Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Фармакологические средства коррекции физической работоспособности, рекомендуемые для применения в практике, методы их анализа 15
1.1 Характеристика работоспособности и процесса развития утомления 15
1.2 Общая характеристика фармакологических средств для коррекции работоспособности 17
1.3 Методы анализа биологически активных веществ экстракта левзей 24
1.4 Методы анализа глюкозамина сульфата и продуктов его деструкции 29
1.5 Методы анализа кальция глицерофосфата и продуктов его деструкции 32
1.6 Методы анализа калия оротата 36
Заключение по обзору литературы 38
Глава 2 Изучение фармакологической активности лекарственного средства "Энергодарин" 41
2.1 Постановка эксперимента, материалы и методы 42
2.1.1 Оценка антиоксидантной активности компонентов ЛС "Энергодарин" 42
2.1.2 Исследование фармакологической активности 1 ЛС "Энергодарин" (тест "принудительное плавание") 43
2.1.3 Оценка стресс-протективного эффекта и анаболического действия ЛС "Энергодарин" и его влияния на гематологические и биохимические показатели (тест "принудительное плавание") 45
2.2 Результаты изучения фармакологической активности лекарственного средства "Энергодарин" 46
2.2.1 Оценка антиоксидантной активности (АОА) компонентов ЛС "Энергодарин" 46
2.2.2 Оценка влияния ЛС "Энергодарин" на физическую работоспособность в тесте "принудительное плавание" 47
2.2.3 Оценка стресс-протективного эффекта и анаболического действия комплексного ЛС "Энергодарин" на фоне физической нагрузки 52
2.2.4 Оценка действия ЛС "Энергодарин" на гематологические и биохимические показатели на фоне физической нагрузки 54
Выводы по главе 2 57
Глава 3 Идентификация ингредиентов ЛС "Энергодарин" 59
3.1 Идентификация калия оротата в ЛС "Энергодарин" 60
3.2 Идентификация кальция глицерофосфата в ЛС "Энергодарин" 62
3.3 Идентификация глюкозамина сульфата в ЛС "Энергодарин" 63
3.4 Идентификация биологически активных веществ (фитоэкдистероидов) экстракта левзей в ЛС "Энергодарин" 65
Выводы по главе 3 68
Глава 4 Разработка методик количественного определения ингредиентов в ЛС "Энергодарин" 69
4.1 Количественное определение калия оротата в ЛС "Энергодарин" 69
4.1.1 Определение правильности методики 69
4.1.2 Определение воспроизводимости методики 73
4.2 Количественное определение кальция глицерофосфата в ЛС "Энергодарин" комплексонометрическим титрованием 74
4.2.1 Определение правильности методики 75
4.2.2 Определение воспроизводимости методики 78
4.3 Количественное определение глюкозамина сульфата в ЛС "Энергодарин" 78
4.3.1 Определение правильности методики 79
4.3.2 Определение воспроизводимости методики 82
4.4. Количественное определение содержания фидоэкдистероидов методом ВЭЖХ 83
4.4.1 Определение содержания ФЭС в экстракте левзей жидком методом ВЭЖХ с применением внешнего стандарта 84
4.4.2 Определение содержания ФЭС в экстракте левзей жидком методом ВЭЖХ с применением внутреннего стандарта 88
4.4.3 Определение содержания ФЭС в ЛС "Энергодарин" методом ВЭЖХ с применением внутреннего стандарта 96
4.5 Количественный и качественный анализ катионов в ЛС "Энергодарин" методом капиллярного электрофореза 100
Выводы по главе 4 109
Глава 5 Изучение стабильности компонентов ЛС "Энергодарин" и его стандартизация 110
5.1 Изучение стабильности 110
5.2 Разработка норм качества ЛС "Энергодарин" 118
5.2.1 Описание ЛС "Энергодарин" 118
5.2.2 Определение подлинности ЛС "Энергодарин" 119
5.2.3 Определение посторонних примесей в ЛС "Энергодарин" 119
5.2.4. Установление потери в массе при высушивании ЛС "Энергодарин" 120
5.2.5 Количественное определение ЛС "Энергодарин" 120
Выводы по главе 5 124
Общие выводы 125
Список используемых литературных источников 127
- Общая характеристика фармакологических средств для коррекции работоспособности
- Оценка влияния ЛС "Энергодарин" на физическую работоспособность в тесте "принудительное плавание"
- Определение содержания ФЭС в экстракте левзей жидком методом ВЭЖХ с применением внутреннего стандарта
- Изучение стабильности
Введение к работе
Актуальность. Проблема повышения физической работоспособности и ускорения протекания восстановительных процессов после физических нагрузок всегда представляла большой интерес для медицинской науки.
В последние годы эта проблема не только не разрешается, но и усугубляется в связи с изменением характера человеческого труда, распространением психоэмоциональных стрессов; вредными воздействиями окружающей среды и интенсификацией производственной деятельности. Это в первую очередь касается лиц, занятых в тех сферах деятельности, где физическая работоспособность является неотъемлемым условием выполнения поставленных задач.
В связи с этим в фармацевтической и медицинской науке во многих странах продолжаются поиски способов и средств, позволяющих обеспечить высокий уровень физической работоспособности и здоровья в современных условиях жизни. В настоящее время наряду с физическими и медицинскими процедурами для этой цели разрабатываются и внедряются в практику лекарственные средства и биологически активные добавки. Однако многие из них не могут найти широкого применения из-за того, что большинство из них относятся к так называемым "допингам" и запрещены к применению, так как обладают выраженными побочными эффектами. Кроме того, большинство из этих препаратов разработаны за рубежом и не находят применения в нашей стране.
В то же время существует возможность создания лекарственных средств, которые позволяют добиться нужного эффекта и не относятся к "допингу". Такие возможности открывают создание комбинированного лекарственного средства, содержащего нетоксичные, безвредные, некумулирующие вещества, с достаточно мягким действием, без каких-либо опасностей развития привыкания, и особенно пристрастия.
Ключевое положение в группе лекарственных средств (ЛС), которые не являются допингами и могут быть рекомендованы для повышения физической работоспособности, занимают нестероидные вещества растительного происхождения - представители так называемых фитоэкдизонов, выделяемых из корней левзеи софлоровидной.
Еще одним из ЛС является калия оротат, применяемый в целях профилактики нарушений со стороны миокарда при напряженных физических нагрузках.
Определенный практический интерес в плане влияния на физическую работоспособность представляет ЛС - кальция глицерофосфат, проявляющий как общеукрепляющее и тонизирующее действие, так и усиливающий анаболические процессы. Включение глюкозамина сульфата в состав комбинированного лекарственного средства оправданно, так как физические нагрузки могут привести к функциональным перегрузкам, травмам и заболеваниям опорно-двигательного аппарата; в решении данной задачи хондропротективные препараты занимают ведущее место.
Есть предположение, что сочетание этих компонентов проявит синергизм, благодаря которому возможно достижение необходимого эффекта – повышения физической работоспособности (Р.Д. Сейфулла, 2000). Разработка отечественного комбинированного лекарственного средства для повышения работоспособности позволит в определенной степени решить многие задачи по профилактике и лечению заболеваний, вызванных физическими перегрузками в труде и спорте.
Цель и задачи исследований
Целью настоящей работы является обоснование состава и норм качества многокомпонентного лекарственного средства для повышения физической работоспособности.
Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
1. На основе изучения сведений по фармакологическому действию лекарственных средств (ЛС) и биологически активных добавок обосновать состав комбинированного лекарственного средства для повышения работоспособности.
2. Изучить специфическую активность предлагаемого ЛС.
3. Осуществить выбор основных критериев качества, необходимых для стандартизации предложенного ЛС.
4. Разработать методики идентификации компонентов ЛС.
5. Предложить методики количественного определения компонентов ЛС и провести их валидационную оценку.
6. Исследовать стабильность данного ЛС с целью обоснования сроков годности.
Научная новизна
На основе изучения ЛС и БАДов, применяемых для повышения физической работоспособности, предложен состав нового лекарственного средства, получившего условное название "Энергодарин". Показана целесообразность включения в состав предлагаемого средства экстракта левзеи, калия оротата, кальция глицерофосфата и глюкозамина сульфата.
На основе анализа известных ЛС данного спектра действия выбраны дозировки ингредиентов, входящих в предложенное лекарственное средство.
Проведено сравнительное фармакологическое изучение действия разрабатываемого ЛС, с одной стороны, и результатов монотерапии экстрактом левзеи жидким, калия оротатом, кальция глицерофосфатом и "Анастаном" (БАД содержашего 20-гидроксиэкдистерона) – с другой, и установлено, что новое комбинированное ЛС повышает физическую работоспособность и ее эффективность в 3 раза по сравнению с монотерапией, компонентами входящими в состав "Энергодарина", что является подтверждением их синергитического действия (увеличивается время плавания животных в тесте "принудительного плавания"). ЛС "Энергодарин" обладает стресспротективной активностью и проявляет анаболическое действие (предупреждает гипертрофию надпочечников, приводит к нарастанию мышечной массы, сокращаются сроки наступления эффекта усиления физической работоспособности). В результате проведенных гематологических и биохимических исследований установлено, что долгосрочный прием ЛС не вызывает изменений в составе крови, препятствует развитию энергодефицита в мышцах животных в условиях физической нагрузки.
Изучены возможности использование различных физико-химических и химических методов для идентификации и количественного определения фитоэкдизонов левзеи сафлоровидной, калия оротата, кальция глицерофосфата, глюкозамина сульфата; проведен выбор методик, позволяющих определять указанные вещества при совместном присутствии; показана возможность их использования для стандартизации указанного лекарственного средства.
Обоснованы оптимальные условия для определения экстракта левзеи по экдистерону методом ТСХ. Доказана возможность использования спектрофотометрических методик для определения калия оротата (прямой спектрофотометрией), глюкозамина сульфата (по реакции Эльсона-Моргана). Установлена возможность анализа кальция глицерофосфата комплексонометрическим методом при совместном присутствии ингредиентов.
Проведено сравнение методик с использованием внешнего стандарта - экдистерона и внутреннего – парацетамола для определения фитоэкдизонов в составе экстракта левзеи методом ВЭЖХ. Разработана методика и найдены оптимальные условия количественного определения фитоэкдизонов в ЛС с использованием внешнего стандарта; предлагаемая методика валидирована по показателям: специфичность, линейность, воспроизводимость и правильность.
Показана возможность использования метода капиллярного электрофореза для качественного и количественного определения ионов калия и кальция в предлагаемом ЛС. Эта методика специфична, чувствительна и правильна.
Впервые изучена стабильность ингредиентов при совместном присутствии. Установлено, что первым деструкции подвергается глюкозамина сульфат. Предложена методика определения продуктов деструкции глюкозамина сульфата (5-гидроксиметилфурфурола и родственных ему соединений) методом мицеллярной электрокинетической капиллярной хроматографии в субстанции глюкозамина сульфата и предлагаемом ЛС гранулах "Энергодарин".
Практическая значимость исследований
По результатам обоснования состава лекарственного средства для повышения физической работоспособности на кафедре технологии лекарств ГОУ ВПО «Пятигорской государственной фармацевтической академии» разработана технология гранул.
Разработанные методики качественного анализа и количественного определения всех ингредиентов, входящих в состав предложенных гранул, воспроизводимы и доступны для практического использования. Проведенная валидационная оценка показала, что при использовании методик количественного определения всех компонентов соблюдается линейность в области аналитических концентраций. Методики чувствительны, специфичны и правильны. Предложена методика количественного определения продуктов деструкции глюкозамина сульфата методом мицеллярной электрокинетической капиллярной хроматографии, которая использовалась для установления сроков годности ЛС. Установлено, что показатели качества разработанного средства сохраняются в течение двух лет естественного хранения. По результатам проведенных исследований разработан проект ФСП.
Внедрение результатов исследований в практику
Работа входит в состав федерального проекта: "Разработка инновационных ресурсосберегающих технологий и продуктов из нетрадиционных видов сырья" (государственный контракт №6470р/8833 от 11.01.2009).
Разработанные методики качественного и количественного анализа ингредиентов средства апробированы в Пятигорском Филиале ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии Ставропольского края" и в ГУП РО "Фармацевтический центр" г. Ростов-на-Дону.
Методика определения примеси 5-ГМФ методом мицеллярной электрокинетической капиллярной хроматографии в субстанции глюкозамина сульфата и в предлагаемом средстве апробированы в лаборатории ООО "Люмэкс-Центрум".
Положения, выдвигаемые на защиту:
Обоснование состава ЛС "Энергодарин";
Результаты фармакологических исследований, подтверждающие правильность выбора и соотношения компонентов в составе ЛС "Энергодарин";
Методики качественного и количественного анализа компонентов лекарственного средства "Энергодарин" и их валидационная оценка;
Количественный анализ фитоэкдизонов в экстракте левзеи жидком и лекарственном средстве "Энергодарин" методом ВЭЖХ с использованием внешнего стандарта - парацетамола;
Методика качественного и количественного анализа ионов калия и кальция в составе ЛС методом капиллярного электрофореза;
Методика количественного определения 5-гидроксиметилфурфурола и родственных ему соединений в субстанции глюкозамина сульфата и ЛС "Энергодарин" методом электрокинетической мицеллярной хроматографии;
Результаты исследования стабильности предлагаемого ЛС и обоснование его сроков годности.
Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы (НИР) ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава, а также в соответствии с соглашением о выполнении НИР между Федеральным агентством по здравоохранению и социальному развитию и ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (№06/1049).
Апробация работы и публикации
Основные положения диссертационной работы доложены на региональных конференциях (Пятигорск, 2007 - 2009 гг.), школе-семинаре «Подготовка, управление инновационными научно-техническими проектами и способы коммерциализации научно-технической продукции» (Астрахань, 2008), на XVI Российском национальном конгрессе «ЧЕЛОВЕК И ЛЕКАРСТВО» (Москва, 2009). Работа финансировалась Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в рамках программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» («У.М.Н.И.К. 2009»). Работа награждена дипломом участника "Салон инноваций и инвестиций 2009". По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе в журналах, рекомендованных ВАК, – 1 статья.
Объем и структура диссертации
Общая характеристика фармакологических средств для коррекции работоспособности
Основной целью настоящего исследования является создание комбинированного лекарственного средства для повышения работоспособности, сохранения и укрепления здоровья, профилактики различных патологических состояний, которые могут возникать при воздействии на организм физических нагрузок.
Вид физической деятельности, ее длительность и интенсивность являются основанием для подбора лекарственных средств (ЛС) с целью фармакокоррекции физического и функционального состояния организма. Для этого используются лекарственные средства, разрешенные для применения [57,59,60,61].
Современный ассортимент лекарственных средств, способных оказать стимулирующее влияние на физическую работоспособность, располагает огромным количеством биологически активных веществ, применение которых в практике запрещено как по этическим, так и по медицинским соображениям. Это - так называемые допинговые средства [38,39,77].
Под допингом понимают введение в организм веществ, способствующих резкому искусственному повышению работоспособности и (или) выносливости человека. Опасность применения этих допингов обусловлена особенностями механизма их действия, что отражается на функциях различных физиологических систем организма в условиях интенсивной физической деятельности [38,39,77].
В противоположность допингам, есть лекарственные средства (ЛС) и биологически активные добавки (БАД), применение которых в практике оправдано для повышения устойчивости организма к большим физическим нагрузкам, ускорения восстановительных процессов [9,24,27,39,40,138,178].
С учетом механизма влияния на физиологические и биохимические процессы, происходящие в организме, эти ЛС подразделяются на следующие группы: адаптогены и повышающие иммунобиологические способности организма; витамины и коферменты; регулирующие электролитный обмен в организме; улучшающие процессы белкового синтеза; антиоксиданты; энергодающие соединения; медиаторы центральной нервной системы, регулирующие процессы торможения и возбуждения; средства, влияющие на кровоток и реологические свойства крови [1,3]. Использование этих средств базируется на теоретической концепции о целенаправленной регуляции обмена веществ при физических нагрузках путем І расширения метаболических циклов с помощью некоторых низкомолекулярных метаболитов и стимуляторов различных звеньев биосинтеза. Число этих средств постоянно растет, что доказывает актуальность развития данного направления [18,43,57,59,60,120,45,49].
На сегодняшний день наиболее популярными, эффективными и часто применяемыми группами являются адаптогены, энергодающие препараты, препараты пластического действия, витамины и хондропротекторы [143]. Таким образом, целесообразно разработать комбинированный препарат, содержащий компоненты этих групп [1,9,17,21,24,40,71].
К большой группе адаптогенов, которые могут быть с успехом применены в практике, относится целый ряд препаратов как растительного (левзей сафлоровидной, женьшеня, элеутерококка и др.), так и животного (пантокрин) и синтетического (дибазол) происхождения [19,20,23,96,162].
ЛС на основе адаптогенов называются также растительными психоэргизаторами 1 ряда, основными стимуляторами физической и психической работоспособности, имеют небольшую терапевтическую широту, что позволяет использовать их в фармакологии здорового человека [19,49,56].
Наиболее широко применяются лекарственные средства и биологически активные вещества (БАВ) левзей, которые имеют преимущество перед другими средствами как растительного, так и животного происхождения. Применение их не имеет возрастных и сезонных ограничений, допускается их многократная передозировка без последствий для человека [20,44,46,106,107].
Очень близка к адаптогенам новая группа стимуляторов работоспособности, получившая название актопротекторы.
Актопротекторы - ЛС, лишь недавно попавшие в арсенал фармакологии, но уже получившие признание. Из отечественных препаратов к ним относятся сукцинат натрия, лимонтар (производные лимонной и янтарной кислот). Актопротекторы препятствуют возникновению нарушений метаболизма (обмена веществ) в организме в момент физической нагрузки, стимулируют клеточное дыхание, способствуют усиленному синтезу энергонасыщенных соединений (АТФ, креатинфосфат) [99].
К улучшающим процессы белкового синтеза относятся вещества различной структуры и происхождения. Их действие реализуется путем воздействия на различные механизмы, усиливающие биосинтез белка в организме (оказывающие анаболизирующее действие) и, тем самым, способствуют ускорению роста мышц [59,60,65,99].
В этой группе ЛС которые не являются допингами, и которые могут быть рекомендованы для коррекции работоспособности, интерес представляют не стероидные ЛС растительного происхождения, представители так называемых фитоэкдизонов [8,32,37,106,107]. ЛС "Экдистен" и БАД на основе левзей сафлоровидной давно известны (российские "Элтон", "Леветон" и др., украинский и узбекский "Экдистен") и хорошо себя зарекомендовали [25,2,26]. По молекулярным механизмам действия "Экдистен" сходен с анаболическими стероидами. Однако, как показали многочисленные исследования, несмотря на стероидную структуру, "Экдистен" лишен вредных побочных эффектов препаратов экзогенного тестостерона и анаболических стероидов. Длительный прием "Экдистена" даже в высоких дозах не вызывает нарушений в содержании гормонов (кортизолкортизон, соматотропин, тестостерон, инсулин, тиреотропный гормон) в крови, не оказывает какого-либо побочного влияния на печень [26,37,79,111]. "Экдистен" не является допингом и может применяться без каких-либо ограничений с точки зрения антидопингового контроля [37,38, 62-66].
Аналогичным "Экдистену" и перспективным препаратом среди фитоэкдистероидов (ФЭС) в плане набора мускульной массы является - ЛС "Анастан". Еще одним широко употребляемым в настоящее время в спорте высших достижений является БАД - "РУС ОЛИМПИК" (Россия), состоящий из смеси экдистеронов, выделенных из левзеи[65,66,67].
Практический интерес для исследований представляют ЛС производные и соли оротовой кислоты (калия оротат, магния оротат) -предшественники всех пиримидиновых нуклеотидов, из которых построены нуклеиновые кислоты [65,66,67].
Действие оротовой кислоты обусловлено тем, что она потенцирует белковый синтез т.е. проявляет анаболический эффект, который выражен слабее, чем у стероидов. Особенно эффективно применение калия оротата при нарушении альбуминобразующей функции печени, при дистрофических изменениях в миокарде, при перенапряжении, для улучшения аппетита, увеличения диуреза, улучшения переносимости некоторых медикаментов, а также ускорения процессов адаптации и акклиматизации в условиях гипоксии при интенсивных физических нагрузках. Большое значение при использовании этой группы препаратов ЛС имеет достаточное поступление в организм аминокислот, и прежде всего незаменимых, поскольку они служат пластическим материалом для синтеза белка [12,45,46,65,66,67].
Теоретической предпосылкой для использования антиоксидантов в целях коррекции физической работоспособности является способность антиоксидантов препятствовать чрезмерной активации свободно-радикального окисления липидов клеточных и субклеточных мембран. Такая активация способна привести к нарушению проницаемости мембран и даже к их полной дезинтеграции, что может иметь место при воздействии на организм различных экстремальных факторов (гипоксия, гипероксия, гипертермия, голодание и т.д.), в том числе и высоких физических нагрузок [18,23,25]. К этой группе относятся природные антиоксиданты (флавоноиды, токоферолы, лимонная и аскорбиновая кислоты и др.) и синтетические антиоксиданты (пропиловый и додециловый эфиры галловой кислоты и др.) [56,74,99].
Таким образом, нами выдвинуто предположение, что комплексное применение адаптогена, обладающего антиоксидантной и мембраностабилизирующей активностью, и улучшающим процессы белкового синтеза (экстракта левзей) и гепатопротекторного ЛС (калия оротата) значительно эффективнее повысит физическую работоспособность, чем их раздельное использование. Следовательно, можно ожидать, что комбинация гепатозащитного ЛС проявляющего слабое анаболическое действие и стимулятора - экстракта левзей - будет эффективно предупреждать болевой синдром печени, развивающийся при остром физическом перенапряжении организма [17,46].
Оценка влияния ЛС "Энергодарин" на физическую работоспособность в тесте "принудительное плавание"
В двухнедельном курсе на 7 сутки после приема ЛС "Энергодарин" отмечено увеличение длительности времени принудительного плавания (ВПП) до 700 с первого плавания и 500 сек - второго. В группах, получавших препараты сравнения, на 7 сутки ВПП было ниже, чем в группе ЛС на 500сек. в случае первого и второго плавания (рис. 1) [11,14].
В следующие 7 дней приема ЛС "Энергодарин" отмечалось прогрессирующие увеличение длительности ВПП1 до 2000сек. на 10-е сутки (р 0,05), с последующим снижением на 500сек., а на 14-е сутки и составило 1400сек. Статистически достоверное увеличение ВПП1 в группе, получавшей ЛС "Энергодарин", отмечалось на 8 - 14 сутки эксперимента. Прогрессирующий рост ВПП отмечался при приеме ЛС "Энергодарин" также во время второго плавании - рост с 7 по-14 день (рис. 1).
В группе животных, получающих калия оротат, кальция глицерофосфат к 7-14 суткам ВПП находилось на уровне значений контрольной группы, как в случае первого, так и второго плавания и не превышало 500 сек. (рис. 1).
В группе животных, получавших жидкий экстракт левзей, ВПП на протяжении первой недели не имело достоверных отличий от значений групп, получавших калия оротат и кальция глицерофосфат, а также результатов контрольной группы животных. С десятые по 12-е сутки наблюдалось увеличение ВПП относительно контрольных значений, а в следующие два дня отмечено резкое возрастание ВПП.
Время второго плавания при приеме жидкого экстракта левзей, характеризовалось наличием цикла в два дня (рис. 1).
ВПП в группе животных, получавших "Анастан", на протяжении первых 7 дней не имело достоверных отличий от контрольной группы животных. На протяжении двух недель в группе, получавшей "Анастан", отмечен самый низкийтемп роста ВПП, уступая ЛС "Энергодарин" в 5 раз на 14-е стуки эксперимента. При приеме ЛС "Анастан" время второго плавания не имело достоверных отличий от контрольной группы на протяжении всего эксперимента (рис. 1).
Первая неделя четырехнедельного курса аналогична по динамике прироста ВПП первой недели двухнедельного курса. Последующее увеличение нагрузки до 20% с 8-15 день привело к "сглаживанию" результатов времени первого и второго плавания во всех группах и не превышало 200 сек. В этот период животные подвергались сверхмаксимальным физическим нагрузкам (рис. 2).
С 16-21 день нагрузка была уменьшена и составляла 10% от массы тела, что отразилось на ВПП резким скачком значений во всех группах, как и первого, так и второго плавания на 16-17 день эксперимента (рис.2)
В группе животных, получавшей ЛС "Энергодарин", наблюдался уверенный рост первого и второго ВПП и на 21 сутки достоверно превысило ВПП контрольных групп животных и составило более 1700 и 500 сек. соответственно. ВПП остальных групп животных не имело достоверных отличий от значений ВПП контрольной группы животных (рис. 2)
Заключительным этапом эксперимента было увеличение нагрузки до 15% от массы тела животного (рис.2)
В группе получавшей ЛС "Энергодарин", на 22-23 сутки наблюдалось резкое падение ВПП, но к концу эксперимента (с 26 по 28 сутки) восстановление уровня ВПП составило - 1000 сек. для первого плавания и 500 сек. - второго плавания. В других группах значимых и достоверных различий на данном этапе исследований не наблюдалось (рис.2).
Наиболее объективную оценку эффективности физической работоспособности дает балльная система оценки эксперимента (табл. 4).
По полученным данным (табл. 1, рис.1, рис.2, табл.4) определена эффективность работоспособности исследуемых ЛС:
ЛС Энергодарин " (181 балл) » жидкий экстракт левзей (66 баллов) кальция глицерофосфат (62 балла) калия оротат (50 баллов) "Анастан " (45 баллов)
Таким образом, ЛС "Энергодарин" увеличивало время первого и второго плавания при двухнедельном и четырехнедельном курсах тренировки, превышая показатели ВПП ЛС сравнения в три - четыре раза, что свидетельствует о выраженном синергетическом действии компонентов ЛС "Энергодарин". Эти результаты послужили подтверждением правильности выбора качественного и количественного состава ЛС "Энергодарин".
Исходя из проделанной экспериментальной работы можно заключить, что Л С "Энергодарин" можно рекомендовать для повышения физической работоспособности и выносливости при значительных физических нагрузках.
Определение содержания ФЭС в экстракте левзей жидком методом ВЭЖХ с применением внутреннего стандарта
Наиболее эффективным является вариант ВЭЖХ в сочетании с методом внутреннего стандарта. Применение метода внутреннего стандарта для ВЭЖХ-анализа сложных по составу образцов позволяет существенно повысить точность количественного определения индивидуальных соединений. Достоинства метода внутреннего стандарта состоят в том, что он не требует воспроизводимого ввода пробы по величине; малая зависимость результатов измерений от нестабильности работы хроматографа и детектора, т.к. эти факторы в равной мере влияют на определяемое стандартное соединение. Далее, к достоинствам метода относится то, что здесь требуется разделять только анализируемые компоненты и стандарт. Ошибки в измерении параметров пика и калибровочного коэффициента (исключая стандарт) сказываются только на определении содержания соединения, для которого была допущена ошибка [94].
В качестве ВС предлагается использовать парацетамол (ФС 42-0268-07), содержащий фенильный хромофор с максимумом полосы поглощения в области 238 нм, что практически совпадает с максимумом полосы поглощения хромофора (С = С - С = О) в структуре ФЭС (242 нм).
В условиях, предлагаемых по ФС 42-1995-99, на хроматограмме раствора содержащего СО экдистерона и парацетамола фиксировали два пика, при этом коэффициент разделения пиков составил 0,11. Также оказались неудовлетворительными такие показатели как эффективность (не более 103 теоретических тарелок). Кроме того, время удерживания парацетамола не превышало 2 мин, а коэффициент асимметрии пика составил 3-4. Таким образом, предлагаемая система по ФС 42-1995-99 оказалась непригодной для определения суммы ФЭС с использованием внутреннего стандарта
По литературным данным известно, что для анализа суммы ФЭС в растениях родов: Serratula L., RhaponticuT Ludw., Lychnis L., Silene L. в качестве подвижной фазы используются спирт метиловый и вода-этанол-бутанол (72,4:26,8:0,8). В связи с тем, что метанол относится к ядовитым веществам и находится на предметно-количественном учете, была использованы подвижная фаза вода-этанол-бутанол (72,4:26,8:0,8), при этом коэффициент асимметрии пиков, время удержания и эффективность - оказались удовлетворительными [93,94].
Условия проведения анализа суммы ФЭС в жидком экстракте левзей с использованием внутреннего стандарта представлены ниже:
Внутренний стандарт: парацетамол (п-ацетаминофенол)
Колонка: 80 х 2 мм сорбент "Диасорб 130-С16-Т"
Размер частиц сорбента: 6 мкм
Длина волны: 242 нм
Состав подвижной фазы: вода-этанол-бутанол (72,4:26,8:0,8).
Скорость потока элюента: 50 мкл/мин
Объем вводимой пробы: 3 мкл
Режим: изократическое элюирование
Общее время анализа: 15 мин.
Регистрацию и математическую обработку результатов ВЭЖХ-анализа осуществляли с помощью универсальной компьютерной системы сбора и обработки хроматографической информации "Полихром для Window".
Для исследования линейности готовили градуировочную смесь: для чего 100 мг экдистерона и 10 мг парацетамола (точные навески) растворяли в 100мл дегазированного элюента (раствор А). Затем, путем последовательного разведения раствора А элюентом, готовили растворы с концентрациями 0,1-1,1 мг/мл экдистерона и 0,01-0,11 мг/мл парацетамола, с шагом 0,1 мг/мл. Каждый раствор хроматографировали при указанных выше условиях 3 раза. (рис. 11).
Как следует из представленных данных (рис. 11), зависимость площади пика от концентрации носит линейный характер для обоих компонентов. Коэффициент корреляции в обоих случаях составляет не менее 0,99, что соответствует рекомендациям ІСН. Величины свободных членов в уравнениях линейной регрессии не являются статистически значимыми. Кроме того, все экспериментальные точки лежат на линии тренда. Таким образом, можно утверждать, что линейная зависимость наблюдается в области концентраций 0,1-1,1 мг/мл экдистерона и 0,01-0,1 мг/мл парацетамола.
Поправочный коэффициент составил 5,17±0,14 (табл. 17), что позволяет использовать его для расчета содержания суммы ФЭС в экстракте левзей жидком с использованием внутреннего стандарта - парацетамола.
Для установления подлинности экстракта левзей и определения специфичности методики готовили испытуемый раствор и раствор стандартного образца экдистерона. Для испытуемых и стандартных растворов наблюдаются сопоставимые результаты времени удерживания. При добавлении раствора СО экдистерона к испытуемым растворам установлено, что площади пиков анализируемых компонентов увеличиваются пропорционально количеству добавленного вещества.
Таким образом, условия хроматографирования экстракта левзей валидны по показателю «специфичность» и могут применяться для определения подлинности.
Остальные критерии пригодности хроматографической системы рассчитывались программой на 6 хроматограммах, полученных при анализе экстракта левзей по методике, описанной ниже [126,127].
Хроматографическая система пригодна для анализа с использованием разработанной методики при условии эффективности хроматографической колонки по пику экдистерона не менее 5000 теоретических тарелок, коэффициент асимметрии пиков близок к 1. Методика характеризуется хорошей воспроизводимостью - RSD времени удержания ниже 2%.
Методика: 5,0 мл экстракта левзей жидкого помещали в колбу вместимостью 25 мл, добавляли 10 мл спирта этилового 60%, тщательно перемешивали в течение 10-15 мин, фильтровали через бумажный фильтр, пропускали через концентрирующий патрон "Диапак 130-С 16-Т" со скоростью 0.5-1.0 мл/мин. Сумму ФЭС селективно элюировали с сорбента 10 мл спирта этилового 60 %. Элюат собирали в мерную колбу емкостью 25 мл, вносили 2 мл раствора парацетамола в элюенте (С 0,675 мг/мл) и доводили до метки спиртом этиловым 60%. 3 мкл полученного раствора испытуемого образца подвергали хроматографированию. ВЭЖХ-анализ каждого образца проводили 3 раза.
Изучение стабильности
В процессе хранения лекарственные препараты подвергаются деструкции. Нормативные документы регламентируют содержание посторонних веществ, как в субстанциях, так и в ЛС. При разработке нового ЛС требуется установить количество допустимых примесей, а так же тот компонент, который первым подвергнется деструкции (в случае многокомпонентной системы) [69].
Гранулы "Энергодарин" представляют собой многокомпонентную лекарственную форму. Поэтому на первоначальном этапе исследований необходимо было изучить взаимное влияние ингредиентов гранул на их стабильность при совместном присутствии. Так как в состав анализируемых гранул входит 0,75 г глюкозамина сульфата, 2,0 г калия оротата, 2,0 г кальция глицерофосфата, 5,0 мл экстракта левзей, то для предварительных исследований готовили водные растворы, исходя из содержания ингредиентов в прописи: 0,16% глюкозамина сульфата, 0,42% калия оротата, 0,42% кальция глицерофосфата, 1% экстракта левзей. Оценку взаимного влияния проводили, сравнивая изменение интенсивности окраски в присутствии другого ингредиента при хранении в термостате (60 С) и аналогичными растворами, хранящимися при комнатной температуре в течение суток (табл. 28) [128].
Полученные данные имеют предварительный характер, однако, позволяют утверждать, что если в растворах первым подвергается деструкции глюкозамина сульфат, то и в твердом состоянии (гранулы), процесс будет аналогичным. Таким образом, о стабильности лекарственного средства можно будет судить по появлению продуктов деструкции глюкозамина сульфата.
В качестве посторонних примесей в глюкозамина сульфате определяют 5 - гидроксиметилфурфурол (5 - ГМФ) и родственные ему соединения, которые являются продуктами деструкции лекарственного вещества. 5- ГМФ в глюкозамине гидрохлориде (ФСП 42-0314-1478-01) определяют методом УФ - спектрофотометрии при длине волны 280±5 нм. Однако, входящие в состав гранул экстракт корней левзей и калия оротат не позволяют достоверно определять примесь глюкозамина сульфата, так как растворы имеют полосы поглощения в области 210-300 нм. Поэтому методика УФ -спектрофотометрии является непригодной для анализа продуктов деструкции данного лекарственного препарата.
Так как в ФСП 42-0314-1478-01 на субстанцию глюкозамина гидрохлорида примеси 5-ГМФ должно быть не более 0,05 %, то при использовании метода ТСХ, исходя из чувствительности реакции, аналитическая проба должна быть более 5000 мкг, которая не позволяет достоверно отделить препарат от продуктов деструкции. Поэтому использовать методику ТСХ применительно к гранулам лекарственного препарата так же не представляется возможным.
В соответствии с ГОСТ Р 52474—2005 для определения 5-ГМФ используется метод ВЭЖХ в меде и фруктовых соках.
В настоящее время для анализа 5-ГМФ перспективным методом является капиллярный электрофорез (КЭ), который характеризуется высокой эффективностью и разрешающей способностью, а также малыми объемами проб.
Для анализа 5-ГМФ выбрана мицеллярная электрокинетическая капиллярная хроматография (МЭКХ), которая является одним из наиболее широко используемых видов капиллярного электрофореза за счет преимущества по сравнению с традиционными методами, такими как -ВЭЖХ.
За основу была взята методика выполнения измерений 5-ГМФ в молочных продуктах методом МЭКХ. Для анализа использовали капилляр с рабочей длиной 65 см и диаметром 50 мкм, разделение вели в фосфатном и боратном электролитах, регистрация электрофореграмм проходила при длине волны 254 нм.
Для того чтобы выбрать наиболее подходящие условия, готовили СО 5-ГМФ .
Для установления линейной зависимости площади пика от концентрации, готовили серию водных растворов 5-ГМФ с концентрацией от 0,0001 до 0,0032 г/мл. Полученные растворы подвергали анализу в условиях:
-капилляр диаметром 50мкм и рабочей длины - 65см;
-напряжение 20, кВ;
-ввод пробы 50 мбар/с;
-электролит - 50 мМ фосфатного буфера (рН 7.5) 100 мМ SDS.
Приготовление раствора СО 5-ГМФ: 0,0500 г 5-ГМФ (точная навеска) помещали в мерную колбу вместимостью 250 мл, добавляли 50 мл спирта этилового 70%, взбалтывали и доводили объем раствора до метки раствор А. 1 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили до метки тем же растворителем (0,0002 г/мл 5-ГМФ).
При концентрации от 0,0001 до 0,0032 % наблюдается линейная зависимость площади пика от концентрации 5-ГМФ в растворе, коэффициент корреляции составил не менее 0,995 (рис. 19).
Следующим этапом наших исследований был анализ раствора глюкозамина сульфата, подвергнутого деструкции. Для этого 0,4% раствор глюкозамина сульфата в воде подвергали термической деструкции на кипящей водяной бане до тех пор, пока значение оптической плотности этого раствора при длине волны 280 нм оказывалось равной 0,3 (норма ФСП 42-0314-1478-01), что соответствует максимально допустимому содержанию примесей. Полученный раствор и раствор глюкозамина сульфата, не подвергнутый термической деструкции, анализировали методом МЭКХ в условиях описанных выше (рис.20)
Как следует из представленной электрофореограммы 0,4% раствора глюкозамина сульфата, подвергнутого деструкции и имеющего значение оптической плотности в пределах 0,300, сумма площадей пиков со временем выхода от 4,0 мин до 5,0 мин. составляет 0,154 тУ сек. Тогда как, в проведенных ранее исследованиях образца, не подвергнутому термическому воздействия, сумма площадей пиков составила 0,013 тУ сек.
Таким образом, при значении суммарной площади пиков продуктов деструкции глюкозамина сульфата более 0,150 тУ сек, субстанцию глюкозамина сульфата можно считать не соответствующей по показателю "посторонние примеси".
Сравнивая хроматограммы продуктов деструкции глюкозамина сульфата и СО 5-ГМФ (рис. 19, 20) можно сделать вывод, что пику 5-ГМФ (рис. 20) соответствует лишь 1 пик с временем выхода 4,12 мин, при этом площадь этого пика составляет 0,072 тУ сек или 46,7% от суммы площадей. В связи с этим для расчета содержания посторонних примесей глюкозамина сульфата использовали сумму площадей пиков 5-ГМФ и родственных ему соединений.
Расчет количества 5-ГМФ и родственных ему соединений (X) в процентах в глюкозамина сульфате, подвергнутому термической деструкции, проводили, используя их суммарные значения площадей пиков по формуле 13.
Содержание суммы 5-ГМФ и родственных ему соединений находится в пределах 0,04%, а относительная погрешность не превышет ± 5,2% (табл.28).
Следующим этапом исследований явилось изучение возможности определения примеси 5-ГМФ в присутствии остальных ингредиентов гранул. Для этого готовили две модельные смеси гранул. Модельная смесь (плацебо), не содержащая глюкозамина сульфат: 1,0100 г калия оротата, 1,0100 г кальция глицерофосфата (точные навески), 2,6 мл экстракта левзей жидкого помещали в мерную колбу на 100 мл, прибавляли 50 мл спирта этилового 70%), тщательно перемешивали в течении 10 минут, фильтровали отбрасывая первые 20 мл фильтрата и подвергали анализу в условиях описанных выше (рис.21)
На электрофореограмме (рис. 21) при анализе модельной смеси обнаруживаются пики неидентифицированных веществ с временем удерживания от 2,9 до 3,8 мин. При добавлении к раствору модельной смеси плацебо раствора СО 5-ГМФ фиксировали появление пика (гуд=4,12), соответствующего 5-ГМФ.
Далее готовили модельную смесь: 0,4000 г глюкозамина сульфата (точная навеска) помещали в мерную колбу с притертой пробкой на 100 мл и растворяли в 50 мл спирта этилового 70%, закрывали и помещали в сушильный шкаф при 100 С для его деструкции до допустимых концентраций примесей, после чего раствор охлаждали до комнатной температуры (раствор А). Далее, в полученный раствор добавляли 1,0100 г калия оротата, 1,0100 г кальция глицерофосфата (точные навески), 2,6 мл экстракта левзей жидкого, доводили до метки спиртом этиловым 70%, тщательно перемешивали в течении 10 минут, фильтровали, отбрасывая первые 20 мл фильтрата и подвергали анализу в условиях, описанных выше.
![Исследования по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе плодов расторопши пятнистой [Silybum marianum (L.) Gaertn.].](/i/i/4243/375120.png "Исследования по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе плодов расторопши пятнистой [Silybum marianum (L.) Gaertn.]. Рыжов Виталий Михайлович")
