Введение к работе
Актуальность темы. Анализ и стандартизация лекарственного растительного сырья является одной из главных задач при разработке и производстве лекарственных препаратов. Среди алкалоидов, имеющих практическое медицинское значение, выделяется группа алкалоидов спорыньи. В настоящее время алкалоиды спорыньи и их производные используются в акушерско-гинекологической практике, в хирургии, эндокринологии, дерматологии, офтальмологии, неврологии, психиатрии, гериатрии.
С целью поиска и поддержания штаммов при выращивании суперэлитных культур спорыньи для селекционно - генетических и физиолого -биохимических работ со склероциями необходимы достоверные и точные методики качественного и количественного определения содержания эрго-алкалоидов, причем в минимальных навесках лекарственного растительного сырья. Промышленное производство лекарственных средств на основе алкалоидов эрготоксиновой группы также нуждается в методиках входного аналитического контроля рожков спорыньи, поступающих на переработку.
Необходимо отметить, что существовавшие в России к моменту начала нашей работы методики количественного определения эргоалкалои-дов основывались на методе спектрофотометрии, который позволяет определять суммарное содержание эргоалкалоидов, крэме-этого, имелись методики, основанные на хромато-спсктрофотометрии, обладавшие недостаточной селективностью. Все эти методики не ставили, своей задачей определение содержания отдельных алкалоидов и их эпимеров в смесях.
Наиболее пригодным для решения подобных задач является современный полифункциональный физико-химический метод анализа - высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), сочетающая широкий диапазон аналитических возможностей качественной и количественной оценки с возможностью структурно - химических исследований.
Цель работы. Целью настоящей работы явилась разработка но вых методик качественного и количественного анализа алкалоидов эрго токсиновой группы с использованием метода ВЭЖХ в рожках спорыны эргокриптинового и эргокристинового штаммов, а также унификация ме тоднк анализа для различных штаммов эрготоксиновой группы, оптими зация номенклатуры товароведческих показателей качества в действующе! НД на рожки спорыньи.
Основные задачи исследования. Для достижения поставлен ной цели необходимо было решить следующие задачи:
разработать номенклатуру показателей и требования к качеству эр гокристина - стандартного образца и рабочего стандартного образца сум мы а- и Р-эргокриптинов;
подобрать условия разделения модельной смеси наиболее близки: по их составу к природному сырью набора эргоалкалоидов, представлен ных наиболее важными в практическом отношении соединениями;
подобрать условия количественной экстракции эргоалкалоидов и рожков спорыньи;
разработать методики количественного определения эргоалкалон дов, которые были бы пригодны для эргокриптинового и для эргокристи нового штаммов рожков спорыньи.
разработать методики анализа алкалоидов эрготоксиновой групп! в небольшой части отдельных склероций, с целью аналитического обеспе чения селекционно-генетических и физиолого-биохимических работ о спорыньёй.
Научная новизна. С учетом особенностей хроматографическоп поведения эргоалкалоидов в обращённо-фазной ВЭЖХ разработаны усле вия разделения основных алкалоидов эрготоксиновой группы спорыны при использовании хроматографических колонок 4*250 мм, Диасорб С) Т, ІОмкм (АОЗТ "Элсико", Москва, Россия), в системе: ацетонитрш
1,01 М фосфатный буфер с рН=7,0 (48:52, по объёму), при скорости элю-іии 1,5 мл/мин, позволяющая достичь оптимального внутрнгруппового эазделения.
На основании особенностей поглощения эргоалкалоидов в УФ-збласти спектра, определена длина волны 230 нм, при которой эргоалка-гоиды имеют значительное поглощение, а собственное поглощение ацето-яитрила минимально. Это позволило достичь значений открываемого минимума в 0,4 нг/мл для эргокристина и 0,5 нг/мл для р-эргокриптина соответственно.
В процессах хранения сырья спорыньи и производства происходит изменение эргоалкалоидов с образованием С8-эпимеров - эргопептшш-нов. С целью определения содержания эргопептининов разработаны условия их разделения при использовании хроматографических колонок 4*250 мм, Диасорб С16 Т, 10 мкм (АОЗТ "Элсико", Москва, Россия), в системе: ацетоннтрил-0,01 М фосфатный буфф с рН=7,0 (48:52, по объему), при скорости элюции 1,5 мл/мин, позволяющая достичь оптимального разделения.
При изучении хроматографического поведения 2-бром-сс-эргокриптина и 2-бром-р-эргокриптина установлены оптимальные параметры их разделения в условиях МКЖХ на хроматографе "Милихром" при использовании колонок КАХ-2, 2*64 мм, Силасорб С18, 5 мкм (АО "Научприбор", Орёл, Россия) в системе тетрагидрофуран - 0,01 М раствор гидрофосфата аммония (47:53, по объёму), при скорости элюции 30 мкл/мин и детекции при 254 нм.
С учётом химических особенностей эргоалкалоидов заключающихся в торможении образования С8-эпимеров в кислой среде, определены условия количественной экстракции суммы эргоалкалоидов из рожков спорыньи эргокриптинового и эргокристинового штаммов смесью ацетон -0,1 % ефная кислота (1:1, по объему), позволившие значительно сократить
- 4 -количество балластных веществ в экстракте и повысить устойчивость эр-гоалкалоидов в растворе элюента.
Практическая значимость раЗот. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:
методика количественного определения, номенклатура показателей качества сырья спорыньи (ТУ 64-4-96-93 "Рожки спорыньи эргокриптино-вого штамма", акт НПО ВИЛАР от 18 ноября 1996 г);
методика количественного определения содержания суммы а- и Р-эргокриптинов в рожках спорыньи отечественной селекции эргокриптино-вого штамма ВКМ F-2642D методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ТУ 64-4-96-95 "Рожки спорыньи эргокриптинового штамма", акт НПО ВИЛАР от 18 ноября 1996 г);
методика количественного определения содержания эргокристина в рожках спорыньи отечественной селекции эргокристинового штамма ВКМ F-340ID методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ТУ 64-4-124-95 "Рожки спорыньи эргокристинового штамма", акт НПО ВИЛАР от 18 ноября 1996 г);
номенклатура показателей качества РСО (СТП 64-10-39-47-93, ТУ 64-4-121-95 "Сумма а- и р-эргокриптинов - рабочий стандартный образец", ТУ 64-4-123-95 "Эргокристин - стандартный образец", акт НПО ВИЛАР от 18 ноября 1996 г).
методики количественного определения содержания суммы а- и р-эргокрнптинов и суммы а, Р- эргокриптининов в сырье спорыньи эргокриптинового штамма ВКМ F-2642D, остаточных количеств суммы а- и р-эргокриптинов в шроте, что является частью методик постадийного контроля производства (ОПР на производство препарата абергиы, акт ПЭЗ НПО ВИЛАР от 18 ноября 1996 г.);
методика контроля содержания 2-бром-а-эргокриптина и 2-бром-р-эргокрнптина мезилатов в субстанции абергана и таблетках абергина на
5 -некоторых стадиях технологического процесса, с применением микроколоночного хроматографа "Милихром" (Акт ПЭЗ НПО ВИЛАР от 18 ноября 1996 г.);
методики количественного определения содержания эргокрнстина и эргокристинина в сырье рожков спорыньи зргокристинового штамма ВКМ F-3401D, остаточных количеств эргокрнстина в шроте, что являегся частью методик постадийного контроля производства (ОПР на производство препарата дигидроэргокристин, акт ПЭЗ НПО ВИЛАР от 18 ноября 1996 г.);
экспресс-методика количественного определения содержания эрго-кристина и эргокристинина в части отдельного склероция спорыньи эрго-кристинового штамма, экспресс-методика количественного определения содержания суммы а- и Р- эргокриптина и суммы а- и р-эргокриптининов в части отдельного склероция спорыньи эргокриптинового штамма. Методики внедрены в отделе биотехнологии НПО "ВИЛАР" для селекционно-генетических и физиолого-биохимических работ со спорыньёй (Акт НПО ВИЛАР 18 ноября 1996 г).
Поданы заявки на получение патента № 94041139 на "Способ получения эргокриепша" с приоритетом от 10 ноября 1994 года, положительное решение о выдаче патента от 30.01.1996 и №95117408 на "Способ получения нейрогормонального средства" (Абергин) с приоритетом от 6 октября 1995 года, положительное решение о выдаче патента от 12.02.1497 (Акт НПО ВИЛАР от 18 ноября 1996 г).
Апробация работы. Отдельные части диссертационной работы представлены на "Первой Всероссийской конференции по ботаническому ресурсоведению"(Санкт-Петербург, 1996).
Связь задач исследования с проблемным планом .фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно - исследовательских работ научно - произвол-
ствснного объединения "Всероссийский научно - исследовательский институт лекарственных и ароматических растений" (НПО "ВИПАР") по проблеме "Создание и организация производства диагностических и профилактических средств по фармакотерапевтическим группам. Препараты на основе эргоалкалоидов, полученных из спорыньи"(номер государственной регистрации 01890043151) и соответствует тематике Межведомственного Совета по фармации № 47 АМН РФ.
Публикации, Результаты работ опубликованы в 2 научных статьях, материалы работы включены в 6 утвержденных нормативных документа, поданы 2 заявки на получение патентов, на обе получено положительное решение о выдаче патента.
Основные положения, выносимые на защиту:
методики качественного и количественного определения алкалоидов зрі отоксиновои группы в рожках спорыньи промышленных штаммов отечественной селекции, эргокриптинового штамма ВКМ F-2642D и эрго-кристинового штамма ВКМ F-3401D, методом ВЭЖХ;
методики качественного и количественного определения алкалоидов эрготоксиновой группы в части отдельного склероция спорыньи отечественной селекции;
номенклатура товароведческих показателей качества рожков спорыньи эргокриптинового и эргокристинового штаммов;
методика контроля соотношения 2-бром-а-эргокриптина и 2-бром-Р-эргокриптина мезилатов в субстанции абергина и таблетках абергина.
Объём и структура диссертации.
Диссертационная работа изложена на 144 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (Глава 1), обсуждения результатов экпериментов (Глава 2), экспериментальной части (Глава 3), выводов, списка литературы и 3-х приложений. В тексте имеется 19 таблиц,
- 7 -19 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 257 источников, из которых 146 на русском языке и 111 на иностранных языках.
Во введении обосновывается актуальность темы, формулируется цель и задачи исследования, отмечены новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены основные положения, выносимые на защиту.
Глава I представляет собой обзор литературы, посвященный описанию биологических особенностей рожков спорыньи, химическом составе, методов анализа эргоалкалоидов, биологической активности эргоалка-лоидов.
В главе 2 обсуждаются результаты разработки номенклатуры показателей качества рожков спорыньи, анализа стандартных образцов, разработки методик количественного определения содержания алкалоидов эр-готоксиновой группы в отечественном лекарственном растительном сырье методом ВЭЖХ с использованием сорбента отечественного производства.
Глава 3 - экспериментальная часть содержит описание используемых материалов, объектов исследования, аппараты и некоторых методик, разработанных в процессе проведения исследовательских работ.
![Стандартизация и контроль качества лекарственных средств группы фторхинолонов методами хроматографии и ИК-спектроскопии [Электронный ресурс]](/i/i/4375/184827.png "Стандартизация и контроль качества лекарственных средств группы фторхинолонов методами хроматографии и ИК-спектроскопии [Электронный ресурс] Коновалов Андрей Александрович")
