Содержание к диссертации
Введение
1 Основные принципы ионоэксклюзионнои хроматографии .. 9
1.1 Основные физико - химические свойства карбоновых кислот 18
1.1.1 Факторы, влияющие на удерживание органических кислот в ионоэксклюзионнои хроматографии 22
1.1.2 Степень ионизации сорбата 22
1.1.3 Зависимость времени удерживания кислот от их значений рКа ирНэлюента. 23
1.2 Размер молекул сорбата 24
1.3 Гидрофобные взаимодействия между сорбентом и подвижной фазой 25
1.4 Ионообменная емкость сорбентов 29
1.5 Температура 29
1.6 Сорбенты для ионоэксклюзионнои хроматографии 30
1.7 Элюенты для ионоэксклюзионнои хроматографии 38
1.8Детекторы, применяемые в ионоэксклюзионнои хроматографии 45
2 Экспериментальная часть 52
2.1 Реактивы и оборудование 52
2.2 Ионоэксклюзионное определение карбоновых кислот . 53
2.2.1 Выбор сорбента 53
2.2.2 Выбор размера колонки 56
2.2.3 Выбор элюента 62
2.2.4. Выбор скорости подачи элюента 65
2.3. Гемоконсерванты и инфузионные растворы 66
2.3.1. Цитратсодержащие гемоконсерванты 71
2.3.2. Инфузионный раствор "Мафусол". 82
2.3.3 Инфузионный раствор "Рингера - ацетат" 88
2.4. Плазмозаменитель "Альбумин" 92
2.5. Препараты на основе ацетилсалициловой кислоты 101
2.6. Лекарственные растения 112
Выводы 130
- Размер молекул сорбата
- Элюенты для ионоэксклюзионнои хроматографии
- Ионоэксклюзионное определение карбоновых кислот
- Гемоконсерванты и инфузионные растворы
Введение к работе
Хроматографические методы исследования находят все большее применение в фармацевтической практике благодаря экспрессное™, точности, высокой воспроизводимости, простоте пробоподготовки. Эти достоинства оказываются незаменимыми при контроле качества и стандартизации фармацевтических препаратов, находящихся в разных формах. Среди хроматографических методов ионоэксклюзионная хроматография (ИЭХ) оказывается наиболее эффективной при определении слабых органических кислот.
Учитывая, что именно такие кислоты (в виде солей) являются биологически активными в гемоконсервантах, инфузионных растворах, некоторых лекарствах, находящихся в твердой форме, для их определения был выбран метод ионоэксклюзионной хроматографии как один из наиболее современных. Необходимо отметить, что зачастую методы определения данных кислот, указанные в соответствующих фармстатьях или в Фармакопее, являются устаревшими. Причин тому несколько: их общая длительность, трудоемкость, сложная пробоподготовка, низкая воспроизводимость. Переход нашей фармацевтической промышленности на международные стандарты, возможная разработка новой Фармакопеи требуют и новых аналитических разработок, выполненных с использованием современной инструментальной базы.
Исследования, выполняемые в отношении лекарственных растений, позволяют выяснить их химический состав, который весьма сложен и с трудом поддается точному анализу другими, кроме ионоэксклюзионной
хроматографии, методами. Возможность стандартизации растительного сырья по профилю хроматограмм могла бы стать хорошим дополнением для установления подлинности растительного сырья. С медицинской точки зрения представляется интересным проведение корреляции между фармакологическим действием данного лекарственного растения и содержанием в нем биологически активных карбоновых кислот.
Цель работы
Разработка современных хроматографических методов контроля качества и стандартизации фармацевтических препаратов.
Научная новизна работы
Предложен новый подход к анализу фармацевтических препаратов на содержание алифатических и ароматических кислот с использованием ИЭХ. Найдены условия точного и селективного определения ряда органических кислот.
При использовании кондуктометрического детектирования для ряда органических кислот, входящих в состав гемоконсервантов и инфузионных растворов, найдены аналитические характеристики их ИЭХ определения. Показана возможность определения макроколичеств лимонной кислоты при анализе цитратсодержащих гемоконсервантов без предварительного разбавления пробы при использовании петли-дозатора малого объема.
Методом ионоэксклюзионной хроматографии с УФ детектированием проведен количественный анализ лекарственных препаратов на основе ацетилсалициловой кислоты, найдены его аналитические характеристики.
Достигнута высокая селективность определения ацетилсалициловой кислоты в присутствии возможных кислот-загрязнителей.
Методом ионоэксклюзионной хроматографии определен качественный и количественный состав ряда лекарственных растений. Проведена корреляция между фармакологическим действием растений и содержанием в них карбоновых кислот.
Практическая значимость
Предложен современный инструментальный метод ионоэксклюзионной хроматографии для контроля качества фармацевтических препаратов, находящихся как в жидкой, так и в твердой формах.
Этот же метод, благодаря высокой точности, может быть рекомендован для качественного и количественного рутинного анализа химического состава лекарственных растений.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Хроматографические условия (сорбенты, элюенты) ИЭХ определения алифатических карбоновых кислот в гемоконсервантах и инфузионных растворах с применением кондуктометрического детектора.
2. Аналитические характеристики ИЭХ определения ряда кислот, входящих в эту группу препаратов.
3. Способ определения больших концентраций (до 30 г/л) лимонной кислоты методом ионоэксклюзионной хроматографии без разбавления пробы при использовании петли-дозатора малого объема.
4. Способ ионоэксклюзионнохроматографического определения ацетилсалициловой кислоты в лекарственных препаратах с
использованием УФ детектора. Обоснование выбора наиболее подходящих сорбента и элюента для определения этой и других ароматических кислот (бензойная, салициловая).
5. Данные о влиянии органических модификаторов на определение ацетилсалициловой кислоты и на ее селективное отделение от возможных кислот-загрязнителей.
6. Результаты изучения химического состава около 40 наиболее известных лекарственных растений на предмет содержания в них биологически активных карбоновых кислот.
7. Аналитические характеристики ИЭХ определения одной из наиболее значимых в составе лекарственных растений карбоновых кислот — аскорбиновой.
8. Способ ионоэксклюзионнохроматографического определения сильноудерживаемой каприловой кислоты в плазмозаменителе "Альбумин". Аналитические характеристики для каприловой кислоты.
Апробация работы и публикации
Результаты исследований докладывались на IX Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2002), Всероссийском симпозиуме "Современные проблемы хроматографии" (Москва, 2002), X Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2003), Третьем международном симпозиуме "100 Years of Chromatography" (Москва, 2003), на научных коллоквиумах лаборатории хроматографии кафедры аналитической химии химического факультета МГУ. По материалам диссертации опубликовано 8 работ в виде статей и тезисов докладов.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, шести глав экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы, приложения. Материал диссертации изложен на 149 страницах текста, содержит 31 рисунок и 39 таблиц, в списке цитируемой литературы 144 наименования.
Размер молекул сорбата
Было выяснено, что для среднецепочечных карбоновых кислот (Сз, d) Vr меньше, чем это предсказывалось только на основании их значений рКа [23]. Как предполагают некоторые авторы [25-27], эффекты эксклюзии по размеру могут вносить свой вклад в процессы удерживания в ИЭХ из-за невозможности проникновения больших молекул в элюент, окклюдированный внутри пор сорбента. Эффект эксклюзии по размеру приводит к следующим характеристикам удерживания: 1.Объемы удерживания для больших по размеру, частично ионизированных молекул веществ, оказались меньше, чем это ожидалось из величин заряда растворов. 2.Большие по размеру, но нейтральные молекулы, имеют величину Da 1, а не Da = 1, как это предполагалось только из учета Доннановской эксклюзии (нейтральные молекулы не отталкиваются от матрицы сорбента и должны были бы проникать во все поры сорбента и элюироваться с общим объемом растворителя в колонке). 3.Большие нейтральные частицы, которые элюируются с удерживаемым объемом, меньшим, чем (Vo + Vj), должны элюироваться в порядке уменьшения их молекулярного размера. Гидрофобные взаимодействия между сорбентом и подвижной фазой Карбоновые кислоты (Сб — Cg для дикарбоновых) и (Сз - С5 для моно-карбоновых) удерживаются на ИЭХ-колонке сильнее, чем предсказывалось на основе их значений рКа [23], и элюируются в порядке увеличения их молекулярного веса (что полностью противоположно эффекту эксклюзии по размеру). Аномальное поведение этих кислот объясняется гидрофобным взаимодействием нейтральных участков молекул этих кислот с полимерной матрицей сорбента [23]. Эффект гидрофобных взаимодействий возрастает по мере увеличения длины углеводородного радикала, что приводит к повышению значений Vr карбоновых кислот. Увеличение длины алкильной цепи молекул может привести как к уменьшению удерживания вследствие эксклюзии по размеру, так и к увеличению удерживания из-за гидрофобных взаимодействий.
В случае дикарбоновых кислот, гельфильтрационные эффекты доминируют для кислот С3-С4, а для более длинноцепочечных кислот (Сб — Cg) доминируют эффекты гидрофобных взаимодействий с матрицей сорбента. Уменьшить влияние гидрофобных взаимодействий на удерживание кислот в ИЭХ можно добавлением органических модификаторов в элюент (метанол, ацетонитрил). Уменьшение времен удерживания некоторых веществ может быть значительным, что продемонстрировано в [28]. В этой работе в качестве элюента используется деионизованная вода. Значительное введение метанола в элюент практически не изменяет Vr небольших молекул (муравьиной и уксусной кислот), но для веществ с большой молекулярной массой наблюдается значительное уменьшение Vr, например, для валериановой кислоты [28]. В работе [37] для того, чтобы оценить влияние гидрофобных взаимодействий к 0,1 ммоль/л раствору серной кислоты, используемой в качестве элюента, добавлялся органический модификатор - метанол. На рис. 4 показана связь концентрации метанола и объемов удерживания Рис. 4. Влияние концентрации метанола в элюенте на объемы удерживания для НС1 и алифатических карбоновых кислот. Элюент: 0,1 ммоль/л серная кислота с содержанием метанола 0-20%. Колонка TSK gel ОА рак-А (полиметакрилат). Детектор - кондуктометрический. Кислоты: 1-хлороводородная, 2-муравьиная, 3-уксусная, 4-пропионовая, 5-масляная, 6-валериановая, 7-капроновая [37] алифатических карбоновых кислот. С увеличением концентрации метанола объемы удерживания хлороводородной, муравьиной, уксусной и пропионо-вой кислот практически не меняются, в то время как для высших кислот (С4 -Сб) они значительно снижаются. Для капроновой кислоты объем удерживания снижается с 66,2 мл для концентрации серной кислоты 0,1 ммоль/л до 33,7 мл для элюента с добавлением 20% метанола.
Такое сильное уменьшение вызывается скорее липофильными свойствами алкильной группы метилового спирта, чем гидрофильными свойствами спиртовых групп метанола. Время анализа сложных смесей также уменьшается с введением органического растворителя в элюент. В работе [12] исследовано влияние гидрофобных взаимодействий для трех различных типов смол. Одной из них была Tosoh TSK Gel SCX (характеристики см. в табл.3), другой - TSK Gel SP-5PW той же фирмы Tosoh (размер частиц 5 мкм, ионообменная емкость 0,3 мэкв/г). Первая из этих смол была на основе полистиролдивинилбензольной матрицы, вторая - на основе сульфированного полиметакрилата. Наконец, третья колонка (300 х 7,8 мм) была заполнена сульфированным силикагелем Develosil (5 мкм, 0,275 мэквг/г). Рис.5 показывает линейную зависимость логарифма коэффициента адсорбции недиссоциированной формы анализируемой кислоты, In Кадс от площади поверхности, А. Угол наклона кривых свидетельствует, что гидрофобные взаимодействия (адсорбция) играют важную роль в механизме удерживания исследованных кислот (уксусная, пропионовая, масляная и валериановая). В некоторые колонки разрешается вводить элюент лишь с незначительными добавками модификатора во избежания сжатия и разрушения сорбента. Возможность изменять время удерживания путем добавления в элюент органических модификаторов открывает перспективы для использования градиентного элюирования. Это было доказано при использовании сульфированного макропористого сорбента с метанольным градиентом [29]. Было показано [23], что удерживание карбоновых кислот уменьшается в следующем ряду ионных форм сорбента:К+ Cs+ NHj Na+ Li+ ЬҐ". Этот ряд является обращенным по отношению к гидратированным радиусам этих катионов, за исключением иона NH/, который имеет тот же самый радиус, что и К+. Предполагают, что присутствие связанного гидратиро-ванного катиона большого радиуса приводит к уменьшению гидрофобной площади поверхности сорбента и изменяет как величину Vo, так и Vj колонки, каждая из которых может приводить к уменьшению удерживания веществ [23]. Некоторые ионоэксклюзионные разделения возможны только на колонках в особой форме. Это особенно актуально для разделения моносахари-дов на катионообменнике в Са - форме, для которых возможен лигандный обмен, включающий взаимодействие между ионом Са и несвязанными ор-биталями атома кислорода сахара [36]. 1.3.6. Температура Повышение эффективности при увеличении температуры колонки достигается за счет ускорения массопереноса. Более низкая вязкость растворителя при повышении температуры позволяет использовать более высокие скорости потока элюента на неподвижных фазах гелевого типа, которые накладывают ограничения на повышение давления (при комнатных температурах). Влиянию температуры на определение карбоновых кислот в режиме ИЭХ посвящен ряд работ [26,30,31,32].
Оптимальным соотношением концентрации органического модификатора и температуры было достигнуто разделение ряда карбоновых кислот в [9] — одной из немногих работ, посвященных исследованию химического состава растений методом ионоэксклюзионной хроматографии. Наилучшей концентрацией модификатора (ацетонитрил) было признано значение 7,5%, наиболее подходящей температурой 50С. Исследуемые кислоты были как алифатическими (щавелевая, лимонная, винная, яблочная, янтарная, фумаровая, муравьиная и уксусная), так и ароматическими (галловая, фталевая, про-токатеховая, гентизиновая, 4 - гидроксибензойная, ванилиновая, бензойная, кумаровая и феруловая). Все алифатические кислоты элюировались прежде галловой кислоты. Гидрофильные кислоты, такие как галловая, фталевая и протокатеховая элюировались первыми. Удерживание гидрофобных ароматических кислот возрастало при уменьшении полярности раствора. Это можно объяснить гидрофобным взаимодействием между раствором и смолой (в данном случае - полистиролдивинилбензолом). На рис.6 представлена типичная хромато-грамма, полученная при анализе экстракта Lupinus angustifolius. Некоторые вещества при повышении температуры меняют свою форму и, следовательно, могут элюироваться с разными удерживаемыми объемами при разных температурах. Примером этого может служить увеличение удерживания частично ионизованных альдоновых кислот при более высокой температуре вследствие их конверсии в нейтральные лактоны [26]. Увеличение температуры может также являться причиной изменения константы диэлектрической проницаемости элюента, особенно когда присутствует органический модификатор. Это будет влиять на рКа кислот и, возможно, на их удерживание. 1.4. Сорбенты для ионоэксклюзионной хроматографии В ИЭХ чаще всего используют сульфированный стирол - дивинил-бензольный сополимер с высокой емкостью. Частицы, как правило, однородны по размеру и обычно не превышают 15 мкм. Основными параметрами неподвижных фаз, влияющими на удерживание, являются размер частиц, ионообменная емкость и степень сшивки сорбента.
Элюенты для ионоэксклюзионнои хроматографии
Выбор элюентов в методе ИЭХ обусловлен действующими в процессе разделения органических кислот физико-химическими механизмами. Как известно, кислоты отторгаются сорбентом будучи, по преимуществу, в молекулярной форме. Поэтому естественным представляется использование кислых элюентов с достаточно низким рН. Использование таких растворов позволяет практически полностью перевести слабые органические кислоты в молекулярную форму и существенно улучшить разделение. Впервые этот новый подход, который остался определяющим и в наше время, был использован Туркельсоном и Ричардсом в 1978 году [51]. В качестве элюента был использован 0,0IN раствор соляной кислоты. Был применен УФ детектор, а, как известно, неорганические анионы не поглощают в УФ диапазоне. Метод использовался для анализа биологических объектов. В самых ранних работах [70,71] в качестве элюентов использовали воду, но полученные пики были растянутыми и селективность весьма низкой. В современных исследованиях деионизованную воду используют, как правило, лишь для того, чтобы показать неоспоримые преимущества других элюентов [7,72-75]. В настоящее время в качестве элюентов обычно используют разбавленные растворы сильных кислот, таких как серная [7,4,76-78], соляная [47, 79-81] и алифатические сульфокислоты [82]. Иногда используют и некоторые другие кислоты, но в любом случае для таких кислот детектором является УФ- прибор. Кроме того, указанные сильные кислоты обладают высокой электропроводностью, и поэтому их применение при использовании кон-дуктометрического детектора весьма затруднено. На рис.8 показана разница при переходе от воды в качестве элюента (а) к серной кислоте (б). При использовании воды наблюдается плохая селективность и растянутая форма пиков. Это объясняется высокой степенью ионизации алифатических кислот в воде и сильными гидрофобными взаимодействиями.
Эти недостатки частично удалось устранить, используя в качестве элюента 2 мМ раствор серной кислоты. Селективность, однако, при этом все равно оказывалась недостаточной. Для преодоления этой проблемы были испробованы растворы некоторых ароматических кислот и наилучшее разделение было получено для фталевой кислоты в качестве элюента [142]. Для кондуктометрических детекторов были предложены более слабые кислоты. Танака и Фритц [28] впервые использовали для этой цели бензойную кислоту, электропроводность 5 мМ раствора которой составляет всего 5,6 мкСм/см, в противовес 81,6 мкСм/см для раствора серной кислоты той же концентрации. Другой пригодной кислотой была признана янтарная. В работе [83] янтарная кислота была признана наилучшей из ряда опробованных ароматических и двухосновных кислот. При использовании этой кислоты было получено наиболее полное разделение моно- и дикарбоновых кислот. Приемлемое разделение 11 кислот было получено всего за 20 мин. Отмечается, что относительно свободный характер выбора элюента в ИЭХ позволяет добиться высокой селективности разделения практически любой смеси кислот. Устранение мешающего влияния одной из кислот, имеющих близкое время удерживания с анализируемой кислотой, можно достичь, используя ее в качестве элюента. При этом кислота — элюент дает на хромато-грамме отрицательный пик. В качестве другого элюента с низкой электропроводностью была предложена фталевая кислота [84, 85]. При использовании 1 мМ раствора фталевой кислоты было получено хорошее разделение восьми кислот за 20 минут на сорбенте Aminex НРХ-87Н. В работе [86] фталевая кислота использовалась при фотометрическом детектировании. Угольная кислота была выбрана в качестве другой слабой кислоты для системы с кондуктометром в качестве детектора [87]. Одним из новых элюентов, пригодных как для непрямого фотометрического, так и для кондуктометрического детектирования, является 2,6 — пиридиндикарбоновая кислота. В работе [88] изучается влияние концентрации этой кислоты и признано, что концентрация 1 мМ является наилучшей. При этом пределы обнаружения колеблются в пределах 1,0 — 7,0 мМ для кондук-тометрического детектирования и от 8 до 30 мМ для УФ-детектирования. По сравнению с 1 мМ H2SO4 такой элюент демонстрирует лучшее разделение и более высокую чувствительность для обоих детекторов. В последнее время интенсивно ведутся поиски новых элюентов, имеющих более низкую электропроводность, чем бензойная, янтарная и фталевая кислоты. Для этой цели используются растворы Сахаров и многоатомных спиртов. При адсорбции этих веществ гидрофобность поверхности по-ливинилстирольного катионообменника значительно понижается. При этом, соответственно, увеличивается гидрофильность сорбента и уменьшаются гидрофобные взаимодействия анализируемых кислот с поверхностью сорбента, что обеспечивает высокую селективность разделения.
Повышение чувствительности достигается за счет очень низкой фоновой электропроводности элюента. При исследовании в качестве элюентов многоатомных спиртов и Сахаров, содержащих от 1 до 8 спиртовых групп, наилучшим был признан 0,15 М раствор сахарозы с примесью 10% метанола. У этого элюента более низкая фоновая электропроводность (4 мкСм/см) и намного более высокая чувствительность, чем для 0,5 мМ раствора серной кислоты (390 мкСм/см) [89]. Для разделения этаноламинов также использовались растворы многоатомных спиртов и Сахаров. Было найдено, что форма пиков улучшается с увеличением числа ОН -групп в многоатомных спиртах и сахарах [75]. Отмечается, что чувствительность определения карбоновых кислот улучшается с увеличением длины цепи добавляемого спирта. Причем в ряду метанол — бутанол чувствительность возрастает с уменьшением концентрации органического модификатора. Известно, что степень ионизации карбоновых кислот тем выше, чем выше содержание воды в элюенте. В случае чистой воды степень диссоциации достигает 69 - 97%. Проводились подробные исследования с целью выяснения влияния рН элюента на разделение [11]. Этот аспект особенно важен при определении анионов многоосновных кислот. В работе [15] показано влияние рН на существование малоновой кислоты в разных валентных формах. Так, при рН= 4 существуют, в основном, одновалентные анионы, тогда как при рН выше 7,5 кислота существует уже в виде двухвалентных кислотных анионов ( рис.9). Хаддад и Коуи показали возможность использования компьютеров для решения проблемы зависимости разделения от рН элюента [90]. В работе [13] отмечается, что хотя изменение рН элюента и является важным параметром для оптимизации процесса разделения, но меняя рН в диапазоне 1,8 — 2,3 не удается добиться существенного изменения времен удерживания для большинства веществ. Наиболее эффективным инструментом оказалось, однако, совместное изменение рН элюента и температуры рабочей колонки. По пути использования сразу двух этих факторов пошли многие исследователи [30,31,91]. В последней работе отмечается, что при рН 2 рК становится доминирующим фактором для разделения сахарных кислот сходного размера и одинаковой длины цепи. Удерживание нейтральных веществ, таких как лактоны, почти не зависит от рН элюента. В последние годы очень широко применяется введение в состав элю-ентов органических модификаторов. Введение таких органических добавок уменьшает сродство гидрофобных молекул к стационарной фазе. В работе [33] изучалось влияние некоторых спиртов, других органических растворителей, включая ацетонитрил, на времена удерживания ряда алифатических кислот. Было обнаружено, что бутанол обладает наибольшим коэффициентом разделения среди изученных спиртов, поэтому лишь небольшое добавление этого спирта в воду (4%) достаточно, чтобы изменить свойства поверхности сорбента. Результаты представлены в табл.5.
Ионоэксклюзионное определение карбоновых кислот
Из литературных данных [121] известно, что для заполнения колонок в ИЭХ используются катионообменники высокой емкости с малой степенью сшивки (2-5%), иногда вместо макропористых используются гели и гелепо-добные сорбенты, но в любом случае в качестве матрицы сорбента используется стиролдивинилбензольный каркас. Сорбентов, отвечающих этим требованиям, сравнительно немного. Нами были исследованы следующие: из макропористых - AG 50Wx2; AG 50Wx4; AG 50Wx8; Aminex H 50Wx2 и 50Wx4; Dowex 50Wx2; 50Wx3; 50Wx4; 50Wx5, из гелевых - Aminex Q-15S; Aminex SB Blend Q 60, а также специальный сорбент смешанного типа. Aminex А5. Характеристики некоторых из этих сорбентов приведены в табл.7. Нами было установлено, что все эти сорбенты способны разделять как алифатические, так и жирноароматические кислоты (фенолкарбоновые), однако, каждый их них имеет свою особенность. В частности, для сорбентов типа Aminex Н 50Wx(2,4) разница во временах удерживания для дикарбоно-вых кислот значительно меньше, чем для монокарбоновых, Таким образом, когда необходимо исследовать объекты, содержащие большое количество монокарбоновых кислот (вплоть до каприновой), но не содержащие дикарбо-новых кислот (или содержащие лишь одну), эти сорбенты подходят наилучшим образом. К сожалению, для определения фенолкарбоновых кислот эти сорбенты практически не используются, так как даже самые простейшие кислоты (фенилуксусная) имеют время удерживания значительно больше 60 мин.
Что касается сорбентов Dowex 50Wx(2,3,4,5), то эти сорбенты хорошо разделяют дикарбоновые кислоты, у них высокая селективность при разделении дикарбоновых кислот с низшими монокарбоновыми (например, сочетание яблочной и муравьиной кислот), но время анализа на этих сорбентах резко увеличивается (по сравнению с сорбентами Aminex в 1,5 - 2 раза). Сорбент Dowex рекомендуется использовать для анализа природных объектов, содержащих фруктовые кислоты, такие как винная, лимонная, щавелевая, яблочная, янтарная. Гелевые сорбенты Aminex Q-15S и Aminex SB Blend Q 60 одинаково селективно разделяют как моно-, так и дикарбоновые кислоты. При этом время анализа не превышает 45 мин, однако у сорбента Aminex Q-15S есть преимущество: селективность разделения низших моно- и высших дикарбоновых кислот у него намного выше. Кроме того, поскольку планировалось использовать этот сорбент в сочетании с кондуктометрическим детектированием, было учтено, что сродство к органическим кислотам, использующимся в качестве элюента, у данного сорбента наибольшее. Поскольку в нашу задачу входило не только определение алифатических кислот, но и ароматических, было необходимо найти сорбент, который бы обладал значительно меньшим сродством к ароматическому ядру исследуемых кислот, чем Aminex Q-15S, но в то же время проявлял удовлетворительную селективность для разделения ароматических кислот. После проведения предварительного тестирования установили, что всем перечисленным качествам отвечает сорбент Aminex А5, и хотя этот сорбент рекомендован совершенно для другого класса соединений [42], на нем получены хорошие результаты при определении ароматических кислот. Данный сорбент при разделении фенолкарбоновых кислот оказался более предпочтительным по сравнению с сорбентом Aminex Q-15S, т.к. в области средне- и сильноудер-живаемых компонентов значительно (в 1,5 и более раз) уменьшает время удерживания.
При этом селективность разделения легкоудерживаемых компонентов не ухудшается. Кроме того, за счет улучшения формы пиков (более узкие и высокие) улучшается предел обнаружения. Рис.11а,б позволяют проследить эту разницу для двух сорбентов при разделении нескольких ароматических кислот. В частности, время удерживания для бензойной кислоты уменьшается с 76,5 до 45,0 мин, а для салициловой кислоты - с 88,3 до 60,2 мин (скорость потока 0,8 мл/мин, элюент - 20 мМ серная кислота). 2.2.2. Выбор размера колонки Из литературных данных известно, что для определения алифатических карбоновых кислот используют два размера колонок: диаметром 7 - 8 мм и длиной 200 - 300 мм в Европе и США и диаметром 9-11 мм и длиной 150 - 200 мм в Японии. Мы остановили свой выбор на сорбенте Aminex Q-15S и проверили селективность разделения на колонках нескольких размеров. На рис.12 представлена зависимость времени удерживания кислот от длины колонки. Были посчитаны величины разрешения (R) для двух ближайших пиков кислот моно-, дикарбонового ряда и оксикислот для различных длин колонки (при постоянном диаметре) и для различных диаметров колонки (при постоянной длине). Полученные данные представлены в табл.8. Зависимость разрешения (R ) от длин и диаметров колонок для трех пар кислот (из рядов моно-, дикарбоновых и оксикислот) представлена на рис.13. Из рис.13 и табл.8 видно, что максимальное разрешение для всех трех пар кислот достигается при длине колонки равной 300 мм. Для окси- и дикарбоновых кислот при увеличении длины колонки до 400 мм и 500 мм значения R увеличиваются незначительно (наблюдается "насыщение"), а для сильноудерживаемых монокарбоновых кислот (валериановая, капроновая) при переходе от длины 300 мм к длине 400 и 500 мм наблюдается незначительное увеличение селективности разделения кислот, но при этом резко возрастает время анализа. Поэтому в качестве оптимальной выбрана длина колонки, равная 300 мм, при диаметре 8 мм. Исходя из полученных данных, в качестве оптимальной для ИЭХ была выбрана колонка размером 8 х 300 мм. В публикациях, касающихся определения фенолкарбоновых кислот, данных о геометрии колонок не было обнаружено. В нашей работе мы руководствовались следующим принципом: сродство сорбента к бензольному ядру исследуемых кислот зависит от индивидуальных особенностей сорбента и его объема.
Для определения ароматических кислот мы остановились на сорбенте Aminex А5. Постепенно уменьшая диаметр и длину колонки, мы добились селективного разделения ароматических кислот (ацетилсалициловая, бензойная, салициловая) за сравнительно короткое время. При этом моно-карбоновые кислоты селективно разделяются и не мешают определению ближайшей к ним ацетилсалициловой кислоты. Эти результаты получены при размере колонки 6 х 250 мм. 2.2.3. Выбор элюента Поскольку нами были исследованы два детектора - кондуктометри-ческий для прибора "Цвет-3006" и УФ - детектор для прибора "Kontron 430А", то выбор элюента был индивидуален для каждого вида детектора. По причинам, которые неоднократно указывались в литературе [121, 122], мы отошли от метода двухколоночной ИЭХ и использовали в качестве элюентов различные алифатические и ароматические карбоновые кислоты в одноколо-ночном режиме. К преимуществам этого варианта можно отнести, во-первых, отсутствие подавляющей колонки, которую необходимо либо регенерировать, либо регулярно менять и, во-вторых, отсутствие размывания как переднего, так и заднего фронтов пиков. В двухколоночном варианте такое размывание в подавляющей колонке неизбежно. В качестве элюентов были изучены следующие алифатические кислоты: щавелевая, янтарная, адипиновая. Все эти кислоты с успехом переводили исследуемые кислоты в молекулярную форму, однако вследствие недостаточного сродства этих кислот к сорбенту, времена удерживания большинства определяемых кислот были слишком велики. Кроме того, все эти кислоты могут встречаться в реальных объектах в концентрациях значительно меньших, чем в элюенте. При этом установлено, что зависимость высоты отрицательного пика определяемой кислоты от концентрации не является линейной. Следующей группой кислот, использованных в качестве элюентов, были ароматические кислоты, такие как бензойная, фталевая, салициловая. Из этих кислот наиболее подходящее сродство к сорбенту показала бензойная кислота. Кроме того, пики алифатических кислот, имеющих большое время удерживания (валериановая, капроновая, каприловая), при использовании фталевой и салициловой кислот в качестве элюентов имели несимметричную форму. Таким образом, мы остановились на бензойной кислоте в качестве элюента. Для наилучшего разделения в ИЭХ требуется как можно более низкий рН элюента для перевода анализируемых кислот в молекулярную форму. Однако любая кислота в больших концентрациях может давать высокий фоновый сигнал за счет своей электропроводности. Как показали эксперименты, бензойная кислота даже при своей максимальной концентрации (5 мМ) имеет очень низкое значение фоновой электропроводности, вследствие чего концентрация бензойной кислоты регламентируется только ее растворимостью. Максимально возможное значение концентрации бензойной кислоты -5 мМ достигается только после суточной диффузии растворенной кислоты в деионизованной воде.
Гемоконсерванты и инфузионные растворы
Определение биологически активных органических кислот проводится в лекарственных препаратах данной группы в присутствии значительных количеств неорганических ионов. Одним из старых методов определения кислот является титриметрия, но при простой инструментальной базе у этого метода есть существенный недостаток: определяется сумма кислот, тогда как важно знать содержание именно фармакологически значимых кислот. Особенно актуально это для цитратсодержащих гемоконсервантов. Наличие в глюкозо-цитратной (консервированной) крови большого избытка цитрата натрия, по мнению целого ряда авторов [124-126] действует токсически на больного. После быстрых внутриартериальных и внутривенных трансфузий такой крови наблюдаются реакции, выражающиеся дрожью, расширением зрачков, брадикардией, падением артериального давления, мышечным подергиванием, а иногда и летальным исходом. Это происходит из-за связывания ионизированного кальция крови больного цитратом, находящимся в избытке в переливаемой крови. Развивается гипокальцемия. Избыток цитрата может также вызывать спазм сосудов легочного русла реципиента, затрудняет работу правого желудочка сердца, оказывает угнетающее и токсическое действие на сердечную мышцу, вызывая спазм коронарных сосудов. При этом требуется введение препаратов кальция.
Сказанное выше дает представление о том, насколько важен контроль качества препаратов данной группы, тем более, что контролирующие организации отмечают не всегда высокий уровень качества таких лекарственных средств [127]. Стоит вопрос о разработке новых инструментальных методов исследования качественного и количественного состава данных препаратов, т.к. фармакопейные методы для этих лекарственных средств зачастую являются устаревшими. В отечественных методиках хроматографические способы определения являются весьма редкими, в то время как во многих зарубежных странах они сейчас уже весьма распространены [128]. Внедрение хромато-графических методик в отечественную фармацевтическую практику является весьма перспективным, учитывая экспрессность, точность и универсальность хроматографии. В литературе встречаются единичные работы, где метод ИЭХ используется для изучения жидких форм таких лекарственных средств. Так, в [46] определялись кислоты, спирты и сахара в инфузионных растворах с использованием рефрактометрического детектора. Растворы Рингера исследовались в [129] с применением кондуктометра. Качественный состав исследованного раствора Рингера: NaCl; КС1; CH3COONa; КН2Р04; MgCl2; ксилит. В состав исследованных нами лекарственных растворов входят лимонная, уксусная, фумаровая кислоты. Малеиновая кислота изучалась как нежелательная для присутствия в препарате "Мафусол". Работа проводилась на ионном жидкостном хроматографе "Цвет 3006". В качестве элюента была выбрана бензойная кислота с концентрацией 5 мМ и рН = 4,12.
Методика приготовления элюента была следующей: 1,22 г кристаллической бензойной кислоты вносили в мерную колбу на 2000 мл, добавляли около 1 л деионизованной воды, взбалтывали и оставляли на ночь, затем доводили водой до метки. Скорость подачи элюента менялась от 0,7 до 1,2 мл/мин. В качестве сорбента была выбран катионообменник AminexQ-15S. Как известно, органические кислоты в методе ИЭХ переводятся в молекулярную форму при использовании кислых элюентов, поэтому важно знать протолитические свойства исследуемых кислот. Константы диссоциации кислот, входящих в состав исследуемых препаратов, приведены в табл.9 [132]. Как отмечают многие исследователи [13,15,28], введение органических добавок в водные растворы элюентов, снижая диэлектрическую проницаемость среды и блокируя адсорбционные центры сорбента, уменьшает гидрофобное взаимодействие между молекулами органических кислот и стационарной фазой. Обьино для снижения времени удерживания в условиях ИЭХ используют добавки различных спиртов и ацетонитрила. Зависимость времени удерживания карбоновых кислот, находящихся в гемоконсервантах, инфузионных растворах, а также в лекарственных растениях от концентрации органических растворителей представлена в табл.10. Таблица 10 Изменение времени удерживания (мин) органических кислот в зависимости от концентрации органического модификатора (элюент: 5 мМ раствор бензойной кислоты, колонка: 8 х 300 мм, Aminex Q-15S, скорость подачи элюента F = 0,7 мл/мин) Как видно из данных табл. 12, недостаточно хорошо разделяются при данных условиях янтарная и фумаровая кислоты, играющие важную роль в фармакологии лекарственных растений. Для их лучшего разделения использовали УФ-детектирование и H2SO4 в качестве элюента. Это помогало и отделению оксалат-иона от неорганических кислот, что также важно при изучении состава лекарственных растений. 2.3.1. Цитратсодержащие гемоконсерванты В качестве объектов исследования было выбрано несколько цитрат-содержащих гемоконсервантов, выпускаемых отечественной промышленностью. Состав гемоконсервантов следующий: "Циглюфад": глюкоза безводная 30 г; кислота лимонная 1,365 г; гидроцитрат натрия двузамещенный 14 г; натрий фосфорнокислый 12-водный 7,5 г; аденин 0,34 г; вода до 1 л. Тлю-гицир": гидроцитрат натрия двузамещенный 20 г; глюкоза безводная 30 г; вода до 1 л. ЦФГА: лимонная кислота 3,27 г; цитрат натрия 31,94 г; натрий фосфорно-кислый однозамещенный 2-водный 2,51 г; глюкоза моногидрат 31,90 г; аденин 0,275 г; вода до 1 л. ЦФГ: лимонная кислота 3,27 г; цитрат натрия 31,94 г; натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный -2,51 г; глюкоза моногидрат 25,5 г; вода до 1л. Как указывают разработчики этих препаратов, кислые консервирующие растворы благоприятствуют сохранению эритроцитов крови жизнеспособными, они препятствуют карамелизации глюкозы при совместной стерилизации этого препарата и глюкозы. Лимонную кислоту применяют как самостоятельный стабилизатор при приготовлении глюкозоцитратных консервантов вместе с подщелачивающими веществами (фосфат натрия) в целях достижения нужного рН консерванта [133]. Из приведенного состава исследованных препаратов видно, что все растворы, кроме "Глюгицира" содержат фосфат-ион, который, однако, не мешает определению цитрат-иона, т.к. не удерживается в колонке. Для препарата "Циглюфад" фосфат-иону соответствует первый пик на хроматограмме (рис.15). Для "Глюгицира" этот пик отсутствует, т.к. данный препарат в своем составе не содержит фосфата. Линейность градуировочного графика для лимонной кислоты соблюдалась в очень широком диапазоне концентраций: 10 ч- 5000 мг/л. Исходя из полученного диапазона линейности, пробы растворов "Глюгицир" и "Циглюфад" готовили десятикратным- разбавлением препарата в деионизованной воде.
В этом случае определяемая концентрация цитрат-ионов находится в области линейности градуировочного графика. Стандартный раствор лимонной кислоты готовили путем растворения моногидрата лимонной кислоты (ч.д.а) в деионизованной воде. Известно, однако, что уменьшение объема вводимой пробы может позволить работать с концентрированными растворами без изменения чувствительности прибора. Исходя из того, что изучаемые нами гемоконсерванты содержат большое количество лимонной кислоты (как в чистом виде, так ив виде солей), были проведены исследования по уменьшению объема петли крана-дозатора для прямого ввода пробы без разбавления. Показано, что петли объемом 20 мкл позволяют работать с концентрированными растворами (до 30 г/л в пересчете на безводную лимонную кислоту) без изменения чувствительности прибора (рис. 16). Используя 8-ходовой кран-дозатор, можно одновременно работать с двумя петлями разных объемов для определения как макро-, так и микрокомпонентов. Воспроизводимость и сходимость результатов анализа при использовании крана-дозатора малого объема были исследованы на примере препарата "Глюгицир". Образец препарата "Глюгицир" серии 157 07 2000 последовательно хроматографировали 7 раз в идентичных условиях. Разбавление раствора при этом не производилось. Результаты представлены в табл. 13.
![Стандартизация и контроль качества лекарственных средств группы фторхинолонов методами хроматографии и ИК-спектроскопии [Электронный ресурс]](/i/i/4375/184827.png "Стандартизация и контроль качества лекарственных средств группы фторхинолонов методами хроматографии и ИК-спектроскопии [Электронный ресурс] Коновалов Андрей Александрович")
