Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I Литературный обзор 9
1.1 Радиационная инактивация протеолитических ферментов 9
1.1.1 Сериновые протеиназы 9
1.1.2 Сульфгидрильные протеиназы 22
1.1.3 Другие типы протеиназ 27
1.2 Свойства ангиотензин-превращающего фермента 33
1.3 Структурные и радиационные свойства пероксидаз растений 38
1.4 Применение метода радиационной инактивации 53
ГЛАВА II Материалы и методы 55
ГЛАВА III Экспериментальные результаты и обсуждение 74
3.1 Характерные виды дозовых зависимостей при радиолизе ферментов 74
3.1.1 Протеиназы 74
3.1.2 Ангиотензин-превращающий фермент 84
3.1.3 Пероксидазы растений 9 5
3.2 Зависимость дозового ответа от рН раствора 103
3.2.1 Протеиназы 104
3.2.2 Ангиотензин-превращающий фермент 114
3.2.3 Растительные пероксидазы 124
3.3 Влияние среды на дозовый ответ 130
3.4 Изменение субстратной специфичности под действием облучения 141
3.4.1 Протеиназы 141
3.4.2 Ангиотензин-превращающий фермент 143
3.4.3 Пероксидазы растений 143
3 5 Сравнительное изучение методом радиационной инактивации мутантных форм пероксидазы хрена 157
3.6 Влияние некоторых ионов на конформацию и дозовый ответ ферментов 211
3.6.1 Влияние ионов кальция на протеиназы 211
3.6.2 Влияние ионов кальция и магния на пероксидазы растений 214
3.6.3 Влияние концентрации соли NaCl на дозовый ответ ангиотензин-превращающего фермента 224
3.6.4 Влияние концентрации NaCl на дозовый ответ пероксидазы хрена 232
3.6.5 Влияние ионов цинка на стабильность и дозовый ответ ангиотензин-превращающего фермента 232
3.7 Математическая модель для обоснования появления активации и чередующихся эффектов (осцилляции) на дозовых кривых 238
3.8 Дозовый ответ ферментов при малых дозах облучения на источник типа плазменный фокус 250
3.9 Возможные применения метода радиоэнзимологии в дозиметрической и медицинской диагностике 257
Выводы 268
Приложение 270
Основные положения диссертации, вынесенные на защиту 271
Обозначения 272
Список литературы 273
- Структурные и радиационные свойства пероксидаз растений
- Сравнительное изучение методом радиационной инактивации мутантных форм пероксидазы хрена
- Влияние концентрации соли NaCl на дозовый ответ ангиотензин-превращающего фермента
- Математическая модель для обоснования появления активации и чередующихся эффектов (осцилляции) на дозовых кривых
Введение к работе
Влияние любых видов радиации на неорганические и особенно органические объекты всегда играло огромную роль в жизни человечества. Поэтому медицина со времени открытия радиоактивности тесно связана и с использованием этого воздействия, и с защитой от него.
Ионизирующее излучение занимает особое место в ряду воздействий. Это связано, во-первых, с существованием естественного радиоактивного фона, играющего важную роль в мутационных и эволюционных процессах. Во-вторых, технологическое использование ионизирующего излучения и ядерных реакций привело к возможности высвобождения огромного количества энергии и к загрязнению экосистемы радиоактивными отходами и выбросами. Все это постоянно ведет к повышению коллективной дозы облучения и синергическому действию ионизирующего излучения и других видов радиации совместно с техногенными загрязнителями разных типов, а также с лекарственными препаратами и пищевыми добавками, активно применяемыми сегодня в повседневной жизни. Результат таких совместных воздействий и степень опасности, связанная с модификацией действия излучения этими препаратами, в каждом конкретном случае четко не определены из-за влияния большого числа факторов, а главное из-за неизученного взаимного действия. Таким образом, активно начатые в 50-х годах исследования по действию радиации на биологические объекты до сих пор актуальны, и основное отличие сегодняшнего подхода к этой проблеме заключается в новых методах исследования и развитии концепции комплексного (многофакторного) воздействия и их комплексного изучения. Особое значение такие исследования имеют для фармацевтической химии при разработке новых лекарственных средств, в основном, из-за сочетанного действия радиации и лекарственных средств.
Другой важный аспект использования радиации базируется на том, что радиационное воздействие может служить более быстрым процессом, вызывающим те же изменения, что и другие природные факторы, которые действуют достаточно медленно и поэтому трудно фиксируемы. Это позволяет использовать радиацию для модельных исследований, например, других радикалообразующих процессов. Возможно это и для более сложных процессов. Так, известно [1], что радиационно-индуцируемый рак по механизму возникновения аналогичен химическому и спонтанному. Следует отметить, что в последнее
время в медицине возникает много вопросов о действии малых доз радиации, особенно если эти дозы действуют в течении очень короткого времени (импульсное воздействие), а также по-прежнему актуальны вопросы действия лекарственных препаратов при радиотерапии.
Исследования последствий и профилактики радиационных воздействий и радикалообразующих процессов традиционно развиваются в Японии, Польше, России. Прикладные аспекты этих исследований, в частности, касающиеся скриннинга фармакологических агентов, являющихся различного рода модификаторами, используются в США и Франции. По радиационной тематике издаются многочисленные международные журналы (Rad.Res., J.Rad Res, Int.J.Rad.Biol.), однако встречаются работы на эту тему и в других журналах (например, "Медицинская радиология" и др.), если они связаны с комплексным исследованием проблемы.
Один из важнейших аспектов моделирования радикалообразующих процессов связан с радикальным повреждением ферментов и ферментных систем, физиологическую роль которых трудно переоценить. Особенно важно, что сами ферменты являются лекарственными средствами или мишенями для них.
Метод радиационного воздействия на ферменты не является селективным радикалообразующим методом, но имеет свои особенности, способствующие изучению каталитических и кинетических свойств исследуемых объектов. Фундаментальный аспект данной работы связан с разработкой и применением метода, который можно назвать методом радиоэнзимологии, в частности, для целей фармацевтической химии. Метод является комплексным и включает в себя радиохимические, кинетические, каталитические и генноинженерные исследования и направлен на то, чтобы по совокупному конечному изменению свойств объекта сделать прогностический вывод об его особенностях как структурных, так и энзимологических. Прогностические модели могут использоваться в медицине, биотехнологии и фармхимии.
Метод радиационной инактивации, являющийся базовой частью представленного метода радиоэнзимологии, насчитывает достаточно длительный период использования. Изучение поведения ферментов под действием ионизирующего излучения проводилось давно [2,3], как один из способов его действия на организм человека. Сначала эти исследования считались путем к прямому моделированию повреждения организма, но быстро стал
понятным сложный характер этой взаимосвязи, и интерес к такого рода исследованиям уменьшился. Однако результатом их явилось появление метода радиационного определения молекулярных масс ферментов, который используется и ныне для сложных ферментных систем [4]. Кроме того, поскольку ферменты представляют достаточно сложные объекты, определение структуры которых является чрезвычайно важной задачей, метод радиационной инактивации стал применяться с целью изучения самих ферментов, их структуры и каталитических свойств, в основном, в водных растворах, где рентгеноструктурный метод не работает, а действие самих ферментов наиболее интересно и перспективно. Что же касается непосредственного действия излучения на твердый или иммобилизованный фермент, то метод радиационной инактивации получил прикладное значения благодаря использованию энзимов в бессеребряных фотографических и радиодозиметрических материалах, а также в медицине и фармацевтической химии. Различие в действии ионизирующего излучения на объект, в том числе и на ферменты в зависимости от условий, заключается в вариации радиационно-химического выхода продуктов радиолиза (т.е. их количества на 100 эВ поглощенной энергии). Соответственно изменяется либо качественный состав этих продуктов при косвенном облучении (т.е. при непосредственном первичном контакте излучения с растворителем, когда на вещество действуют продукты радиолиза воды), либо ионной трек (при прямом действии излучения). Отличие от действия других видов радиации определяется уменьшением длины волны (<100 нм) и возрастанием энергии (область ионизации начинается с 5 эВ).
Данная работа проводилась в течение достаточно длительного времени и представляет обобщенное исследование, посвященное: 1 - разработке комплексного метода (радиоэнзимологии); 2 - его применению для изучения структуры и каталитических свойств трех видов ферментов: сериновых протеиназ (на которых отрабатывался метод), растительных пероксидаз и металлосодержащей гидролазы - ангиотензин-превращающего фермента (АПФ), и 3 - применению для целей фармацевтической химии с целью создания и классификации новых лекарственных средств. На основании результатов разработаны общие методологические подходы к использованию данного метода и получены принципиально новые данные по свойствам изученных объектов, являющихся лекарственными средствами или их мишенями.
Базовая концепция работы основана на существовании
набора допустимых конформационных состояний для каждого
фермента, которые существуют в равновесии и могут
реализовываться преимущественно в строго определенных
условиях. Конформационные изменения молекулы и ее активного
центра на первом этапе носят колебательный (обратимый или
равновесный) характер (при малых дозах), что соответственно
может выражаться в дозовом ответе молекулы фермента в виде
эффектов при строго определенных в данных условиях дозах.
Кроме того, мы считаем, что сложные ферментные молекулы
имеют несколько различных степеней защиты, которые также
определяются возможностью изменения конформационного
состояния (опять же из числа изначально определенных его
структурой и классом). Защитные "действия" молекулы могут
протекать без потери каталитической активности (или с
протеканием ее чередующихся изменений) при наличии точечных
модификаций, которые затем ведут к постепенному
разворачиванию с потерей каталитической активности. Т.е.,
другими словами, мы считаем основополагающим, что
конформационные изменения (вызванные точечными
модификациями или волновыми явлениями) могут первоначально являться обратимыми, вызывающими конформационный дисбаланс, как форму сохранения структуры и ферментативной активности и характеризуют адаптацию молекулы в данной среде и условиях. При более высоких дозах они становятся необратимыми, что приводит к изменению доступной поверхности молекулы в целом и, соответственно, ее активного центра, т.е. к необратимой инактивации. При этом набор допустимых конформаций и степеней защиты определяется конкретной функцией фермента. Кроме того, существуют особые точки на дозовой кривой, определяемые дозой в совокупности с мощностью дозы и спектром облучения, которые могут на любой стадии воздействия, т.е. даже при очень малых дозах, приводить к фиксации определенной конформаций, т.е. к необратимым изменениям, сказывающимся и на каталитической активности. Особенно важной является в структуре фермента функция остатков триптофана, для которых, по предложенной нами гипотезе, при радиолизе в водных растворах может происходить поворот ароматического кольца с одновременным изменением функционирования активного центра. Это особенно важно в случае ферментов, содержащих единственный остаток тритофана.
В работе представлена математическая модель, описывающая конкретный дозовый ответ фермента в условиях существования активации. Она же дает описание условий появления так называемых триггерных эффектов.
В качестве прикладного результата совместно с лабораторией органических меченых соединений кафедры радиохимии разработана прогностическая протеазная модель для анализа органических веществ - потенциальных радиомодификаторов, являющихся лекарственными средствами - при синергическом действии совместно с ионизирующим облучением. В модели может использоваться для обсчета метод QSAR и она имеет перспективу для применения в фармахимии и радиоэкологии. Однако наиболее важной ее возможностью является применение в радиотерапии совместно с химиотерапией для анализа эффективности и опасности применения в этих случаях различных лекарственных препаратов совместно с радиацией.
Вторым приложением работы является создание совместно с кафедрой химической энзимологии (лаб. д.х.н. Казанской Н.Ф.) бессеребряных радиодозиметрических материалов, действие которых основано на инактивации протеиназ. На эту работу было получено авторское свидетельство СССР.
Структурные и радиационные свойства пероксидаз растений
Ангиотензин-превращающий фермент - пептидил-дипептидаза (АПФ, КФ 3.4.15.1) представляет собой Zn-содержащую пептидазу и является мембранным гликопротеином. Известно, что этот фермент принимает участие в различных регуляторных физиологических процессах, протекающих в организме, основным из которых является регуляция кровяного давления за счет того, что АПФ - ключевой фермент в ренин-ангиотензин-альдостероновой и калликреиновой системах и гидролизует вазоактивные пептиды ангиотензин I и брадикинин [89]. Показано, что с уровнем активности АПФ связаны гипертензивные состояния, сердечная недостаточность, ренальные патологии, а также есть сведения о роли АПФ в нарушении репродуктивной функции и психосоматических заболеваниях. Очевидно, что процессы инактивации и активации АПФ могут иметь огромное значение для организма, продуцируя развитие серьезных патологий. Все это вызывает огромный интерес к выяснению структурных и функциональных изменений фермента под влиянием физических и химических воздействий.
Молекула АПФ после биосинтеза имеет молекулярную массу 180 кДа и содержит в своем составе два гидрофобных участка: сигнальный пептид, состоящий из 29 аминокислотных остатков и трансмембранный домен, состоящий из 17 аминокислотных остатков [90]. Молекула АПФ человека состоит из 1277 аминокислотных остатков (после отщепления сигнального пептида), содержит 14 цистеиновых остатков и -17 предполагаемых углеводсвязывающих участков [91]. В составе единой полипептидной цепи АПФ содержится два больших домена, которые имеют гомологичность 67.7%, причем в центральной части доменов гомология составляет 89% [92]. Каждый из доменов обладает собственным активным центром и является Zn2+- зависимой металлопептидазой, входя в семейство "Gluzincins" [92,93]. Молекулы АПФ млекопитающих (быка, мыши, кролика и др.) по первичной структуре близки между собой и на 80-90% гомологичны АПФ человека [90].
Таким образом, АПФ представляет собой классический интегральный белок 1 типа и состоит из цитоплазматического участка, трансмембранного якоря, примембранного участка и внеклеточной основной части. Цитоплазматический участок фермента состоит из 30 аминокислотных остатков, трансмембранный якорь содержит 17 гидрофобных аминокислотных остатков и локализован в позиции 1231-1247 в АПФ человека [92]. При протеолитическом расщеплении примембранного участка фермента (около 30 остатков) АПФ переходит в растворимую форму, лишенную как цитоплазматического участка, так и трансмембранного якоря [94]. Как мембранная, так и растворимая форма АПФ в составе системы, моделирующей биологические мембраны, фиксируется в виде мономера, разных типов димеров и тетрамера [95].
Важно, что АПФ является гликопротеином с высоким (9-30%) содержанием углеводов [90], что значительно увеличивает гидрофильность белка. Третичная структура АПФ неизвестна в связи с невозможностью пока получить кристаллическую форму и в ближайшее время сомнительно улучшение в этой сфере. Поэтому все данные по структуре АПФ являются косвенными, и важность радиоэнзимологического подхода к изучению этого фермента трудно переоценить. Уже было проведено радиационное исследование АПФ (быка) [96] с целью определить его молекулярную массу, и именно это исследование впервые показало, что домены структурно взаимосвязаны. Кроме природных субстратов, АПФ гидролизует синтетические пептиды, которые и используются, как правило, в исследованиях, этого фермента. Они отщепляют, как правило, С-концевые дипептиды от олигопептидов, имеющих свободную карбоксильную группу [97]. В некоторых случаях АПФ может гидролизовать и пептиды с блокированным С-концом (хотя значительно медленнее) и отщеплять не только дипептиды, но и трипептиды [98].
Особенностью АПФ является его активация ионами хлора, которые являются аллостерическим активатором АПФ [99]. Связывание ионов хлора вызывает конформационные изменения в молекуле фермента, что приводит к повышению его сродства к ряду субстратов. Оптимальная концентрация ионов хлора находится в области от 0 до 0.3-0.5 моль/л.
Есть данные [100,101], что два активных центра АПФ работают независимо, и активность фермента представляет сумму активностей доменов. Изучение субстратной специфичности доменов АПФ, проведенные в работах [102,103], показывают, что существует функциональные и структурные различия между доменами, т.е. АПФ не является правильным бифункциональным ферментом, и именно это является его важным физиологическим свойством. У обоих доменов имеется сходство окружения активного центра, например, с термолизином [104]. Мутантные формы АПФ, полученные в результате точечной мутации аминокислотных остатков в предполагаемых активных центрах обоих доменов делали фермент полностью неактивным [101].
В организме существуют и активные изоформы АПФ, включающие только один из доменов и содержащие один активный центр. Это, в частности, тестикулярный АПФ, который синтезируется в семенниках млекопитающих [105] и весит 90-110 кДа. В моче человека [106] обнаружена растворимая форма АПФ, соответствующая N-домену. Предполагается, что в АПФ между N-и С- доменами существует участок, доступный для ферментативного расщепления, и N-домен может высвобождаться, например, из мембраносвязанного фермента, оставляя С-домен на мембране [107]. Изучались следующие мутантные формы АПФ: Glu362Asp, Glu960Asp, His361(N 0MeH)Lys, His365(N OMeH)Lys, His959(C OMeH)Lys, His963(C-flOMeH)Lys [101]. Считается, что эти остатки находятся в области предполагаемого активного центра соответствующих доменов. Также считается, что два остатка His участвуют в двух из трех цинк-координирующих лигандах, а остаток Glu является основным донором в каталитической реакции. Есть предположения, что в этом задействованы остатки Glu389 и Glu987 (в N- и С-доменах соматического фермента соответственно) [90]. Структурные различия изоформ определяются методом клонирования.
Исследования показали, что ионы хлора в большей степени влияют на активность С-домена. В отсутствие ионов хлора все мутанты, содержащие интактный С-домен, были практически неактивны. Максимальная активность наблюдалась при достаточно высокой концентрации хлора ( 0.8 моль/л). N-домен способен сохранять активность в отсутствии ионов хлора и максимально активируется при их концентрации (1-1.5) 10"2М. Аминокислотные остатки, отвечающие за роль хлорида в функции АПФ неизвестны. Однако высказываются предположения, что связывание может происходить с остатком Lys в активном центре [90].
Скорость гидролиза субстратов разными доменами различна. Существует специфичный для N-домена природный субстрат: N-AcSer-Asp-Lys-Pro. С-домен гидролизует его в 50 раз медленнее [108]. Соответственно имеются и специфичные ингибиторы активности N- и С-доменов, что обусловлено различием в скорости диссоциации их фермент-ингибиторных комплексов [101,98].
Есть предположение о близком пространственном расположении активных центров доменов, однако оно не подтверждено. Существенным является вопрос об организации работы двух активных центров. Методом клонирования [109] и использования радиоактивно-меченого ингибитора [ПО] было показано, что активный центр С-домена является рабочим, он является высоко-аффинным связывающим центром в соматическом и тестикулярном изоформах. Это вызвало вопрос о функции N-домена [111]. Для ответа на этот вопрос были получены рекомбинантная [101] и мутантные формы АПФ. Рекомбинантная АПФ была по свойствам идентична человеческой почечной АПФ [101]. Мутантные формы, обладающие критическими мутациями в обоих доменах, лишались каталитической активности. Мутанты с интактным N-доменом работали с субстратами, при этом Км не отличалась от рекомбинантного фермента дикого типа, в то время как ккат уменьшалась значительно. Если интактным был С-домен, то при более низком значении Км, величина ккат. увеличивалась. Сумма активностей N- и С- доменов была равна активности рекомбинантной АПФ.
Сравнительное изучение методом радиационной инактивации мутантных форм пероксидазы хрена
Другой остаток гистидина, проксимальный His 170, отвечает за связывание гема в активном центре. Для изучения его роли была получена мутантная форма Н170А. Константа скорости образования Соединени I для него была в 105 раз меньше по сравнению с нативным ферментом [146]. Предполагается, что Hisl70 образует водородную связь с Asp247, что увеличивает его основность и облегчает стабилизацию заряда в окисленных формах ПХ, позволяя поддерживать атом железа с координационным числом 5 [119]. Последнее время интерес вызывает дистальный остаток Arg38, который, хотя и не считается необходимым для образования Соединения I, увеличивает эффективность реакции и усиливает афинность связывания лигандов, включая пероксид водорода [147,148]. Была получена мутантная форма R38L [149], для которой спектрально было показано, что присутствует дополнительный интермедиат, предшествующий образованию Соединения I, причем его спектр не совпадает со спектром Соединения 0, а назначение - нейтральное связывание пероксида водорода с активным центром. Данная мутация вызывала падение на три порядка константы скорости образования комплекса фермент-пероксид водорода и шестикратное уменьшение константы скорости распада этого комплекса с образованием Соединения II. На основании исследования сделан вывод, что остаток аргинина участвует в связывании пероксида водорода и стимулирует перенос протона с Н2О2 к имидазольной группе His42, кроме того, Arg38 перераспределяет электронную плотность между атомами кислорода при гетеролитическом разрыве О-0-связи, способствуя правильной ориентации пероксида водорода в активном центре.
Одним из важнейших вопросов каталитического механизма любого фермента является локализация его субстрат-связывающих центров. Для ПХ были сделаны кристаллические структуры [150] его комплекса с феруловой кислотой и тройного комплекса ПХ-феруловая кислота-цианид. Феруловая кислота является субстратом растительных пероксидаз in vivo. Структуры комплексов демонстрируют подвижность, гибкость и динамический характер центра связывания ароматических субстратов. Особо выделяется при этом роль остатка Arg38, который принимает участие в связывании ароматических субстратов, т.к. замена его на лейцин привела к значительному уменьшению константы связывания ПХ, например, с гваяколом [148]. Была предложена модель пероксидазного окисления, на основании которой на первом этапе остаток Arg38 образует водородную связь с фенольным кислородом восстанавливающего субстрата. Эта связь способствует переносу протона от фенольного кислорода к His42, через молекулу воды, находящуюся в активном центре у атома кислорода Рго139. Как видно, в этой схеме определенная роль отводится молекуле воды, координируемой атомом железа в геме. По данным кристаллических структур только пероксидазы растений содержат такие молекулы воды в структуре.
При замене Phel79 (ПХ) на Ala, His и Ser [151] наблюдалось резкое падение костанты связывания циано-комплекса фермента с бензгидрамовой кислотой в F179A и F179S, в то время как в F179H резких изменений не наблюдалось. Это можно считать первым прямым доказательством участия остатка Phel79 в субстрат связывающем центре ароматических молекул. Специфичность гем-содержащих пероксидаз настолько широка, что вызывает удивление и не находит структурного обоснования. В последние годы стали считать, что субстраты растений можно разбить на две части: 1- те, которые проникают в активный центр молекулы и 2 те, которые окисляются через электрон-транспортные цепи. Наши работы, относящиеся к 1994 г., участвовали в становлении этого мнения. Недавно выполненные работы по лигнинпероксидазе продемонстрировали наличие второго центра связывания на значительном расстоянии от гема. Поскольку гем в этой пероксидазе, в отличие от ПХ более недоступен и канал, ведущий к гему отрицательно заряжен, то был предложен механизм взаимодействия катион-радикального комплекса лигнинпероксидаза-вератровый спирт с дополнительной молекулой вератрового спирта, ключевым моментом которого является стабилизация катион-радикала белковым окружением [152-154]. Особое внимание следует обратить на то, что при изучении кристаллических структур лигнинпероксидазы была замечена значительная электронная плотность у р-атома углерода Тгр 171. Была определена гидроксильная группа. Гидроксилирование этого атома у Тгр171 является автокаталитической реакцией, для которой необходим небольшой избыток пероксида водорода и небольшое число оборотов фермента. Для изучения роли этого остатка были получены мутантные формы W171F и W171S. Обе замены привели к потере каталитической активности по отношению к вератровому спирту (ни Соединение I, ни Соединение II с ним не реагировали), но активность к другим субстратам сохранилась. Таким образом, было предположено существование субстрат-связывающего центра вблизи Тгр171, необходимого для окисления вератрового спирта.
При замене остатка Ser в Mn-пероксидазе, который занимает позицию, аналогичную остатку 171 в лигнинпероксидазе, на Тгр (S168W) удается создать центр связывания вератрового спирта в этой Мп-пероксидазе.
Молекула ПХ содержит два иона кальция [155]. Методом ЯМР было показано, что кальций необходим для стабилизации молекулы в дистальной и проксимальной областях [156,157]. При термическом воздействии ПХ, не содержащая ионов кальция сохраняет лишь 20% первоначальной активности [155], при удалении обоих ионов кальция происходит изменение третичной структуры фермента [158]. Однако для ПХ, в отличие от других типов пероксидаз, нет прямой взаимосвязи между изменением фолдинга и вымыванием кальция. Это связано с удержанием структуры молекулы за счет дисульфидных связей. В пероксидазе арахиса только кальций позволяет удержать высокое значение RZ при хранении, т.к. связывание кальция здесь вызывает переориентацию проксимального и дистального остатков His по отношению к активному центру [159].
Для пероксидазы ячменя и ПХ общим является значение pl=9, наличие четырех дисульфидных мостиков и 42% гомологии аминокислотных остатков. Молекула ПЯ содержит 1 ион натрия и 1 ион кальция." Существенная разница состоит в том, что дистальный остаток His не может принимать участие в реакции между пероксидазой и пероксидом водорода. Поэтому интересен тот факт, что была показана возможность регулировать активность Соединения I ПЯ посредством обратимых конформационных изменений, вызываемых рН и ионами кальция [160], что непосредственно коррелирует с выводами наших работ.
Влияние концентрации соли NaCl на дозовый ответ ангиотензин-превращающего фермента
Очевидно, что все три рассмотренных фактора должны способствовать увеличению радиационной стабильности фермента, создавая автопротекторный механизм в молекуле АПФ. Выяснение конкретных причин и условий появления индукционного периода при радиолизе АПФ требовало, безусловно, дальнейших исследований в области малых доз. Однако уже из вышепредставленных результатов можно было предположить, что чем сложнее природный объект, тем выше степень его защищенности за счет привлечения различных внутренних механизмов. Как уже отмечалось, S-образные дозовые зависимости достаточно часто встречаются при облучении популяций клеток или организмов in vivo [179].
Дальнейший анализ дозового ответа АПФ проводился сравнением значений величин доз Dgo, D50 и D37- Эти величины достаточно полно характеризуют изменения ферментативной активности по любой дозовой кривой. Следует отметить, что они выбраны не случайно, а на основе изучения протеиназ, и можно считать, что они примерно характеризуют определенные механизмы и стадии инактивации. Так, при D Dgo превалирует первоначальная "конформационная" стадия. Когда остается 37% ферментативной активности, можно считать, что идут только стохастические процессы разрушения доступных аминокислотных остатков при практически полном разворачивании, а на стадии разрушения 50% реализуется смешанный механизм.
На рис.25 представлены зависимости величин указанных доз от начальной концентрации ферментов в кислой и щелочной средах. Эти данные иллюстрируют некоторую "пороговость" необратимой инактивации АПФ, так как величины D8o для АПФ (по сравнению с Сбт и Хтр) выше, в то время как величины D37, наоборот, ниже. Таким образом, повышенная устойчивость АПФ на начальной стадии процесса и большой "порог" инактивации (за счет лаг-периода, т.е. за счет увеличения ступеней защиты) компенсируются ослаблением защиты при длительном воздействии радиации, т.е. для сложной молекулы, каковой является АПФ, значительная часть повреждений на начальной стадии является компенсируемой или, точнее, не катастрофической. Конечно, нельзя считать это настоящим порогом, т.к., как мы уже говорили, происходят внутренние изменения, определяющие последующую инактивацию, но есть совокупность процессов, осуществляющих защиту основной функции фермента, а именно связывания субстрата и, таким образом, эффективности катализа. Для протеиназ такого механизма мы не видим, в то время как для АПФ он существенен и заметен.
Поскольку приведенные дозовые кривые относятся к случаю облучения при начальных достаточно высоких дозах облучения, то дальнейшее исследование требовало уменьшения этой величины до доз, малых при облучении in vitro. Поэтому следующим этапом нашего исследования было облучение, начиная с доз 0.2 Гр (и ниже). Оказалось, что в области отмеченного нами как лаг-период дозовый ответ АПФ гораздо более сложный и интересный и включает, в частности, процесс активации, что впервые нами наблюдалось при облучении сложных физиологически важных ферментов. В рамках наших представлений явление активации, как и появление других тонких эффектов, связано со смещением равновесия в наборе допустимых конформаций данного фермента в сторону одной из таковых возможных.
На рис.26 представлены характерные дозовые кривые при двух значениях рН, где хорошо видны тонкие эффекты. Именно при малых дозах формируются, условно говоря, дефекты структуры, определяющие дальнейшую стабильность или, наоборот, радиочувствительность фермента. При этом следует учитывать, что процесс активации, в ряде случаев весьма заметный, может иметь важное физиологическое значение в связи с функциями АПФ в организме. Активация АПФ в зависимости от условий облучения (при фиксированной начальной дозе облучения) наблюдается либо сразу ("первичная"), либо вслед за частичной инактивацией и/или лаг-периодом ("вторичная"), и вид дозовой кривой (в частности, первичность или вторичность активации) безусловно зависит от начальной используемой дозы. Таким образом, возможные превращения молекулы АПФ при взаимодействии ее с продуктами радиолиза воды можно представить в виде простой схемы: претерпевшие взаимодействие с радикалом, но сохранившие ферментативную активность неизменной; Ещсг. - активированные молекулы, увеличившие свою активность в результате взаимодействия с радикалом; Еш. - молекулы, обратимо потерявшие активность в результате взаимодействия с радикалом; Ерщ -необратимо инактивированные молекулы. На основе конкурентных процессов, указанных в пределах этой схемы и формируется дозовая кривая. Соответственно, существует возможность и обратной связи, когда по дозовой кривой можно выделить преобладающие процессы, а также изменение конформации в том или ином направлении. Эта же схема показывает те возможности, которые существуют для изменения конформационного равновесия в ферменте.
Выше на примере АПФ было показано наличие индукционного периода на дозовых кривых инактивации, появление которого достаточно вероятно связано и с защитным эффектом полисахаридных цепей, вклад которых в молярную массу фермента составлял -30%. Однако в АПФ дополнительно существует радиопротекторный механизм остатков Тгр и Туг. Тот факт, что пероксидаза хрена, содержащая очень мало таких остатков, имеет в некоторых случаях индукционный период (хотя и не столь значительный) на дозовой кривой (рис.27), является подтверждением существования вклада в этот автопротекторный эффект углеводных остатков. Это частично подтверждается и тем фактом, что при изучении дозовых зависимостей инактивации дегликозилированной рекомбинантной формы ПХ (РПХ) (рис.28), полученной по методике, описанной в главе "Материалы и методы", при концентрациях фермента 10 6 М в большинстве случаев (субстратов) индукционного периода не наблюдалось. Длительность индукционного периода при радиолизе НПХ (как и в случае АПФ) закономерно увеличивалась с ростом начальной концентрации фермента.
Математическая модель для обоснования появления активации и чередующихся эффектов (осцилляции) на дозовых кривых
Подводя итог раздела, посвященного виду дозовых зависимостей, можно сделать некоторые выводы. Из общего анализа типа дозовых кривых, наблюдаемых для разных ферментов, следует, что дозовую кривую, независимо от ее формы можно разделить на три участка по преобладанию возникающих в молекуле повреждений. На первом этапе, примерно до доз D80, происходят конформационные изменения (открытые, как в Хтр или скрытые, как в АПФ). Это было показано на протеиназах. Особенное значение на этом этапе играют остатки Тгр и Туг. Если число таких остатков велико как в процентном, так и в абсолютном отношении, то часть их будет играть автопротекторную роль, увеличивая радиационную стабильность фермента (как в АПФ). Но в то же время наличие таких остатков повышает чувствительность молекул к внешнему воздействию, вызывая усложнение дозового ответа, и должно быть характерно для сложных биологических систем и отсутствовать или упрощаться в молекулах более простых. Таким образом, при усложнении биологической системы молекулы, играющие ключевую роль такие остатки, повышают степень защищенности, но само усложнение ответа на воздействие приводит к большей чувствительности и следовательно большей повреждаемости при превышении степени защиты.
При действии радиации экспонированность защитных и функциональных ароматических аминокислотных остатков будет меняться в зависимости не только от дозы, но и от условий облучения и может характеризовать их влияние на конформационную подвижность активного центра. Особенно сильно это влияние будет зависеть прежде всего от тех остатков,, которые непосредственно связаны со структурой активного центра. Другим столь же важным фактором, изменяющимся в этой области доз (или влияющим на эту часть кривой дозового ответа) являются углеводные и заряженные аминокислотные остатки, находящиеся в области активного центра, а также наличие иона металла в активном центре и ионов кальция в структуре.
Именно эта первая часть дозовой кривой является наиболее информативной, особенно при расширении ее в область "малых" доз (как малых при облучении ферментов in vitro, так и реально малых доз). Как видно из изложенного выше, для протеиназ в этих условиях наблюдается только инактивация. Для АПФ в области малых доз наблюдаются процессы активации и инактивации, а также при некоторых условиях появляется лаг-период.
Второй участок дозовой кривой характеризуется увеличением вклада стохастического повреждения экспонированных к этому моменту аминокислотных остатков в соответствии с их радиационной чувствительностью, которую приблизительно можно оценить при облучении соответствующих пептидов, хотя и очень приблизительно в силу отсутствия изменений экспонированности. Эту стадию инактивации удобно характеризовать величиной D50 В этой области одновременно с деструкцией продолжает протекать разворачивание молекулы фермента. Совокупную скорость этих процессов можно оценить с помощью величины Gim., определяемой на условно прямолинейном участке сразу после начала необратимой инактивации или, по-другому, сразу после окончания условного лаг-периода (окончание которого характеризуется величиной дозы Dn), включающего в себя все периодические процессы, сменяющие друг друга. В случае "простого" фермента GHH,- "скорость" падения дозовой кривой, определяемая на разных участках этой кривой. На начальном участке (до доз D80) G . характеризует скорость разворачивания молекулы наряду с величиной G(rp), которая, например, в Хтр [161,162], приблизительно равна радиационно-химическому выходу развернутых молекул - Gpa3B.- На втором участке (до D50) изменение значений G И G[-(Trp+Tyr)] могут дать возможность разделить вклады конформационного и стохастического разложения биомолекулы. В целом, увеличение GHH. говорит о большей радиационной чувствительности молекулы на данном этапе. При сравнении ряда ферментов в одних и тех же условиях по этой величине можно судить также о степени развернутости молекулы (т.е. об увеличении доступной поверхности). Зная начальную величину SflOCT.[84,85], GHH и аминокислотную последовательность, а именно положение остатков Тгр и Туг в молекуле фермента, можно приблизительно оценить изменение Здост. в зависимости от дозы и наиболее вероятные участки повреждения молекулы, ожидаемые на этапе стохастических повреждений.
Наконец, третий участок дозовой кривой отражает, в основном, разложение аминокислотных остатков на фоне уже "испорченной" третичной и частично вторичной структур и может характеризоваться величиной D37- Этот участок несет информацию лишь о летальной дозе.
Изменение рН ведет к модификации (протонизации-депротонизации) некоторых аминокислотных остатков, изменению положения активного центра, т.е. к изменению конформационного состояния молекулы фермента, поэтому наблюдается зависимость процесса радиационной инактивации (и соответственно активации) от величины рН. При этом следует учитывать и изменение радиолитических процессов при различных значениях рН. Рассмотрим поведение протеиназ. В литературе обсуждалось, что процесс инактивации Хтр на начальном этапе является процессом разворачивания [53], который в свою очередь зависит от состояния остатков Тгр (см. лит.обзор). Мы проследили за процессом разворачивания Хтр под действием у- и Р-облучения по изменению квантового выхода флюоресценции (ф) остатков Тгр ( Возб=296 нм) в облученном растворе Хтр по отношению к нативному. Результаты этих измерений представлены на рис.31 для 10"5 М раствора Хтр.
При рН 3,0 скорость и тенденция изменения остатков Тгр в Р" и у-облученном растворе примерно одинаковы, т.е. происходит их разложение по мере роста дозы (минимальная доза облучения составляла 25 Гр). Однако совершенно иная картина имеет место в растворах при рН-оптимуме (рН 7.8). При дозах 25-100 Гр наблюдается увеличение пика флуоресцеции, что говорит о появлении новых доступных остатков Тгр, т.е. о происходящем изменении конформации (в данном случае - разворачивании) молекулы Хтр. При р-облучении растворов этот эффект почти не наблюдается, возможно, за счет более быстрого их разложения. Однако все же изменение заметно, так как появляется лаг-период. Интересно, что добавление в систему 10"2 М СаСЬ, усиливает процесс изменения конформации, и это особенно хорошо видно на примере р-излучения. Примерно при дозах 600 Гр кривые выравниваются, т.е. число остатков Тгр достигает одного и того же количества (процесс разворачивания завершается), независимо от рН и вида облучения. Отсутствие различий в инактивации Хтр под действием как Р-, так и у-облучения при высокой концентрации фермента говорит о том, что такие различия появляются только при конкуренции радикалов за молекулы фермента. В принципе, если причиной различий действительно является конкуренция за молекулы фермента, то они должны проявляться и при очень низкой концентрации фермента, т.е. при избытке радикалов (ниже мы столкнемся с таким явлением при облучении АПФ).
