких системах с использованием различных способов детекции. Для ТСХ-анализа экстрактов из растительного сырья и выделенных соединений использовали пластинки "Силу-фол УФ-254" (Чехия) (активация при температуре 100-105С в течении 1 ч) и "Сорбфил ПТСХ-ПА-УФ" (Россия). Хроматографическое разделение веществ осуществлялось в системах растворителей А-Г. Бумажную хроматографию Сахаров и других компонентов осуществляли на бумаге FN-11, FN-15 в нисходящем токе растворителей. При этом использовались системы растворителей Д-Ж. Хроматографический анализ выполнен с использованием следующих систем растворителей при комнатной температуре: А - хлороформ-метанол-вода, 26:14:3 Б - хлороформ-метанол, 6:1 В - хлороформ-этанол, 2:1, 4:1, 6:1, 9:1, 19:1 Г - бензол-ацетон, 4:1 Д - этилацетат-н-пропанол-вода, 7:2:1 Е - 15% уксусная кислота Ж - н-бутанол-уксусная кислота-вода, 4:1:2. Обнаружение пятен проводили УФ-облучением (254 и 366 нм) до и после обработки хроматограмм 1 % спиртовым раствором А1СЬ (флавоноиды и др. компоненты), обработкой 1 % спиртовым раствором FeCb, и содовым (Ыа2СОз) свежеприготовленном раствором диазобензолсульфокислоты (фенольные соединения), 20 % раствором серной кислоты и 10 % раствором фосфорновольфрамовой кислоты с последующим нагреванием при 100-120 С (монотерпены, стери ны). Для проявления Сахаров использовали анилин-фталат в н-бутаноле, насыщенном водой, при нагревании хроматограмм (105 С). Метод спектрофотометрии.

Спектрофотометрическое исследование спир-то-водных извлечений проводили при качественной и количественной оценки содержания сирингина в сырье и препаратах коры сирени обыкновенной. Для этих целей использовали метод прямой спектрофотометрии на спектрофотометрах СФ-26 или СФ-46 в кюветах с толщиной слоя 10 мм. Раствором сравнения служил 40 и 95 % этиловый спирт. Кроме того, метод УФ-спектроскопии использовали для идентификации выделенных веществ. Вещества сушили в вакуум-пистолете при температуре 48-60 С над пятиокисью фосфора и затем определяли температуру плавления на блоке Кофлера. Уф-спектры снимали на приборе Specord М 40 и Hitachi-EPS-ЗТ в этаноле. Применяли реагенты сдвига: 0,1 М раствор метилата натрия, свежеплавленный ацетат натрия, безводная борная кислота (или ее насыщенный раствор в метаноле), 2% раствор безводного А1С13, 10%НС1. ВЭЖХ-анализ проводили на хроматографе "Милихром-1" (НПО "Науч-прибор"). При этом были найдены следующие оптимальные условия хромато-графирования: колонка - обращенно-фазовая КАХ (2 х 100 мм, сталь) с модифицированным октадециленовыми группами силикагелем ("Separon С 18", d= 5 мкм, с эффективностью 4500 т.т.); подвижные фазы (элюент) - этанол - 0,2 %-ная ледяная уксусная кислота в соотношении 12:88 ; скорость элюирования - 100 мкл/мин; прокачиваемый объем элюента - 2000 мкл; объем пробы 30 мкл; детектор - ультрафиолетовый, длина волны детектирования 266 нм, диапазон чувствительности "3,2"; самописец КСП 4; скорость подачи бумаги - 60 мм/час. При определении компонентного состава сирени обыкновенной использовались две элюентные смеси - 12 % этиловый спирт (смесь 1) и 25 % этиловый спирт (смесь 2). При этом детектирование веществ осуществляли при двух длинах волн (266 и 280 нм.).

Спектральные и физико-химические свойства веществ изучены с использованием следующих методов: УФ-, Н-ЯМР-спектроскопия и масс-спектрометрия. Спектры ЯМР- Н записаны на приборе Gemini-200 фирмы Varian с рабочей частотой 200 МГц. Величины химических сдвигов приведены по шкале 5. Внутренний стандарт - тетраметилсилан (=0). Приняты следующие сокращения: с-синглет, д-дублет, т-триплет, дд-двойной дублет, кв-квартет, м-мультиплет. Масс-спектры электронного удара выполнены на приборе Varian СН-8 при энергии ионизирующих электронов 70 эВ. Температура ионного источника варьировалась от 30 до 300 С. Калибровка масс-спектрометра проводилась с помощью перфторкеросина. Углы вращения получали на поляриметре Polamat А при 546 нм с пересчетом для 589,3 нм. Качественные реакции: 1. Цианидиновая реакция (проба Синода). К 1-2 мг исследуемого вещества, растворенного в 1 мл спирта, прибавляют 5 капель концентрированной соляной кислоты и 5-10 мг магния. Образуется красно-малиновой окрашивание (флаво-ноиды) [123]. 2. Цианидиновая реакция по Брианту. Раствор, полученный по реакции 1, разбавляют водой и обрабатывают октиловым спиртом. В случае агликона окраска переходит в органическую фазу, а в случае гликозида - остается в водном растворе [123]. 3. Госсипетоновая реакция. К спиртовому раствору флавоноида добавляют свежевозогнанный п-бензохинон. Красно-коричневая окраска или осадої: свидетельствуют о наличии /7-дигидроксигруппировки [37, 123].

Изучение химического структуры и определение физико-химической характеристики выделенных соединений

В результате изучения химического состава коры сирени обыкновенной (Syringa vulgaris. L.), произрастающей в Самарской области, выделено 9 индивидуальных соединений, относящихся к фенилпропаноидам (1-5), простым фенольным соединениям (6-8) и иридоид (9). Препаративное разделение веществ осуществлялось методом колоночной хроматографии. Для элюирования использовали смеси растворителей: хлороформ - этиловый спирт, этиловый спирт - вода в различных соотношениях. Эффективное разделение и очистка веществ достигалось чередованием сорбентов (силикагель, полиамид, сефадекс) и соответствующих систем растворителей. Кристаллизация и перекристаллизация веществ осуществлялась с помощью гек-сана, этанола, хлороформа, метанола, воды. Отсутствие примесей в выделенных соединениях контролировалось методом ТСХ в нескольких системах и с использованием различных способов детекции. Для установления структуры выделенных веществ использованы данные УФ-, Н-ЯМР- и масс-спектров, а также результаты химических превращений и непосредственное сравнение с достоверными образцами веществ. Фрагмент структурных исследований выделенных соединений на примере сирингина и (+) - Ларицирезинол-4-О- Р -D- глюкопиранозида представлены на рисунках 5.1 и 5.2, соответственно. Сирингіні (1) (4-0- (З -D- глюкопиранозид синапового спирта). Игольчатые кристаллы белого цвета состава С17Н24О9, т. пл. 190 - 192 (вода), [ ос ]D 29.0 (этанол), Ятах(ЕЮН) 266 нм, Н-ЯМР-спектр в дейтеропиридине (250 МГц. м.д.): 6,88 (д, 16 Гц, Н - 7), 6,86 (с, Н - 2,6), 6,60 (дт, 6 и 16 Гц, Н - 8), 6,65 (д, 7 Гц, Н-1!), 4,1-4,7 (м, 2Н - 9 + 6Н глюкозы), 3,76 (с, 6Н, 2СН30). Масс-спектр при 160 nC, m/z (интенсивность, %): 210 (100), 209 (3). 208 (5), 194 (15), 183 (4), 182 (12), 181 (11), 177 (26), 168 (4), 167(35), 154(20), 149(28), 124 (10),121(15),105(10).103(4),91(17). Кониферин (2) (4-О-Р-О-глюкопиранозид кониферилового спирта).

Кристаллы белого цвета состава Ci6H2208, т. пл. 184 - 185 (спирт), А.,11ах(ЕЮН) 266 пл, 258 нм. Масс-спектр при 190 С, m/z (интенсивность, %): 180 (100), 152 (3), 153(0,6),151 (2,5),138(4),137(26), 124 (20), 115 (1), 103 (4),91 (4). Соединения 1 и 2 при ферментативном гидролизе [3-глюкозидазой дают одинаковый углеводный фрагмент глюкозу и агликоны - синаповый (М+ 210) и конифериловый спирт (М+ 180) соответственно. Оба вещества не реагируют с диазотированной сульфаниловой кислотой (ароматическая ОН-группа гликозилирована) и имеют характерное синее окрашивание после проявления 16%-ным раствором серной кислоты (110С) на пластинках силуфола. (+)-Ларицирезинол-4-0-[3-В-глюкопиранозид (3). аморфное вещество состава СгбНзаОц, [ « ]D 9 +18.2 (этанол)Дтах(ЕЮН) 227,282 нм, Н-ЯМР-спектр в дейтеропиридине (250 МГц, м.д.): 7,08 (д, 9 Гц, Н - 5!), 6,89 (д, 2 Гц, Н - 2 ), 6,81 (дд, 2 и 9 Гц, Н - 6!), 6,77 (д, 2 Гц, Н - 2), 6,74 (дд, 2 и 9 Гц, Н - 6), 5,27 (м, Н -2!!,Н- 3!!), 5,17 (т, 9,5 Гц, Н-4!!), 4,95 (д, 7 Гц, Н- 1!!), 4,8 (д, 6 Гц, Н- Т ), 4,36 (дд, 10 и 7 Гц, Н-9!), 4,28 (дд, 5 и 12 Гц, Н - 6!!), 4,20 (дд, 7 и 10 Гц, Н- 9!), 4.16 (дд, 2 и 12 Гц, Н- 6"), 4,09 (дд, 8 и 6 Гц, Н - 9), 3,83 (с, СН30), 3,82 (с, СН30). Актеозид (4) и форзитиазид (5). Светло-желтые аморфные вещества, имеющие одинаковый состав С19Н36О15 и УФ-спектры (А.шах (EtOH) 330 нм). m/z (интенсивность, %) фрагментов производных фенилэтилового спирта в масс-спектрах составила - соединения 4 при 260 С: 154 (53), 137 (46), 136 (39), 123 (100). Масс-спектр при 190 С, m/z (интенсивность, %): 180 (100), 152 (3), 153 (0,6), 151 (2,5), 138 (4), 137 (26), 124 (20), 115 (1), 103 (4), 91 (4); соединения 5 при 270 С, m/z (интенсивность, %): 154(52), 137(49), 136(35), 123 (100). На основании результатов кислотного и щелочного гидролиза сделаны выводы о том, что соединения 4 и 5 содержат одинаковые фрагменты (гидрокситирозол (IV), кофейную кислоту (М+ 180), глюкозу и рамнозу) и отличаются строением углеводной части (рунгиозид и рутинозид соответственно). Сопоставление результатов химических превращений, а также данных УФ-, ИК-, ПМР-, и масс-спектров позволило идентифицировать соединения 4 и 5 с актеозидом и форзитиазидом соответственно. Тирозол (6) (4-гидрокси-Р-фенилэтиловый спирт).

Бесцветные игольчатые кристаллы состава СзНюОг (М+ 138), т.пл. 92-93С (хлороформ); A.I1U1N (EtOH) 224, 278 нм. Интенсивность (m/z, %) фрагментов производного фенилэтилового спирта в масс-спектрах при 70 С 138 (М+) (24), 107 (100). Салидрозид (7) (Тирозол-0-(3-В-глюкопиранозид). Бесцветные кристаллы состава С14Н20О7, т.пл. 160-162С (из смеси хлф-метанол, 4:1); УФ- спектр: Хпгах max (EtOH) 224, 279 нм. Интенсивность (m/z, %) фрагментов производного фенилэтилового спирта в масс-спектрах при 160 С 138 (12), 121 (100), 120 (89), 107 (26). При кислотном и ферментативном гидролизе [3-глюкозидазой салидрозид расщепляется на тирозол и глюкозу. 3,4-Дигидрокси-р-фенилэтиловый спирт (8) (гидрокситирозол).

Светло-желтое аморфное вещество состава C8Hi0O3 (М+ 154), A.max (EtOH) 222, 282 нм; Н3В03 289 нм; NaOMe 271, 429 нм. m/z, (интенсивность, %) при 60 С 154 (М+) (39),123(100). Олеуропеин (9) — аморфное вещество светло-желтого цвета состава С Н- Ор Н20, [ ос ]D2() - 157С (с 0,4, этанол) А,тах (ЕЮН) 232, 282 нм. Вещество при ацетилировании дает гексаацетат, в составе которого 2 ароматические ацетогруппы. Данные соединения (1-9) были описаны для коры сирени обыкновенной из сырья Самарского происхождения выделены впервые. Соединение 4 было выделены ранее из цветков данного растения. Полученные в ходе изучения лекарственного растительного сырья сирени обыкновенной (Syringa vulgaris L.) данные по химическому составу позволили научно обосновать подходы к химической стандартизации сырья и препаратов с использованием соответствующих ГСО, разработать оптимальные технологические схемы для получения целевых групп БАС, обладающих тонизирующими и иммуномодулирующими свойствами.

Количественное определение сирингина в сырье и препаратах

Как отмечалось, для решения вопроса стандартизации сырья коры сирени, ранее был предложен хроматоспектрофотометрический метод определения сирингина в коре сирени (детекция в УФ-свете при длине волны 254 нм и спектро-фотометрия элюатов при длине волны 266 нм), с использованием ГСО сирингина (Куркин В.А., Запесочная Г.Г., 1996). Метод сложен в исполнении и поэтому нами предлагается в качестве альтернативного метода качественного и количественного определения сирингина в сырье и препаратах ВЭЖХ-анализ. Преимущества данного метода заключается в его универсальности и более легкой воспроизводимости .

Для контроля качества препаратов, как и в случае коры сирени, предлагается качественное и количественного определения элеутерозида В с использованием ГСО сирингина. Таким образом, для контроля качества сырья и препаратов сирени предлагается два метода количественного определения сирингина: хроматоспектрофото-метрический метод и в качестве альтернативного - ВЭЖХ-анализ.

В предложенной методике количественного определения использовали образец ГСО сирингина - доминирующего и специфического фенилпропаноида в сырье и настойке сирени обыкновенной. Кроме того, в пользу данного выбора говорит и тот известный факт, что именно сирингин обуславливает в основном специфическую фармакологическую активность препаратов сирени.

Для определения сирингина в сырье и препаратах «Сирени настойка» и «Сирени сироп» использовали хроматоспектрофотометрический метод, заключающийся в хроматографическом отделении его от сопутствующих веществ с использованием системы: хлороформ - метанол - вода 26:14:3 и в последующем спектрофотометрическом определении [73]. Изучение условий хроматографического разделения компонентов анализируемых объектов показало, что оптимальной концентрацией наносимого экстракта коры является 30 мкл раствора ГСО сирингина - 40 мкл. Приготовление извлечений, раствора ГСО и условия хроматографирования описаны ниже.

Элюировании сирингина с вырезанных зон силуфола проводили 70 % этиловым спиртом при комнатной температуре в течении 30 минут при постоянном перемешивании [73]. С целью исключения ошибок, связанных с неполной десорбцией вещества, на хроматограмму наносили раствор стандартного образца, что позволяет исключить также приборную ошибку. Спиртовой раствор элюатов имеет максимум поглощения при длине волны 266 нм, причем характер УФ-спектра (Specord М 40, ЕЮН) практически совпадает с таковым раствора ГСО сирингина (рис.8). В данной области спектра растворы сирингина имеют прямопропорциональную зависимость оптической плотности от концентрации вещества [73], что позволяет использовать прямую спектрофотометрию для количественного определения сирингина после отделения его от сопутсвующих веществ. Анализ серии образцов сырья, проведенных с использованием обсуждаемой методики подтверждает, что нижний предел содержания сирингина в доброкачественном ЛРС равен 2,0 %. Анализ серии образцов препаратов «Сирени настойка» и «Сирени сироп», проведенных с использованием обсуждаемой методики показал, что в качестве нижнего предела содержания сирингина в настойке 1:5 может быть рекомендован не менее 0,4 и 0,02 % соответственно, что согласуется с ранее полученными аналогичным образом данными по содержанию сирингина в сырье (не ниже 2,0 %), а также доказывает состоятельность предложенной технологической схемы получения «Сирени настойка», обеспечивающей исчерпывающее извлечение целевых веществ.

Метрологические характеристики хроматоспектрофотометрической методики количественного определения сирингина в ЛРС и препаратов «Сирени настойка» и «Сирени сироп» даны по результатам 11 определений и представлены в таблице 7.

Похожие диссертации на Аналитические и технологические исследования по разработке новых препаратов на основе коры сирени обыкновенной [Электронный ресурс]

Исследования по разработке и стандартизации комбинированного антимикробного и регенерирующего препарата на основе лекарственного растительного сырьяШагалиева Наталья Рашидовна

Разработка методик и исследование качества сырья и препаратов пиона уклоняющегосяКолпакова, Марина Вячеславовна

Разработка новых лекарственных препаратов на основе кристафона и его серебряной солиЧудецкая Юлия Викторовна

Разработка и стандартизация лекарственного препарата на основе аминокислот (МР-33) и обоснование экономической эффективности его производстваБыканова Светлана Николаевна

Разработка методов анализа и оптимизация состава лекарственного препарата на основе гидролизата молочнокислых бактерийСенченко Сергей Петрович

Разработка методик анализа и норм качества новых лекарственных препаратов на основе "бишофита энтерального"Гюльбякова, Христина Николаевна

Разработка стандартного образца для стандартизации лекарственного растительного сырья "Трава донника лекарственного", субстанции и препаратов на его основеЛожкин Александр Васильевич

Фармакогностические исследования по разработке лекарственных растительных средств противовоспалительного, ранозаживляющего и антиаллергическогодействияНикитина, Татьяна Ивановна

Исследования по разработке и стандартизации растительного средства с противоязвенной активностьюСтарцева, Людмила Викторовна

Исследования по разработке и стандаоризации растительного средства с противоязвенной активностьюСтарцева, Людмила Викторовна