Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Методы исследования морфина и трамадола в судебно-химическом анализе Заикин Кирилл Сергеевич

Методы исследования морфина и трамадола в судебно-химическом анализе
<
Методы исследования морфина и трамадола в судебно-химическом анализе Методы исследования морфина и трамадола в судебно-химическом анализе Методы исследования морфина и трамадола в судебно-химическом анализе Методы исследования морфина и трамадола в судебно-химическом анализе Методы исследования морфина и трамадола в судебно-химическом анализе
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Заикин Кирилл Сергеевич. Методы исследования морфина и трамадола в судебно-химическом анализе : диссертация ... кандидата фармацевтических наук : 14.04.02 / Заикин Кирилл Сергеевич; [Место защиты: ГОУВПО "Московская медицинская академия"].- Москва, 2010.- 109 с.: ил.

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 11

1.1.. Сравнительная характеристика наркотических веществ опийной группы 11

1.1.1. Лекарственные препараты, в состав которых входят морфин и трамадол 11

1.1.2. Особенности строения наркотических анальгетиков морфина и трамадола 12

1.1.3. Особенности применения лекарственных препаратов, содержащих морфин и трамадол 12

1.1.4. Героин. Виды. Особенности агрегатного состояния и состава 13

1.2. Фармакокинетические особенности морфина 14

1.3. Фармакокинетические особенности трамадола 21

1.4. Специфика проведения химико-токсикологического анализа биологических образцов, содержащих наркотические вещества опийной группы - морфин и трамадол 23

1.4.1. Зависимость концентрации вещества в крови от места отбора пробы 23

1.4.2. Дифференцирование лекарственного потребления кодеина от нелегального приёма опиатов 24

1.4.3. Особенности стабильности опиатов в образцах при различных условиях хранения проб 25

1.4.4. Развитие толерантности и зависимости при употреблении опиатов 26

1.5. Методы исследования морфина и трамадола, применяемые в судебно-химическом анализе 26

1.5.1. Иммунные методы 26

1.5.2. Хроматографические методы 29

Выводы 43

Глава 2. Материалы и методы 44

2.1. Обнаружение опиатов в моче человека методом иммуноферментно-го анализа с помощью набора реагентов «Дианарк 0» 44

2.2. Анализ морфина и трамадола методом ГХ-МС 50

Глава 3. Разработка методик количественного определения морфина и трамадола в крови .55

3.1. ИФА как предварительный метод анализа мочи, на наличие наркотических веществ группы опия, в том числе морфина 56

3.1.1. Проведение анализа 56

3.1.2. Учёт результатов 57

3.2. Газовая хроматография с масс-селективным детектором как подтверждающий метод анализа морфина и трамадола в крови 58

3.2.1. Выбор оптимальных условий ЖЖЭ морфина и трамадола 58

3.2.2. Количественное определение морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором 62

3.2.3. Практическое применение метода ГХ-МС для количественного определения морфина и кодеина в крови 85

Выводы 94

Список литературы 96

Приложения 109

Введение к работе

Актуальность темы.

В настоящее время препараты из группы агонистов опиоидных рецепторов, такие как морфин и трамадол, широко применяются как лекарственные средства. Их применение с немедицинскими целями, а также применение героина, одним из метаболитов которого является морфин, распространено у людей с наркотической зависимостью [Galichet, 2004; Веселовская, 2002]. Часто эти вещества являются причиной передозировок и летальных исходов [Baselt, 1995; Веселовская, 2000].

По отчётным данным 2009 года Государственного Учреждения Здравоохранения Московской области Бюро Судебно-Медицинской Экспертизы Министерства Здравоохранения Московской Области (ГУЗ МО Бюро СМЭ МЗ МО) второе место по результатам исследований биоматериала от живых лиц занимают наркотические вещества, из них подавляющее количество составляют опиаты (3627 положительных из 12539 случаев). По результатам исследования аутопсийного материала наркотические вещества занимают третье место. Среди наркотических веществ преобладают опиаты (1068 положительных из 8037 случаев).

В судебно-химическом анализе для определения агонистов опиоидных рецепторов применяются: высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) [Matthew H. Slawson, 2007]; газожидкостная хроматография (ГЖХ) [Изотов, 2000]; иммунные методы [Sam Niedbala, 2001]. В настоящее время развитие газовой хроматографии с масс-селективным детектором (ГХ-МС) делает этот метод наиболее предпочтительным и перспективным. Метод обладает высокой селективностью, а требуемый предел количественного определения (0,01 мг/л) может быть достигнут при изменении условий хроматографирования.

В связи с тем, что в отечественной литературе отсутствуют валидированные методики определения морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором, учитывающие последние разработки в этой области, актуальной задачей является разработка метода количественного определения морфина и трамадола, который позволит определять эти вещества в крови на уровне терапевтических концентраций.

Сложность в анализе этих препаратов в крови в рамках химико-токсикологических и судебно-химических исследований обусловлена их низкой дозировкой, низкой терапевтической концентрацией, а также сложной биологической матрицей.

Всё вышеизложенное определило цели и задачи исследования.

Цель исследования.

Разработка высокочувствительной, воспроизводимой методики количественного определения морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором, и апробирование данной методики в практике судебно-химических исследований.

Задачи исследования.

  1. Изучить влияние различных экстрагентов на эффективность экстракции морфина и трамадола.

  2. Изучить влияние реакции среды на выход морфина и трамадола.

  3. Разработать методику извлечения с учётом изученных параметров.

  4. Изучить влияние ферментативного гидролиза на выход морфина и трамадола.

  5. Изучить хроматографические свойства морфина и трамадола, на основе которых подобрать оптимальные условия хроматографирования.

  6. Разработать методику количественного определения морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором.

  7. Провести валидацию метода количественного определения морфина и трамадола.

  8. Апробация разработанной методики в судебно-химическом отделении при проведении химико-токсикологического анализа.

Научная новизна.

Впервые была разработана валидированная методика, позволяющая достоверно определять морфин и трамадол в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором на уровне предела определения - 0,01 мг/л.

Практическое применение.

По результатам серии экспериментов было показано, что проведение ферментативного гидролиза -глюкуронидазой Helix Pomatia значительно увеличивает выход морфина и трамадола при анализе исследуемых биообъектов. Для создания pH среды может быть рекомендовано использование трис-буфера, так как это позволяет добиться максимального выхода морфина и трамадола и получать наиболее стабильные результаты исследований. Разработанная методика определения морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором позволяют определять данные вещества на уровне предела определения.

Положения, выносимые на защиту.

  1. Хроматографическое поведение морфина и трамадола под влиянием различных факторов (экстрагент, рН среды, ферментативный гидролиз).

  2. Разработанная методика количественного определения морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором.

  3. Апробация данной методики в практике судебно-химического и химико-токсикологического анализа.

Внедрение результатов в практику.

Разработанная методика количественного определения морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором может использоваться при проведении судебно-химического и химико-токсикологического анализа. Данная методика внедрена и применяется в ГУЗ МО Бюро СМЭ МЗ МО при проведении исследований аутопсийной крови и сыворотки крови живых лиц.

Апробация работы.

Апробация работы проведена на научно-практическом заседании кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета ММА им. И.М. Сеченова 19 января 2010 года.

Основные теоретические положения и практические результаты работы доложены на XIII конгрессе молодых ученых и специалистов «Наука о человеке» (Томск, 2007 г.), IX итоговой научной студенческой конференции с международным участием «Татьянин день», посвященной 250-летию Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (Москва 2007г.).

Связь задач исследования с проблемным планом.

Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета ММА им. И.М. Сеченова «Совершенствование контроля качества лекарственных средств (фармацевтические и экологические аспекты)» (№ государственной регистрации 01.2.006 06352).

Публикации.

По результатам диссертационного исследования опубликовано 4 печатные работы, в том числе две статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, глав: «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Разработка методики количественного определения морфина и трамадола в крови», выводов и списка литературы из 112 источников (94 из которых зарубежные). Работа иллюстрирована 21 рисунком и 22 таблицами.

Результаты экспериментов обработаны статистически, обобщены в таблицах, проиллюстрированы рисунками.

Особенности применения лекарственных препаратов, содержащих морфин и трамадол

Героин быстро абсорбируется после перорального приёма или инъекционного введения. После инъекционного введения он быстро гидролизуется до 6- моноацетилмофина в крови, и затем, более медленно метаболизирует до морфина, который является главным активным метаболитом. Норморфин также образуется как минорный метаболит. Небольшие количества кодеина могут быть обнаружены в моче наркоманов, это является следствием присутствия ацетилкодеина в качестве примеси в образцах героина. Концентрации морфина в крови зависят от способа применения наркотика, дозы, времени с момента приёма последней дозы, и индивидуального метаболизма. Героин проходит через гематоэнцефалический барьер в течение 15-20 с и достигает высоких уровней в мозге, 68% от внутривенной дозы героина аб-сорбируютя в мозге [33]. В приложении 1 на диаграммах 4 и 5 приведены концентрации метаболитов героина в плазме при курении и внутривенном введении [3] .

Многочисленными исследованиями показано что, за 8 ч выводится 80% введенной дозы морфина, за 24 ч - 64-90%, через 72-100 ч в моче определяют лишь следы морфина. Концентрация морфина, измеренная в 2000 образцах мочи наркоманов, употреблявших героин составляет 0-750 нг/мл [3, 27, 33].

После внутримышечного введения 20 мг морфина пик концентрации в моче свободного и конъюгированного морфина достигается через 4-9 ч. В начальный период времени в виде свободного морфина выводится 25-34% общего морфина, спустя 12 ч свободный морфин составляет только 5,9% общего морфина. За весь период выводится в виде свободного морфина 6,8% дозы и в виде конъюгированного морфина - 58,6% дозы [109-110].

Большая часть растворимого в воде морфин-3-глюкуронида выделяется с желчью и затем выделяется с фекалиями. В итоге до 87 % от принятой дозы морфина выделяется с мочой в течение 72 часов, из них 75% приходятся на долю морфин-3-глюкуронида [27, 37, 39].

Содержание свободного и связанного морфина в крови в заметной степени зависит от места взятия пробы на анализ. В зависимости от различных условий (дозы героина, времени с момента смерти, индивидуальных особенностей организма) количественные данные сильно варьируют [3, 89]. Так по данным [27], при концентрации свободного морфина в центральной системе кровообращения выше 0,3 мг/л, его содержание в периферической системе примерно вдвое ниже. В другом исследовании [33] показано, что концентрация свободного морфина в крови центральной системы в 2-3 раза ниже, чем в крови периферической. Из приведенных в таблице 6 данных следует, что значительные количества общего морфина аккумулируются в печени, легких и почках, а также жидкости перикарда. Доля свободного морфина от общего особенно высока (68-99%) в крови, тканях мозга, сердечной мышце, селезенке, почках и бедренной мышце. В тканях с высокой метаболической активностью (печени и легких) морфин в значительной степени содержится в конъюгированном виде, и доля свободного морфина составляет 34-50%). В моче на долю конъюгатов приходится более 70%. Быстрая экскреция глюкуронидов морфина из почечной ткани в мочу ведет к накоплению в почках свободного морфина (94% от общего морфина). Концентрации свободного морфина в спино-мозговой жидкости (СМЖ) и мозговой ткани очень близки, но конъюгаты морфина в мозге в отличие от спино-мозговой жидкости не аккумулируются. Это может быть связано с затруднениями в преодолении барьера кровь-мозг или спино-мозговая жидкость - мозг глюкуронидами морфина.

Специальными исследованиями 32 случаев в интервале 3-37 ч после момента смерти (концентрация морфина в крови центральной системы (желудочковая кровь) 0,008-0,836 мг/л, в крови периферической системы 0,006-1,28 мг/л) вызванной передозировкой героина, было показано, что морфин в течение последующих 3-43 ч не перераспределяется из тканей в кровяное русло центральной (0,010-0,732 мг/л) или периферической систем (0,007-1,61 мг/л) [3].

Трамадол быстро и почти полностью (90%) абсорбируется после пе-рорального или парентерального применения. Приём пищи не значительно влияет на степень абсорбции. Биодоступность при однократном приеме составляет 75% и увеличивается при многократном применении препарата [27,33].

После внутримышечного введения трамадол быстро и полностью всасывается из места введения в органы и ткани, и этот процесс зависит от ряда физиологических и химических факторов. Несмотря на то, что он связываются с белками плазмы (около 20%), трамадол быстро покидает кровь и накапливается в тканях с высоким уровнем перфузии, таких как легкие, печень, почки и селезенка. Скелетная мускулатура фиксирует его в меньшей степени, однако она служит основным резервуаром вещества из-за своей большой массы. Концентрации трамадола в мозге обычно невысока по сравнению с другими органами, так как он плохо проникает через гематоэнцефалический барьер. Через плацентарный барьер препарат проникает в концентрации, равной концентрации активного вещества в плазме [27, 33, 46].

Дифференцирование лекарственного потребления кодеина от нелегального приёма опиатов

Инструкция по применению набора реагентов для иммунофермент-ного определения опиатов в моче («ДИАНАРК-О») утверждена заместителем руководителя Департамента государственного контроля качества, эффективности, безопасности лекарственных средств и медицинской техники Минздрава РФ Рейхартом Д.В. 28 мая 2001 г.

Набор реагентов разработан Московским научно-практическим центром профилактики наркомании Комитета здравоохранения г. Москвы под уточненным наименованием «Набор реагентов для иммуно-ферментного определения опиатов в моче «ДИАНАРК-О» (до 22 января 2001 года имел название «НАРКОТЕСТ-О»). Он рекомендован к серийному выпуску, применению в медицинской практике, к регистрации и внесению в Реестр медицинских изделий Комиссией по наборам реагентов для иммуноферментного (неинфекционные), радиоиммунологического и других видов иммунохимического анализа Комитета по новой медицинской технике МЗ РФ (выписка из протокола №1 от 22 января 2001г. П.П.Председатель комиссии проф. Р.А.Тигранян, секретарь комиссии А. А.Коротких). «ДИАНАРК-0» зарегистрирован в Российской Федерации, внесен в Государственный реестр изделий медицинского назначения и медицинской техники. Регистрационное удостоверение № ФС 01 а6068/5244-06 от 19 декабря 2006 года.

Метод основан на конкурентной реакции производного морфина, содержащегося в положительном контрольном образце и анализируемой пробе, и иммобилизованным антигеном морфина, за связывание с антителами против опиатов. Образовавшийся комплекс антиген-антитело выявляют с помощью конъюгата антител против иммуноглобулинов кролика, меченных пероксидазой из корня хрена. Учет результатов проводили по изменению окраски субстратно-индикаторной смеси, причем интенсивность окраски обратно пропорциональна концентрации опиатов. Объект исследования - моча.

Приборы и принадлежности. - Спектрофотометр вертикального сканирования, позволяющий измерять оптическую плотность раствора в лунках при длине волны 450нм; - Термостат суховоздушный, позволяющий поддерживать температуру +37+-0,1 С; - Пипетки полуавтоматические одноканальные с переменным объемом со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости 2-20мкл, 20-200мкл, 200-1000мкл; - Пипетка полуавтоматическая восьмиканальная с переменным объемом со сменными наконечниками, позволяющая отбирать объем жидкости 50-200мкл; - Цилиндры мерные вместимостью 50 и 100мл; - Колба мерная вместимостью 200мл; - Ванночки для реагентов или стеклянные чашки Петри; - Бумага фильтровальная; - Вода дистиллированная; - Перчатки резиновые или пластиковые. Набор реагентов «ДИЛНАРК-О». - планшет 96-луночный разборный из стрипов с иммобилизованным на внутренней поверхности лунок конъюгатом морфина с овальбумином -1 шт; - поликлональные кроличьи антитела к морфину, лиофильно высушенные - 6 фл., или жидкие концентрированные - 1фл. (0,2мл); - конъюгат антител против иммуноглобулинов кролика, конъюгированных с пероксидазой из корня хрена, лиофильно высушенный- бфл. или жидкий концентрированный - 1фл. (0,2мл); - положительный контрольный образец - производное морфина (6-ге-мисукцинат морфина), лиофильно высушенный - 6 фл. или жидкий концентрированный 1фл. (1мл); - фосфатно-солевой буферный раствор, концентрированный, содержащий твин-20 (ФСБ-Т) - 2 фл. (по 10мл); - субстратный буферный раствор, концентрированный - 1фл. (1,5 мл); - раствор субстрата тетраметилбензидина (ТМБ) - 1фл.(3,5мл); - серная кислота (стоп-реагент), 10% - Іфл.(Юмл). Аналитические характеристики. Специфичность. Использование поликлональных кроличьих антител к морфину обеспечивает специфическое взаимодействие с опиатами и не даёт перекрёстных реакций с соединениями других групп наркотиков. Чувствительность. Минимальная концентрация морфина, определяемая с помощью набора, составляет 300 нг/мл. Условия хранения и эксплуатации набора. - Набор реагентов «Дианарк-О» должен храниться в упаковке пред приятия - изготовителя при температуре +2-8С в течение всего срока годности (6 мес). Допускается хранение набора при температуре до +25С не более 5 суток; - Положительный контрольный образец, подготовленный для применения, хранению не подлежит; - Раствор конъюгата антител к иммуноглобулинам кролика можно хранить в замороженном состоянии при температуре -7С и ниже не более 5 суток. Допускается только однократное замораживание и размораживание; - Раствор поликлональных кроличьих антител и субстратно-хромогенная смесь хранению не подлежат; - Разведённый фосфато-солевой буферный раствор (ФСБ-Т) можно хранить при температуре +2-8С не более 5 дней; - Для отбора и добавления реагентов и анализируемых проб необходимо использовать полуавтоматические пипетки со сменными наконечниками, аттестованные на точность по значению средней дозы и воспроизводимости результатов пипетирования; - Для получения надёжных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции по применению набора; - Набор реагентов « ДИАНАРК-О» можно использовать в течение срока годности, проводя анализ на целом планшете (46 определений, один отрица тельный и один положительный контрольные образцы); набор также можно использовать по частям, проводя анализ на отдельных стрипах планшета, но каждый раз необходимо ставить положительный и отрицательный контроль ные образцы; - Меры предосторожности: - Все компоненты набора, за исключением стоп-реагента (раствор серной кислоты), в используемых концентрациях являются нетоксичными. Раствор серной кислоты обладает раздражающим действием. Избегать разбрызгивания и попадания на кожу и слизистые покровы. При попадании на кожу и слизистые покровы следует смыть большим количеством проточной воды; - При работе с набором следует соблюдать «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены; - При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, так как образцы мочи человека следует рассматривать как потенциально инфицированные, способные передавать возбудители вирусных инфекций.

Обнаружение опиатов в моче человека методом иммуноферментно-го анализа с помощью набора реагентов «Дианарк 0»

Морфин (Morphine): Способы применения морфина - пероральное, подкожное (п/к), внутримышечное (в/м) или внутривенное (в/в) введение. Дозы препарата зависят от возраста пациента, его веса и поставленного ему диагноза. Так, например при сильных послеоперационных болях, инфаркте, травмах назначают 20 мг (пациентам до 70 кг), или 30 мг (свыше 70 кг) каждые 12 ч [15].

Трамадол (Tramadol): Способы применения трамадола - пероральное, ректальное, подкожное (п/к), внутримышечное (в/м) или внутривенное (в/в) введение. Дозы препарата зависят от возраста пациента, тяжести его заболевания. Так, например при сильных болях разовая доза составляет 1 мл (50 мг), дневная доза не более 400 мг [10, 16].

Героин по своему строению отличается от морфина тем, что вместо двух гидроксилов в своей молекуле он содержит две ацетогруппы. Именно по этим группам в организме героин подвергается гидролизу в крови до 6-моноацетилмофина, и затем до морфина.

Героин синтезируют в подпольных лабораториях из морфина (или любого морфин - содержащего сырья: морфина-сырца, экстракционного опия, экстракта маковой соломы) по реакции ацетилирования с образованием активного действующего компонента - диацетилморфина (ДАМ).

Чистый героин - белый порошок с горьким вкусом. Нелегальный героин может отличаться по цвету и агрегатному состоянию. Цвет порошка от белого до темно-коричневого определяется количеством примесей, полученных в процессе производства, или в большинстве случаев присутствием пищевых красителей, какао или карамелизованного сахара [2-3, 22].

Так, например «Китайский героин»- героин из Юго-Восточной Азии -белый порошок, который состоит из диацетилморфина гидрохлорида и небольших количеств других опийных алкалоидов. Героин из Юго-Западной Азии более неочищенный, представляет собой коричневый порошок, который состоит из диацетилморфина (основной компонент), и различных количеств других опийных алкалоидов (например, моноацетилморфин, носкапин, папаверин, ацетилкодеин), также возможно наличие примесей кофеина и парацетамола [23, 33].

Агрегатное состояние зависит от происхождения (вида) героина: тонкий порошок, гранулы, порошок с небольшими сыпучими агрегатами.

Состав зависит от качества сырья для ацетилирования, содержания морфина, соблюдения условий реакции, условий хранения и транспортировки, фальсифицирующих добавок. Состав нелегального героина может содержать до 30—40 компонентов, среди которых: диацетилморфин от 20 до 80-90%, ацетилкодеин 2-5%, 6 - моноацетилморфин 1-15%, носкапин 0-10%, папаверин 0-4%, морфин 0,04-0,35% [3]. Сырьем для производства героина является опий, который в свою очередь получают из Мака снотворного [33]. Большинство опиоидных анальгетиков хорошо всасывается из мест подкожного и внутримышечного введения, а также со слизистой оболочки носа, полости рта и ЖКТ.

Максимальная концентрация морфина в плазме при внутривенном введении (в/в) достигается за 2-15 мин и соответствует максимуму эффекта, при внутримышечном введении (в/м) - 7,5-20 мин, при единичном приеме внутрь (перорально, ОР) - 30-120 мин. Затем уровень морфина быстро снижается. Из-за метаболизма в печени и стенках кишечника биодоступность при в/в и в/м составляет 100% и только 30-40% при ОР введении. Максимальная концентрация в плазме при ОР введении существенно ниже, чем при в/в введении эквивалентной дозы морфина.

При в/в введении субклинических доз морфина (2 мг) максимальная концентрация в плазме (200 нг/мл) достигается через 3-4 мин, затем снижается до 6 нг/мл через 20 мин и примерно до 2 нг/мл в интервале 3— 6 ч. (см. приложение №1 — диаграмма №1)

Кинетика элиминирования из плазмы свободного и связанного морфина различны. После введения 1 мг/кг морфина (инъекции в спинномозговой канал) максимальная концентрация свободного морфина в плазме обнаруживается равной 100 нг/мл в интервале 2-5 мин и уменьшается до 60 иг/мл в течение 1-1,5 ч, далее до 15-10 нг/мл через 2-4 ч. Концентрация связанного (конъюги-рованного) морфина увеличивается при этом от 9 до 80 нг/мл в интервале 2-20 мин и затем остается неизменной по крайней мере до 4 ч. (см. приложение №1 - диаграмма №2) [2-3,33].

Количественное определение морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором

С этой уелью применяют два способа гидролиза: неспецифический кислотный и специфический ферментативный (энзимный) гидролиз. Кислотный имеет более короткое время инкубации и более прост в осуществлении. Однако вследствие неспецифичности реакции расщепления ковалентной связи и довольно жестких условий проведения гидролиза в среде концентрированной кислоты при кипячении в течение длительного времени или при нагревании в автоклаве под давлением, он сопровождается образованием большого количества побочных продуктов. Экстракты гидролизата продуцируют высокий фон и большое число интенсивных посторонних пиков при ГХ-анализе. Кроме того, возникает необходимость нейтрализации кислоты перед экстракцией [2, 13].

Кислотный гидролиз проводят в герметично закрытых сосудах, которые помещают в водяную баню или нагревательный блок. Кроме того иногда применяют кипячение с обратным холодильником или нагревание при 100-125С в автоклаве под повышенным давлением 12-15 psi. Эффективность гидролиза морфин-3-глюкуронида при 100С в автоклаве (12 psi) более 90%.

Ферментативный гидролиз под действием смеси ферментов р глюкуро-нидазы и р-сульфатазы из различных источников (Helix pomatia, Escherichia coli, Patella vulgata, Helix aspersa и других) является специфичным, проходит в мягких условиях и уменьшает образование побочных продуктов, в результате чего гидролизованный образец получается более чистым [95-96, 106].

Скорости гидролиза 3-0- и 6-О-глюкуронидов морфина из-за различия природы химической связи сильно различаются и МЗГ гидролизуется легче, чем М6Г. Связь спиртовой ОН группы с глюкуроновой кислотой в М6Г менее подвержена гидролизу, чем связь глюкуроновой кислоты с электронно-обогащенным фенольным гидроксилом в МЗГ. Скорости кислотного гидролиза 6-глюкуронидов морфина и кодеина подобны, как и следовало ожидать из-за сходства природы ковалентной связи О-глюкуронид. Таким образом, конъюгаты, в которых связь с глюкуроновои кислотой осуществляется через атом кислорода фенольного гидроксила (морфин-3-глюкуронид), легче гид-ролизуются, чем соединения со связью через кислород спиртовой гидро-ксильной группы (морфин- 6- и кодеин-6-глюкурониды) [2, 45].

В результате гидролиза проба обогащается не только анализируемыми компонентами в свободном виде, но также многими низкомолекулярными соединениями, находившимися ранее в связанном состоянии, и высокомолекулярными остатками, способными соэкстрагироваться с анализируемыми веществами.

Методика 1. 1 мл пробы мочи (плазмы) отбирают в 12-мл экстракционную пробирку. Добавляют 100 мкл раствора внутреннего стандарта (400 нг/мл или 2,5 мкг/мл морфин4)3), перемешивают (на аппарате для встряхивания «Вортекс», далее Вортекс) 10 сек и ставят на 15 мин для установления равновесия. Гидролиз проводят с 1 мл 6 м хлороводородной кислоты (готовят из концентрированной кислоты разведением дистиллированной водой 1:1) в кипящей водяной бане в течение 1 часа. Затем охлаждают до комнатной температуры. См. далее Методика 2 [2].

Применение экстракции при пробоподготовке биологических объектов. Удаление эндогенных и экзогенных компонентов, в том числе освободившихся в результате гидролиза, и концентрирование анализируемого вещества осуществляется при экстракции. Для изолирования опиатов из биожидкостей применяют как широко распространенный метод жидкость-жидкостной экстракции (ЖЖЭ), так и получивший признание в последние годы метод с использованием твердых сорбентов, известный под названием «метод твердофазной экстракции» (ТФЭ) [2, 21].

Оба метода не лишены недостатков. Метод ЖЖЭ приводит к соэкстра-гированию значительного количества компонентов матрицы, требует использования опасных и вредных органических растворителей, кроме того, в про . цессе экстракции возможно образование стойкой эмульсии, для разделения фаз в которой необходимы особые приемы [43, 100].

Метод ТФЭ выполняется с применением коммерческих микроколонок., заполненных твердыми сорбентами, («картриджей»), различных фирм и является более унифицированным. Система для вакуумирования позволяет одновременно анализировать серию (8-30) образцов и поддерживать одинаковые условия изолирования. Метод требует гораздо меньше времени для выполнения и обеспечивает получение более чистого фона элюата, чем в случае ЖЖЭ. Влияния матричных элементов биожидкостей практически не наблюдается, основными примесями, дающими высокоинтенсивные пики на хро-матограммах (ВЭЖХ и ГХ/МС) являются пластификаторы (фталаты) и привитые группы сорбента. Основным недостатком ТФЭ является неоднородность распределения частиц сорбентов по размеру даже для одной серии картриджей. Существенным недостатком является также наличие фракции частиц малого диаметра (менее 20 микрон), что ведет к значительной вариабельности скорости потока жидкости через сорбент. Кроме того в некоторых случаях (плазма, моча) метод показывает низкую эффективность (30 - 50 %) и недостаточную воспроизводимость экстрагирования опиатов (морфина, кодеина, 6-МАМ), а также высокий уровень нулевой линии с несколькими пиками высокой интенсивности. Вместе с тем приводятся данные о высоком (до 95%) извлечении морфина и 6-МАМ из плазмы и мочи [2].

Потери веществ на отдельных стадиях пробоподготовки (определенные с помощью меченых соединений С-14) возрастают с увеличением объема растворителя при экстракции, при введении стадии высаливания из-за со-осаждения и за счет потерь летучих соединений на стадии удаления растворителя (упаривания). Фильтрование ведет к потере до 20% вещества и поэтому его не применяют, а заменяют центрифугированием.

Похожие диссертации на Методы исследования морфина и трамадола в судебно-химическом анализе