Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 18
1.1. Биологические эффекты эндогенных регуляторов физиологических функций 18
1.2. Рациональные исследования потенцированных средств и биологически активных веществ в сверхмалых дозах 78
1.3. Заключение 91
ГЛАВА II. Материал и методы исследования 94
ГЛАВА III. Результаты собственных исследований 153
3.1. Изучение спектра психотропной активности сверхмалых доз (СМД) антител к белку S-100 (пропротен) 153
3.1.1. Анксиолитическая активность 153
3.1.2. Антидепрессивное действие 162
3.1.3. Влияние на процессы обучения и память 165
3.1.4. Противогипоксическое действие 168
3.1.5. Противоишемическое действие 169
3.1.6. Когнитивные функции, эмоциональный и неврологический статусы в условиях экспериментальной модели болезни Альцгеймера 176
3.2. Изучение спектра фармакологической активности СМД антител к гистамину 184
3.3. Изучение фармакологической активности СМД антител к эритропо-этину(ЭП) 190
3.3.1. Влияние на систему крови в условиях цитостатической миелосу-прессии 190
3.3.2. Влияние на систему крови в условиях иммобилизационного воздействия 200
3.4. Влияние СМД антител к гранулоцитарному колониестимулирующе-му фактору на систему крови в условиях иммобилизационного воздействия 205
3.5. Изучение спектра фармакологической активности СМД антител к NO-синтазе 210
3.5.1. Половая функция 210
3.5.2. Механизмы действия 216
3.6. Изучение иммуномодулирующих и противовирусных эффектов СМД антител к у-интерферону (у -ИФН) 218
3.6.1. Иммуномодулирующее действие 218
3.6.2. Противовирусное действие 233
3.7. Изучение спектра фармакологической активности СМД антител к фактору некроза опухоли-а (ФНО-а) 237
3.7.1. Противовоспалительная активность 237
3.7.2. Противоопухолевая активность 246
3.8. Влияние СМД антител к ФНО-а, ЭП и к у-ИФН на выработку эндогенного у-интерферона 250
ГЛАВА IV. Обсуждение результатов исследований 253
Выводы 294
Список литературы 298
- Рациональные исследования потенцированных средств и биологически активных веществ в сверхмалых дозах
- Когнитивные функции, эмоциональный и неврологический статусы в условиях экспериментальной модели болезни Альцгеймера
- Влияние СМД антител к гранулоцитарному колониестимулирующе-му фактору на систему крови в условиях иммобилизационного воздействия
- Влияние СМД антител к ФНО-а, ЭП и к у-ИФН на выработку эндогенного у-интерферона
Введение к работе
Актуальность. Развитие фармакологии в течение последних десятилетий показывает, что для создания эффективных и безопасных лекарственных средств, наряду с использованием высоких технологий (генотерапия, реком-бинантные технологии и др.) необходим поиск принципиально новых, оригинальных подходов. Одним из таких подходов, активно изучаемых в последние годы, является использование малых и сверхмалых доз [Штарк М.Б., 1978; Бурлакова Е.Б. и др., 1990; Ашмарин И.П. и др., 1992; Зилов В.Г. и др., 2000].
Малые дозы лекарственных средств давно изучались в фармакологии [Кравков Н.П., 1924; Кузин A.M., 1997], однако публикации о влиянии сверхмалых доз (СМД) на клеточном уровне появились не более 15 лет назад [Davenas Е. et al., 1987]. Принципиально, что фармакологической активностью обладают высокоразбавленные растворы лишь тех лекарственных средств, которые подверглись так называемой технологии потенцирования, сочетающей последовательное многократное разведение исходного раствора лекарственного средства с его внешней обработкой (механическое встряхивание по Ганеману, ультразвук, электромагнитное поле). Непотенцированные сверхразбавленные растворы фармакологической активностью не обладают [Davenas Е. et al., 1987; Хариш Г., Дитман И., 1998].
Предполагается, что биологические и физико-химические свойства в потенцированных растворах сохраняются за счет сложных термодинамических процессов, приводящих к специфическим структурным изменениям носителя [Черников Ф.Р., Сорокин В.Н., 1998; Зенин СВ., 1999].
Крайне важно, что эффекты сверхмалых доз (СМД) потенцированного лекаїрственного средства качественно идентичны эффектам этого же средства в терапевтических дозах [Эпштейн О.И. и др., 1999а]. При этом потенцированное лекарственное средство в СМД воспроизводит эффекты исходного
9 вещества в терапевтических дозах, но в редуцированном виде [Бурлакова Е.Б.идр., 1987,1990].
Потенцирование не только сохраняет в сверхразбавленных растворах биологическую активность, но и придает всем потенцированным препаратам особые групповые свойства. Из них в практическом отношении наибольший интерес представляют два впервые выявленных феномена, которые можно объединить единым термином "модифицирующие" феномены сверхмалых доз.
Первый феномен, названный феноменом бипатии, наблюдается при одновременном (сочетанном) введении лекарственного средства в двух формах - обычной и потенцированной. Проявляется он в модуляции биологической активности лекарственного средства на самых различных уровнях: молекулярном, синаптическом, клеточном, системном [Зилов В.Г. и др., 2000; Штарк М.Б. и др., 2000а; 20006; Береговой Н.А. и др., 2001; Воробьева Т.М. и др., 2001].
Второй модифицирующий феномен, открытый на нейробиологических моделях, заключается в том, что потенцированные антитела к эндогенному регулятору (антигену) могут модулировать активность соответствующей молекулы. Однако механизмы действия потенцированных форм антител как на молекулярном, так и на системном уровнях остаются практически неизученными.
Вероятно, главное достоинство сверхмалых доз антител обусловлено их «тропностью». Можно предположить (с большой долей осторожности), что действие потенцированных антител адресовано к такой тонкой регуля-торной системе, какой являются естественные антитела. В последние годы накоплены факты, демонстрирующие «стабилизирующее» воздействие естественных антител на ряд известных регуляторных молекул [Ашмарин И.П., Фрейдлин И.С., 1989; Эпштейн О.И., 1999а; Эпштейн О.И. и др., 2000]. Возможно, модулирующее влияние на активность естественных антител антите-
10 лами в потенцированной форме и определяет их «мягкое», «щадящее», сбалансированное терапевтическое воздействие.
В последнее время представления о естественных антителах претерпели заметную эволюцию. Было показано, что такие антитела участвуют в многофакторной регуляции естественных функций [Ашмарин И.П., Фрейдлин И.С, 1989]; их активность не коррелирует с аутоиммунной патологией. По I.R. Cohen и D.B. Young (1991), репертуар естественных антител отражает молекулярную специфичность каждого зрелого организма. В настоящее время выявлены естественные антитела к целому ряду низко- и высокомолекулярных веществ, к поверхностным мембранным и внутриядерным структурам [Sakata S. et al., 1994; Nishimura S. et al., 1996; Kim J.G. et al., 1997; Elies R. et al., 1998]. Причем значительная часть (до 50%) циркулирующих в кровотоке естественных антител представлена IgG. Известно, что аутоантитела ко многим эндогенным регуляторам пептидной природы участвуют в их транспорте к мембранным рецепторам, предохраняя при этом от преждевременного протеолиза [Copping S., Byfield P.G., 1989]. Комплексное изучение уровня аутоантител к различным эндогенным регуляторам используется в диагностических цзлях [Полетаев А.Б., 1998]. Показана возможность модифицировать эффекты мозгоспецифического белка S-100 антиидиотипически-ми антителами к этому антигену [Полетаев А.Б., Морозов С.Г., 1996]. Исходя из современных взглядов на роль естественных антител, нам представляется, что специфическая модификация сверхмалыми дозами антител функциональной активности тех или иных аутоантител является «регуляцией регулятора».
С учетгм тесной связи метаболических и иммунологических процессов в организме [Ковалев И.Е., Полевая О.Ю., 1985] логично было предположить, что СМД антител могут изменять уровень активности эндогенного регулятора, к которому они были получены.
Использование потенцированных антител в терапевтической практике представляется крайне перспективным направлением по целому ряду причин. Во-первых, использование в качестве лекарственного средства антител к известным антигенам с хорошо изученной активностью в значительной мере облегчает процесс фармакологического скрининга. Во-вторых, исследования показали, что СМД антител даже к наркотическим средствам не вызывают привыкания и пристрастия [Эпштейн О.И. и др., 1997; Эпштейн О.И., 19996; Эпштейн О.И. и др., 1999а]. В-третьих, антитела к эндогенным биологически активным веществам воспроизводят их активность в «позитивном», модифицированном виде, оказывая щадящий эффект, что позволяет осуществлять тонкое и целостное регуляторное воздействие на те или иные патологические состояния.
Таким образом, особые биологические свойства потенцированных антител к различным эндогенным регуляторным молекулам в сверхмалых дозах, обусловленные особой технологий их получения, доступны традиционным рациональным методам исследования, что позволяет использовать их для решения ряда актуальных проблем фармакологии.
Цель исследования. Изучить фармакологическую активность и механизмы действия сверхмалых доз антител к различным эндогенным регуляторам физиологических функций.
Задачи исследования.
Исследовать в эксперименте фармакологическую активность и особенности действия сверхмалых доз антител к эндогенным регуляторам различной природы.
Изучить спектр психотропной активности сверхмалых доз антител к белку S-100 (анксиолитическое, антидепрессивное действие, влияние на когнитивные функции, противогипоксическую, противоишемическую и ней-ропротекторную активность).
Оценить фармакологическую активность и вскрыть механизмы противоаллергического действия сверхмалых доз антител к гистамину.
Выявить наличие гемопоэзмодулирующих свойств у препаратов сверхмалых доз антител к гемопоэтическим ростовым факторам и изучить механизмы их действия.
Изучить влияние сверхмалых доз антител к NO-синтазе на половую активность и вскрыть его механизмы.
Исследовать иммуномодулирующие и противовирусные эффекты сверхмалых доз антител к у-интерферону и механизмы их реализации.
Изучить спектр фармакологической активности сверхмалых доз антител к фактору некроза опухоли-а.
Провести сравнительный анализ фармакологической активности антител к эндогенным регуляторам физиологических функций в малых и сверхмалых концентрациях.
Положения, выносимые на защиту.
Введение в организм СМД потенцированных антител к эндогенным регуляторам физиологических функций (гормоны, цитокины, мембранные белки и др.) при наличии патологического процесса не блокируют активность молекул, к которым они получены, а модулируют их эффекты.
Антитела к эндогенным регуляторам физиологических функций в малых (эквивалентная концентрация 10'6 массовых долей) и сверхмалых (< 10"24 массовых долей) дозах оказывают однонаправленный фармакологический эффект.
Антитела к эндогенным регуляторам физиологических функций в СМД модулируют активность именно тех молекул, к которым они были получены, и воспроизводят их специфические эффекты. Так, СМД антител к белку S-100, к гистамину, к эритропоэтину, к NO-синтазе, к у-интерферону и к фактору некроза опухоли (ФНО)-а воспроизводят in vivo эффекты соответствующих регуляторных молекул.
13 4. СМД антител к мозгоспецифическому белку S-100 обладают ан-ксиолитическим, антидепрессивным, ноотропным, нейропротекторным, противогипоксическим и противоишемическим эффектами, СМД антител к гистамину - противоаллергическим действием, СМД антител к у-интерферону - иммуномодулирующей и противовирусной активностью, СМД антител к эритропоэтину способны стимулировать эритропоэз, СМД антител к NO-синтазе устраняют эректильную дисфункцию, СМД антител к ФНО-а способны оказывать противовоспалительное действие, а препараты на их основе могут применяться для лечения заболеваний, сопровождающихся развитием соответствующих патологических процессов.
Научная новизна. В настоящей работе впервые охарактеризована фармакологическая активность ряда новых лекарственных средств на основе СМД потенцированных антител к эндогенным регуляторам физиологических функций. В то же время расшифрован ряд тонких, специфичных для каждого препарата механизмов действия.
В частности показано, что введение в организм СМД потенцированных антител к эндогенным регуляторам физиологических функций (гормоны, ци-токины, мембранные белки и др.) при наличии патологического процесса не блокирует активность молекул, к которым они получены, а модулирует их эффекты. При этом антитела к эндогенным регуляторам физиологических функций в малых (эквивалентная концентрация 10б массовых долей) и сверхмалых (< 10"24 массовых долей) дозах оказывают однонаправленный фармакологический эффект. Антитела к эндогенным регуляторам физиологических функций в СМД модулируют активность именно тех молекул, к которым они были получены, и воспроизводят их специфические эффекты.
Впервые показано, что пропротен (препарат СМД антител к нейроспе-цифическому белку S-100) обладает широким спектром нейро-психотропных эффектов, выявляемых на различных уровнях. По выраженности анксиоли-тического эффекта пропротен не уступает диазепаму и мексидолу, в его реа- і in. і і і. in. in ІІЧ.ШІІІУІ п. ішли ні її пилі ^ттіпуптттттттттштіяштттшшшшшшшщящщщштшщщшіЩШШШЯШІШШЯШШЯтШШШШШІШ
14 лизации участвует ГАМКергическая система. В отличие от диазепама, сочетающего анксиолитический эффект с седативным, у пропротена выявлен компонент антиастенического, стимулирующего действия. Кроме того, препарат обладает выраженным антидепрессивным эффектом. По активности пропротен не уступает известному эталонному препарату амитриптилину, но в отличие от последнего не вызывает седации и других побочных эффектов.
Проведенные исследования позволили выявить позитивное влияние пропротена на процессы обучения и памяти. Способность пропротена увеличивать при курсовом введении продолжительность жизни животных в условиях гипобарической гипоксии свидетельствует о наличии у него противоги-поксического эффекта. На модели инсульта мозга, вызванного фотохимическим тромбозом префронтальной коры, показано противоишемическое и нейропротекторное действие препарата, что выражается в улучшении инте-гративной деятельности мозга и восстановлении структуры в зоне его поражения.
Впервые показано, что антитела к гистамину в СМД способны ослаблять развитие анафилактической реакции, а также понижать степень дегра-нуляции тучных клеток. В основе антианафилактического действия СМД антител к гистамину лежит их способность уменьшать выработку аллергенспе-цифических антител.
Впервые показана способность у антител к эритропоэтину в СМД стимулировать подавленный цитостатиком костномозговой эритропоэз, увеличивая одновременно содержание эритроцитов и ретикулоцитов в периферической крови экспериментальных животных. Установлено, что в основе активации регенерации эритроидного ростка кроветворения лежит ускорение пролиферации эритроидных клеток-предшественников вследствие повышения уровня эритропоэтина в сыворотке крови. Обнаружена также способность препаратов СМД антител к эритропоэтину и СМД антител к грануло-цитарному колониестимулирующему фактору (Г-КСФ) препятствовать раз-
15 витию гиперплазии эритроидного и гранулоцитарного ростков кроветворения, соответственно, при их введении на фоне иммобилизационного стресса, что в целом свидетельствует о гемопоэзмодулирующих свойствах СМД антител к гемопоэтическим ростовым факторам.
Показано, что СМД антител к NO-синтазе вызывают активацию полового поведения животных, свидетельствующую об улучшении у них копуля-тивной функции, выражающейся в потребности животных в повторных коитусах. В основе действия исследуемого препарата лежит возрастание содержания цГМФ, дериватов оксида азота, увеличение активности NO-синтазы в тканях кавернозных тел.
Впервые продемонстрировано, что СМД антител к у-интерферону обладают способностью стимулировать не только гуморальные, но и клеточные реакции иммунной системы, а также проявляют противовирусные эффекты.
Применение СМД антител к ФНО-а на модели иммунного воспаления, вызванного адъювантом Фрейнда, показало четкий антиэкссудативный и анальгетический эффект исследуемого препарата. Кроме этого, продемонстрирована способность СМД антител к ФНО-а повышать противоопухолевую резистентность организма.
Практическое значение работы. Проведенные исследования позволили впервые продемонстрировать наличие фармакологической активности у целого ряда препаратов СМД антител к эндогенным регуляторам физиологических функций. Полученные результаты послужили основой для создания новых лекарственных средств. В настоящее время разрешены к клиническому применению и производству Министерством здравоохранения Российской Федерации следующие препараты: - «Пропротен» (на основе СМД антител к мозгоспецифическому белку S-100) - транквилизатор с антидепрессивными, ноотропными и антиише-мическими свойствами для лечения алкогольной зависимости; «Прогистам» (на основе СМД антител к гистамину) - для лечения аллергических заболеваний; «Поэтам» (на основе СМД антител к эритропоэтину) - для лечения анемий различного генеза; «Импаза» (на основе СМД антител к NO-синтазе) - для лечения эректильной дисфункции; «Анаферон» (на основе СМД антител к у-интерферону) - для профилактики и лечения вирусных инфекций; «Артрофоон» (на основе СМД антител к ФНО-а) - для лечения воспалительных заболеваний суставов.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на V, VI, VII, IX и X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1998, 1999, 2000, 2002 и 2003 гг.); V Международной конференции «Актуальные вопросы клинической фармакологии» (Москва, 1998 г.); Первом национальном конгрессе неврологов, психиатров и наркологов Украины (Харьков, 1997 г.); Всероссийской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Санкт-Петербург, 1999 г.); Международной научной конференции «Новые лекарственные средства: синтез, технология, фармакология, клиника» (Минск, 2001 г.); I Всероссийском конгрессе по детской аллергологии «Проблемы раннего выявления, профилактики и терапии атопических заболеваний у детей»; I Международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2001 г.); VII Международном конгрессе по иммунореабилитации «Аллергия, иммунология и глобальная сеть: взгляд в новое тысячелетие» (Нью-Йорк, США, 2001 г.); II Российской конференции «Нейроиммунология» (Москва, 2002 г.); Международной научно-практической конференции «Биопсихосоциальная модель как парадигма развития психиатрии на Украине» (Киев, 2002 г.); I Международном симпозиуме «Стресс и экстремальные состояния» (Кара-даг, Феодосия, Украина, 2002 ....ил..». ,,.l .. п., п., и.....пи .щи і і ^шт,т іштщ^ттш.ттт^ттщітщтітітттттттттшттвтщттттттттттттттшшттштт
17 г.); Международной научно-практической конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет» (Санкт-Петербург, 2002 г.); XIV Всемирном конгрессе фармакологов (Сан-Франциско, Калифорния, США 2002 г.); Объединенной конференции Международного общества по цитокинам и интерферонам и Европейского цитокинового общества (Турин, Италия, 2002 г.); Международной научно-практической конференции «Современные проблемы наркологии» (Москва, 2002 г.); Всероссийской научной конференции «Нейрофар-макология в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2002 г.); III Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (Москва, 2002 г.); I Конгрессе педиатров-инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей» (Москва, 2002 г.); VIII съезде Итало-российского общества по инфекционным болезням «Проблемы инфекции в клинической медицине» (Москва, 2002 г.).
Публикации. По теме диссертации получено 9 патентов РФ на изобретения, опубликованы 4 монографии и 54 статьи, из них 19 - в центральных журналах.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 352 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 34 рисунками и 57 таблицами. Библиографический указатель включает 555 источников, из них 171 отечественный и 384 зарубежных.
Рациональные исследования потенцированных средств и биологически активных веществ в сверхмалых дозах
В реализации эффектов AS-100 определенную роль играют ионы Са . Известно, что увеличение концентрации Са в окружающей среде с 10 до 20 мМ уменьшает деполяризацию мембраны, возникающую при аппликации иммунной антисыворотки к антигенам нервной цепочки речного рака (АСР), при 40 мМ Са деполяризация не превышает 2-3 мВ. Наоборот, снижение содержания Са до 5 и 2,5 мМ ведет к более существенному падению мембранного потенциала (МП), чем при развитии непосредственного эффекта АСР [Штарк М.Б., 1985]. Аналогичные изменения претерпевает МП при действии AS-100 и ионов Са2+.Увеличение концентрации Са2+ до 40 мМ препятствует развитию деполяризации, наступающей в результате приложения AS-100, с уменьшением Са а окружающем растворе до 2,5 мМ деполяризация усиливается. Если действие AS-100 в разведении 1:500 в нормальном раство-ре полностью проявляется к 20-й минуте, то при 2,5 мМ Са основной эф-фект AS-100 достигается уже на 5-й минуте. Снижение концентрации Са до 2,5 мМ усиливает эффекты AS-100, а время развития этих эффектов значительно сокращается.
Отмечены также отличия в электрических эффектах моноспецифической антисыворотки от эффектов иных иммунных сывороток. В частности, AS-100 вызывала незначительную деполяризацию мембраны, при этом существенно подавляя генерацию ПД, а также не оказывала влияния на проводимость канала утечки. Эффекты различных типов антисывороток, приводящие к снижению амплитуды ПД на уровне электрических характеристик ионных каналов, были сходными [Штарк М.Б., 1985].
Гистамин - один из первых аминов, открытых в живых организмах. В физиологических концентрациях оказывает регулирующее действие на функции центральной нервной системы, эндокринных органов, желудочно-кишечного тракта, органов дыхания, сердечно-сосудистой и иммунной систем [Head R.J., Dyke К., 1986]. Гистамин участвует в микроциркуляции, сокращении мышц, процессах всасывания и секреции желез кишечника, является гормоном воспаления, играет роль в развитии деструктивных процессов. При выделении в большом количестве из депо гистамин способен вызвать эффекты от легкого раздражения и зуда до анафилактического шока и внезапной смерти. Участие гистамина в механизмах аллергии выражается в том; что он вызывает спазм гладких мышц (например, бронхиол, матки, кишечника) и повышает проницаемость кровеносных капилляров, обусловливая отеки, крапивницу. Кроме того, гистамин повышает гидрофильность волокон соединительной ткани, способствуя связыванию воды в тканях и возникновению обширных отеков типа отека Квинке.
Гистамин - [2- (4-имидазолил) этиламин или р-аминоэтилимидазол] синтезируется в тучных клетках из аминокислоты L-гистидина специфическим цитоплазматическим ферментом гистидиндекарбоксилазой. Реакция активируется пиридоксальфосфатом. Гистамин и серотонин локализуются в одних и тех же цитоплазматических гранулах, где они тесно связаны ионными связями с карбоксильными группами гепарин-белкового комплекса и освобождаются из гранул простым обменом между аминами и внеклеточными катионами, главным образом натрием [Uvnas В., 1969]. Оба амина высвобождаются параллельно, независимо от природы повреждающего или активирующего факторов [Moran N.C. et al., 1962]. Содержание гистамина в гранулах тучных клеток - около 40 мг/мл [Uvnas В., 1964] или 12 мкг на 106 тучных клеток [Lewis R.A. , Austen K.F., 1981]. Количество гистамина в одной тучной клетке составляет 3-5 пг [Ishizaka Т. et al., 1972]. В гранулах тучных клеток человека он составляет около 5-10% массы гранул [Wasserman S.I. , 1983]. Содержание гистамина в соединительнотканных тучных клетках выше, чем в слизистых.
Источником гистамина являются базофилы и тучные клетки. Наибольшие концентрации гистамина обнаруживаются в коже, легких, слизистой носа и желудочно-кишечного тракта. В тканях и базофилах крови гистамин находится в связанном с белком и гепарином состоянии и не может проявлять специфическую активность. При различной патологии (аллергические заболевания, травмы, ожоги, обморожения) гистамин высвобождается из клеток и значительно изменяет функцию ряда органов и систем. Благодаря быстрому высвобождению при дегрануляции тучных клеток, способности изменять просвет микрососудов гистамин и серотонин считаются основными медиаторами первоначальных микроциркуляторных нарушений в очаге острого воспаления и немедленной фазы повышения проницаемости сосудов. Эти исследования послужили основой для развития представлений о гистамине, как об одном из основных медиаторов воспаления [Хорст А., 1982]. Следующим шагом в изучении этой проблемы стало открытие особых антигистамин-ных препаратов, а также медиаторов с гистаминоподобным действием (серотонин, брадикинин, катехоламины и ацетилхолин). Стало возможным с помощью этих веществ избирательно блокировать действие гистамина или любого из перечисленных медиаторов, что позволило уточнить роль каждого из них в процессе воспаления.
Под медиаторами (посредниками) воспаления понимают биологически активные вещества, ответственные за возникновение или поддержание тех или иных воспалительных явлений. Эти же вещества в условиях нормальной жизнедеятельности организма, образуясь в различных органах и тканях в физиологических концентрациях, ответственны за регуляцию функций на клеточном, тканевом уровне. В настоящее время показано значительное возрастание уровня гистамина в экссудате, воспаленной ткани, оттекающей из очага воспаления, и периферической крови при различных по этиологии воспалительных процессах.
Среди эффектов гистамина особое значение имеют спазм гладкой мускулатуры, изменение просвета и повышение проницаемости сосудов, которые, как известно, являются одними из наиболее ранних явлений при воспалении. По данным A.M. Чернуха и соавт. (1975), в механизме гистаминового нарушения проницаемости сосудов наряду с расширением межэндотелиаль-ных щелей имеет значение появление периферически расположенных тран-сэндотелиальных каналов, связанное с истончением эндотелиальных клеток в периферических отделах и микровезикуляцией. Истончение, в свою очередь, может быть обусловлено перерастяжением венулярной стенки, сокращением эндотелиальных клеток и субэндотелиальным отеком [Чернух A.M., Александров П.Н., Алексеев О.В., 1975].
Когнитивные функции, эмоциональный и неврологический статусы в условиях экспериментальной модели болезни Альцгеймера
История ФНО обращается к 1891 г., когда Dr. W.Coley в Memorial Sloan-Kettering Cancer Center в США впервые предпринял попытки лечения больных раком вытяжками из культур стрептококка. В результате у некоторых больных рост опухолей подавлялся, другие же погибали от кахексии, не связанной с онкологическим заболеванием. Именно тогда и возникло предположение о губительном воздействии на опухоль каких-то факторов, появляющихся в ответ на введение бактериальных вытяжек. В 1931 г. A. Gratia и R. Linz продемонстрировали возникновение геморрагических некрозов опухолей в эксперименте на животных после инъекций бактериальных фильтратов. Позже, в 1943 г. М. Shear с соавт. удалось выделить и очистить бактериальный продукт, инъекции которого приводили к геморрагическим некрозам трансплантируемых опухолей у мышей, назвав его «бактериальный полисахарид». G. Algire с соавт. в 1952 г. гистологическими исследованиями обосновали ишемическую природу геморрагических некрозов опухолей и высказали предположение, что введение бактериального эндотоксина вызывает ги-потензию и сосудистый коллапс, заканчивающиеся геморрагическим некрозом. В 1962 г. Ол Malley с соавт. в опытах на мышах доказали, что геморрагические некрозы в опухолях после введения бактериального липополисаха-рида (ЛПС) обусловлены действием не самого ЛПС, а какого-то промежуточного фактора, который появляется в сыворотке крови в ответ на инъекцию ЛПС. Эта сыворотка обладала способностью убивать опухолевые клетки при введении другим мышам, которые не получали инъекций ЛПС. И, нако 73 нец, в 1975 г., опять же в Memorial Sloan-Kettering Cancer Institute, E. Carswell с соавт. открыли и описали медиатор, обладающий цитотоксическим действием на различные опухолевые клетки, появляющийся в крови мышей в ответ на введение ЛПС от Bacillus Calmette-Guerin и назвали его «Tumor necrosis factor» - фактором некроза опухоли. В 1980-1983 г. разными авторами независимо друг от друга было установлено, что ФНО - продукт активированных бактериальными ЛПС макрофагов [Mannel D. et al., 1980]. С этого времени наблюдается рост интереса исследователей к ФНО. В настоящее время уже точно идентифицирована структура ФНО, условия его синтеза макрофагами, активно изучаются эффекты ФНО на различные клетки и ткани и возможность использования этого клеточного медиатора в клинической практике для лечения рака [Beutler В., Cerami А., 1988].
ФНО представлен, на самом деле, двумя клеточными медиаторами: ка-хектином (ФНО-а), продуцируемым макрофагами и полиморфноядерными лейкоцитами, и лимфотоксином (ФНО-Р), продуцируемым лимфоцитами. Лимфотоксин по своей структуре и по происхождению имеет близкое сходство с кахектином. Он вырабатывается Т-лимфоцитами и В-лимфобластами в ответ на специфическую антигенную или неспецифическую митогенную стимуляцию. Этот медиатор, в отличие от кахектина, не вырабатывается макрофагами и не вырабатывается в ответ на появление бактериальных ЛПС. При синтезе лимфотоксин продуцируется в меньших по сравнению с кахектином количествах и медленнее после появления активирующего воздействия [Li С.-В. et al., 1987]. Лимфотоксин был впервые описан в 1967-1968 гг. N. Ruddle и В. Waksman как цитотоксический белок, играющий важную роль в двух типах реакций гиперчувствительности. Последние публикации подтверждают цитотоксические эффекты лимфотоксина в отношении различных видов опухолей, показывают его иммунорегулирующую функцию при аутоиммунных процессах и иммунодефицитных состояниях (в том числе при СПИДе) [Old L., 1985; Ruddle N., 1986]. Сравнительная оценка структуры ка 74 хектина и лимфотоксина приведена в табл. 2 [по Aggarwal В. et al., 1987].
В настоящее время первичная структура кахектина установлена у людей, мышей, кроликов, крупного рогатого скота. Известно, что этот медиатор может существовать в виде димера, тримера, пентамера и, вероятно, мульти-меров большого порядка, но активная форма кахектина представлена тримером с бета-структурой и/или без альфа-спирали [Beutler В., Cerami А., 1988].
Кахектин продуцируется всеми типами макрофагов, которые известны в настоящее время, включая пульмональные, печеночные, перитонеальные и костномозговые. Выявлено, что некоторые другие виды клеток также могут продуцировать кахектин. К ним относятся Т-лимфоциты, которые вырабатывают избыточные количества мРНК кахектина при воздействии искусственных индукторов, но не «отвечают» на естественные, такие как ЛПС или разнообразные митогены [Beutler В., Cerami А., 1988].
Влияние СМД антител к гранулоцитарному колониестимулирующе-му фактору на систему крови в условиях иммобилизационного воздействия
Конфликтная ситуация является классическим тестом, используемым для изучения действия транквилизаторов. Конфликт создается столкновением питьевой и оборонительной мотиваций, когда каждая попытка взятия животным воды наказывается электроболевым раздражением [Vogel J.R. et al., 1971; Sanger D.J. et al., 1991; Triet D., 1985; Молодавкин Г.М., Воронина T.A., 1995; Воронина T.A., Середенин СБ., 2000].
Пропротен в дозе 2,5 мл/кг вводился внутрь однократно за 30 мин до начала эксперимента. Препараты сравнения - бензодиазепиновые транквилизаторы диазепам в дозе 2 мг/кг, медазепам в дозе 10 мг/кг и мексидол в дозе 100 мг/кг вводили внутрь за 30 мин до эксперимента.
С целью установления роли ГАМК-ергической системы в реализации анксиолитического действия пропротена и диазепама исследование проводили в тесте конфликтной ситуации с использованием классических ГАМК-ергических анализаторов. Исследование проведено на высокоактивных крысах. С целью блокады ГАМК-А рецептора использовали его антагонист би-кукуллин (1 мг/кг внутрибрюшинно), а для блокады хлорного канала ГАМК- бензодиазепинового рецепторного комплекса применяли пикротоксин (1 мг/кг внутрибрюшинно).
Анксиолитическое действие пропротена в конфликтной ситуации у животных с различным типом индивидуальной реакции на стресс изучали в два этапа: сначала у крыс определяли тип индивидуальной реактивности и затем оценивали их поведение в конфликтной ситуации. На первом этапе, для выявления типа индивидуальной реакции животных на стресс, осуществлялось разделение крыс на высоко- и низкоактивных в тесте вынужденного плавания в сосуде со свободновращающимися колесами, который используется для оценки астено-депрессивного состояния животных. При помещении крыс в сосуд, в котором находятся свободновращающиеся колеса, животные стараются выбраться из воды с их помощью. Поскольку колеса вращаются свободно, эти попытки остаются безуспешными и у животных развивается депрессивно-подобное состояние. Чем ниже число оборотов, тем более выражено это состояние.
Из 100 беспородных белых крыс-самцов было выявлено 24 высокоактивных животных с числом оборотов колеса 80 и выше, 28 низкоактивных животных с числом оборотов ниже 40 и 48 крыс с активностью от 40 до 80 оборотов - среднеактивные животные.
На втором этапе исследования изучали анксиолитическое действие пропротена у высоко- и низкоактивных крыс в условиях методики конфликтной ситуации.
Исследование проводили на 100 беспородных белых крысах-самцах массой 200-220 г в многоканальной установке конфликтной ситуации, разработанной в НИИ фармакологии РАМН. Установка состоит из трех частей: экспериментальной камеры, электронного блока и счетного устройства. 6 экспериментальных камер размерами 275 х 275 х 450 мм изготовлены из органического стекла и установлены на стандартный электродный пол, выполненный из прутков нержавеющей стали диаметром 4 мм с расстоянием между ними 8-Ю мм. К боковой стене каждой камеры прикреплена поилка-стеклянный сосуд с соском, изготовленным из нержавеющей стали на высоте 5 см от пола. В отличие от многих установок, в используемом приборе поилка установлена в общем объеме камеры, а не в затемненном отсе. Это сделано по той причине, что животные, находясь в новой обстановке, в силу инстинкта стараются спрятаться в темном отсе и могут находить поилку не в результате целенаправленного поиска для удовлетворения питьевой мотивации, а случайно. Электродный пол и сосок поилки присоединены к электронному блоку, который содержит стабилизаторы тока, формирователи выходных сигналов для счетного устройства и формирователи задержки подачи нака-зующего тока на поилки в день эксперимента. Блок обеспечивает регистрацию ненаказуемых взятий воды во время выработки навыка взятий воды (тренировки, без подачи тока на поилки), а также подает наказующий ток и сигналы наказуемых взятий воды во время эксперимента. Счетное устройство обеспечивает регистрацию ненаказуемых взятий воды во время тренировки и наказуемых взятий воды во время эксперимента.
Опыт проводили в течение 3 дней. В первый день животных полностью лишали питья. На следующий день, т.е. после 24-чой депривации, проводили выработку навыка взятия воды из поилки. Д; я этого животных на 5 мин помещали в экспериментальные камеры. Животные обследовали камеру, через некоторое время находили поилку и начинали пить. В этот день взятия воды были ненаказуемыми и их число характеризовало выраженность питьевой мотивации. На третий день животных снова на 10 мин помещали в экспериментальные камеры, но на этот раз через 10 с после первого взятия воды на соски поилок и электродный пол камер подавали постоянный ток силой 0,2 мА. Поэтому каждое взятие воды становилось наказуемым, и для удовлетворения жажды крысам надо было преодолеть страх, развившийся в результате наказания. Регистрировали число наказуемых взятий воды за 10 мин. Мерой выраженности анксиолитического эффекта считали достоверное увеличение числа наказуемых взятий воды из поилок животными, получившими исследуемый препарат.
Методика [Pellow S., File S.E., 1986; Dawson G.R., Tricklebank M.D., 1995; File S.E., 1995; Воронина T.A., Середенин СБ., 2000] основана на страхе открытого пространства и падения с высоты. Он широко используется для оценки анксиолитического действия анксиоселективных, особенно дневных транквилизаторов. В методике не используются такие мощные стрессоры, как болевое раздражение электрическим током, длительная депривация сна и другие, поэтому она считается более адекватной для оценки менее мощных, но более избирательных анксиолитиков.
Исследование проводили на 30 беспородных белых крысах-самцах массой 200-220 г. Установка поднятого крестообразного лабиринта представляет собой 4 рукава длиной 0,5 м и шириной 10 см, скрепленных друг с другом под прямым углом. Два противоположных рукава имеют с трех сторон стенки высотой 40 см на всю их длину, в то время как два других открыты. Лабиринт поднят над уровнем пола на высоту 0,5 м. Вся поверхность лабиринта освещалась равномерно с помощью люминесцентных ламп (2 шт. по 20 Вт на высоте 60 см над уровнем рукавов). Животных помещали на центральную площадку лабиринта и в течение 3 мин визуально регистрировали их поведение: латентный период первого выхода в открытые рукава лабиринта, число полных и неполных выходов и длительность пребывания в них. Эмоциональность крыс во время пребывания в лабиринте оценивали по числу мочеиспусканий и болюсов дефекаций.
Влияние СМД антител к ФНО-а, ЭП и к у-ИФН на выработку эндогенного у-интерферона
Исследование пролиферативной активности предшественников эритропоэза производили с помощью метода "клеточного самоубийства" путем поглощения гидроксимочевины в культуре ткани. Клетки костного мозга выделяли из бедренной кости мыши 0,5 мл препаративной среды (95% RPMI-1640, 5% ЭТС), ресуспендировали и отмывали два раза путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10-20 мин. После последнего центрифугирования конечную концентрацию жизнеспособных миелокариоцитов доводили до 2x106 кл/мл, добавляли водный раствор гидроксимочевины ("Sigma", США) до конечной концентрации 2 мг/мл и инкубировали при 37С. Через 2 ч клеточную массу вновь отмывали два раза препаративной средой. Для определения содержания КОЕ-Э в цельной фракции костного мозга доводили концентрацию жизнеспособных нуклеаров до 2x105 клеток в 1 мл полувязкой культуральной среды, как описано выше. По 0,5 мл приготовленной смеси инкубировали в 24-луночных пластиковых планшетах в СОг-инкубаторе при 37С, 5% С02 и 100% влажности воздуха. В контрольной группе преинкуба-цию клеток осуществляли в среде, не содержащей гидроксимочевину. Величину пула гемопоэтических прекурсоров, находящихся в S-фазе клеточного цикла, определяли в абсолютных единицах по следующей формуле: N = [(а-Ь)/2]х105 культивируемых клеток, где а - среднее для группы количество прекурсоров, выросших из клеток, не обработанных гидроксимочевиной; b -количество прекурсоров, выросших из клеток, обработанных гидроксимочевиной [Гольдберг Е.Д. и др., 1992].
Изучение структурно-функциональной организации костного мозга Структурно-функциональную организацию костного мозга исследовали путем ферментативного выделения гемопоэтических островков (ГО) и последующей оценки их количественного и качественного составов. Костный мозг вымывали из бедренной кости мыши 0,5 мл среды RPMI-1640, содержащей 0,05% коллагеназы ("Sigma", США) и инкубировали в течение 30 мин при 37С. Далее готовили взвесь гемопоэтических островков путем пипети-рования инкубационной среды с костным мозгом при помощи шприца через иглу диаметром 2 мм. Полученную взвесь в количестве 0,05 мл смешивали с равным объемом 0,1% раствора нейтрального красного в физиологическом растворе, после чего подсчитывали в камере Горяева количество гемопоэтических островков - клеточных ассоциаций, содержащих не менее трех мие-локариоцитов, связанных с центрально расположенным макрофагом либо стромальным элементом. Подсчет производили под микроскопом "Polivar" ("Reichert-Jung", Австрия) при увеличении - ок.1 Ох, об.40х. Общее число островков в бедре определяли по формуле: X=(NxVix2)/V2=2N/0,9xl03, где N - подсчитанное в камере число островков; Vj - объем жидкости для вымывания костного мозга из бедра (500 мкл); V2 - объем камеры Горяева (0,9 мкл); 2 - коэффициент разбавления. Качественный анализ гемопоэтических островков осуществляли на цитологических препаратах, для чего 0,05 мл взвеси островков переносили на обезжиренные предметные стекла и помещали во влажную камеру на 15 мин при 37С, после чего центрифугировали (3-5 мин при 1,5-2 тыс об/мин и 4С), фиксировали в метаноле (3-5 мин) и окрашивали азурИ-эозином в течение 30-40 мин. Подсчет производили под иммерсией (ок.12х, об.ЮОх). В каждом препарате анализировали 100 островков и рассчитывали абсолютное содержание клеточных ассоциаций каждого типа [Crocker P.R., Gordon S., 1985; Гольдберг Е.Д. и др., 1992].
Способ получения кондиционной среды клеток костного мозга [Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. Взвесь клеток костного мозга опытных и контрольных мышей (5 х 106 клеток/мл) разделяли на адгезирующую и неадгезирующую фракции вышеуказанным способом. Для получения супернатантов прилипающих нуклеаров среда с неадгезирующими элементами удалялась, а прилипающие клетки инкубировались в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640 ("Serva", ФРГ), 10% ЭТС ("Sigma", США), предварительно инактивированной теплом (56С, 30 мин), 2 мМ L-глютамина ("Sigma", США), 10 мМ HEPES ("Flow", Великобритания), 40 мг/л гентамицина ("Serva", ФРГ), 25 мкМ 2-меркаптоэтанола ("Sigma", США). В случае изучения активности неприлипающих клеток удалялась ад-гезирующая фракция, концентрация неадгезирующих нуклеаров доводилась до 2 млн клеток/мл, после чего полученную взвесь инкубировали 24 ч в вышеуказанных условиях. По окончании инкубации в обоих случаях собирали кондиционные среды и хранили не более месяца при -20 С. Определение эритропоэтической активности кондиционной среды клеток костного мозга и периферической крови
Эритропоэтическую активность (ЭПА) тестировали микрометодом в 96-луночных планшетах ("Costar", США). В каждую лунку сначала вносили в объеме 0,05 мл супернатант от адгезирующих, неадгезирующих клеток костного мозга либо сыворотку периферической крови экспериментальных животных, затем добавляли 0,15 мл взвеси неадгезирующих миелокариоцитов (в концентрации 2x105 кл/мл) интактных мышей линии CBA/CaLac в культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640 ("Sigma", США), 9% инактивированной ЭТС ("Bioclot", ФРГ), 50 мг/л гентамицина ("SERVA", ФРГ), 280 мг/л L-глутамина ("Sigma", США) и 1% метилцеллюлозы ("Sigma", США). Полученную культуру инкубировали в течение 3 сут в С02-инкубаторе ("Jouan", Франция) при 37С, 5% СОг и 100% влажности аоздуха. ЭПА выражали количеством эритроидных колоний, выросших из 105 миелокариоцитов [Гольдберг Е.Д. и др., 1992].
