Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 9
1.1 Антибактериальные средства - общее понятие 9
1.2. Нежелательные реакции (HP) антибиотиков 11
1.2.1. Аллергические реакции 12
1.2.2. Токсические реакции 15
1.3. Общее понятие нейротоксичности 20
1.3.1. Нейротоксические признаки антибиотика - терапии 22
1.4. Новая группа антибактериальных препаратов - пептаибол 22
1.4.1. Формирование подсемейств (SFs) по структурным последовательностям 23
1.4.2. Структура и формирование каналов SF 28
1.4.3. Функциональные особенности пептаиболовых подсемейств... 31
1.4.4 Структурно - функциональные особенности зервамицина 33
1.4.5. Нейротропные свойства зервамицинов 41
Выводы по обзору литературы 43
ГЛАВА II.Объекты и методы исследований 44
2.1. Выделение и очистка пептаиболов группы зервамицинов из гриба Emericellopsis salmosynnemata (штамм 336, IMI 58330) 44
2.2. Объекты исследования 45
2.3. Методы исследования 47
2.3.1. Методика оценки нейротоксичности в модифицированном тесте Ирвина 47
2.3.2. Определение двигательной активности мышей 47
2.3.3. Методика определения температуры тела у мышей 48
2.3.4. Методика оценки болевой чувствительности в тесте «Горячая пластина» 48
2.3.5. Количественное определение пептаибола Зервамицин в органах и тканях лабораторных животных
2.4. Протоколы исследования 52
2.5. Статистическая обработка результатов 56
ГЛАВА III. Результаты и обсуждение 57
3.1. Определение ЛД5о при внутрибрюшинном введений мышам 54 CD-I
3.2. Влияние пептаибола зервамицин на параметры функциональной батареи тестов по оценке нейротоксичности в модифицированном тесте Ирвина 55
3.3. Влияние зервамицина на двигательную активность мышей CD-1 69
3.4. Влияние пептаибола зервамицин на анальгетическую активность мышей CD-1 в тесте «Горячая пластина» 78
3.5. Влияние пептаибола зервамицин на гипотермическую реакцию мышей CD-1 в тесте «Ректальная температура» 86
3.5. Биораспределение зервамицинов по органам и тканям экспериметальных животных. 93
Общие выводы 96
Список литературы 98
- Нежелательные реакции (HP) антибиотиков
- Структурно - функциональные особенности зервамицина
- Методика оценки нейротоксичности в модифицированном тесте Ирвина
- Влияние пептаибола зервамицин на параметры функциональной батареи тестов по оценке нейротоксичности в модифицированном тесте Ирвина
Введение к работе
Актуальность проблемы
Антибиотики являются уникальной группой лекарственных средств, которые наряду с вакцинацией, больше, чем какие-либо другие, повлияли на продолжительность жизни человека. (Страчунский и др., 2007). Развитие резистентности микроорганизмов к антибиотикам требует постоянного пополнения их арсенала (Сидоренко и др., 2002). Таким образом, поиск новых антибиотиков является важной задачей современной фармакологии.
В 1973 Argoudelis и Johnson получили патент на новые антибиотики, выделенные из гриба Emericellopsis salmosynnemata, которые были названы зервамицинами. Зервамицины относятся к пептаиболам - пептидам, содержащим в своей структуре а,а-диалкиламинокислоты, например, а— аминоизомасляную кислоту, и С-концевые аминоспирты. Изучение биологических свойств зервамицинов показало, что они обладают не только выраженной активностью против грамположительных и грамотрицательных бактерий (Argoudelis et al., 1974; Jen et al., 1987), но и проявляют антипротозойное действие по отношению к устойчивым формам возбудителя малярии Plasmodium falciparum (Nagaraj et al., 2001). Это позволяет рассматривать их как потенциальные антибиотические лекарственные средствам. Однако из культур различных штаммов гриба Emericellopsis salmosynnemata было выделено до 11 изоформ зервамицинов, среди которых преобладающими являлись зервамицин ПА (Zrv-IIA) и зервамицин ПВ (Zrv-ПВ) (Argoudelis et al., 1974). Получение чистых изоформ зервамицинов является сложной методической задачей. В настоящее время такие работы проводятся под руководством Т.В.Овчинниковой в Институте биоорганической химии РАН.
Известно, что побочным действием антибиотиков является их влияние на центральную нервную систему (Сергеев и Шимановский, 1987). Было показано, что антибиотик-пептаибол ампуллоспорин из гриба Sepedonium ampullosporum снижает двигательную активность у экспериментальных животных (Ritzau et el., 1997). Влияние на поведение животных было обнаружено также и у зервамицина (Ovchinnikova et al., 2007; Овчинникова и Мурашев, 2007), однако, результаты данных работ не позволяют однозначно интерпретировать их воздействие на нервную систему. В связи с этим, нами было сделано предположение, что изменения в поведении животных под влиянием зервамицина могут быть связаны с их нейротоксическим действием. Таким образом, важность проведения комплексных исследований по изучению нейротоксических свойств зервамицина не вызывает сомнений. Zrv-IIA и Zrv-IIB по своей структуре отличаются друг от друга только одним аминокислотным остатком в четвертом положении, поэтому исследования их нейротоксических свойств позволят расширить наши знания по фундаментальной проблеме - изучению зависимости токсичности фармакологических веществ от их структуры.
Цель и задачи работы
Целью данной работы явилось проведение сравнительного анализа нейротоксического действия двух изоформ зервамицина (Zrv-IIA и Zrv-IIB) выделенных из гриба Emericellopsis salmosynnemata.
Для решения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1) определить ЛД5о и максимальную толерантную дозу для Zrv-IIA и Zrv-IIB при однократном внутрибрюшинном введений мышам CD-1;
2) провести сравнительную оценку нейротоксического действия Zrv-IIA и Zrv-IIB на мышах CD-I, используя тест Ирвина;
3) оценить влияние зервамицинов на двигательную активность с помощью установки «OPTO-VARIMEX» у мышей CD-I;
4) изучить влияние Zrv-IIA и Zrv-IIB на болевую чувствительность в тесте «Горячая пластина» у мышей CD-1;
5) оценить влияние Zrv-IIA и Zrv-IIB на температуру тела у мышей CD-I;
6) исследовать возможность прохождения зервамицина через гематоэнцефалический барьер.
Научная новизна
Показано, что побочное действие зервамицинов на ЦНС носят обратимый характер. Выявлено, что, несмотря на большую гомологию в структурах, различающихся лишь одним аминокислотным остатком, Zrv-IIB в высоких дозах проявляет более выраженные нейротоксические эффекты, чем Zrv-IIA. Максимальная толерантная доза для зервамицина составляет 4 мг/кг, а ЛД5о - 5,5 мг/кг. Впервые установлено, что зервамицины в дозе 0,01 мг/кг оказывают влияние на двигательную активность у мышей CD-I, которое было выявлено с помощью установки «OPTO-VARIMEX», тогда как нейротоксическое действие, обнаруженное в тесте Ирвина, они проявляли в дозе 2 мг/кг. Показана зависимость между структурой и активностью: при использовании дозы 0,01 мг/кг Zrv-IIB на 20-ой минуте после введения снижал двигательную активность, a Zrv-IIA - нет, напротив на 60-ой минуте Zrv-IIA увеличивал двигательную активность, Zrv-IIB - нет. Обнаружено, что зервамицины в дозе 2 мг/кг и выше уменьшают болевую чувствительность и вызывают снижение температуры тела. Впервые установлено, что зервамицин может проникать через гематоэнцефалический барьер и накапливаться в головном мозге мышей.
Научно-практическое значение
Результаты, изложенные в настоящей диссертационной работе, углубляют и дополняют представления о неиротоксических свойствах зервамицинов, а также пептаиболов в целом. Полученные данные о том, что зервамицины проявляют выраженные нейротоксические эффекты, указывают на необходимость проведения дальнейших доклинических испытаний.
Результаты диссертационного исследования используются в научно-исследовательской работе лаборатории биологических испытаний Филиала учреждения института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Учебно-научного центра учреждения института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН и кафедры физиологии человека и животных биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.
Положения, выносимые на защиту
1. Максимальная толерантная доза как для Zrv-IIA так и Zrv-IIB составляет 4 мг/кг, ЛД5о - 5,5 мг/кг, и 5,4 соответственно.
2. Зервамицин ИВ проявляет более выраженное нейротоксическое действие, чем зервамицин ПА, несмотря на высокую степень гомологии в их структурах, различающихся лишь одним аминокислотным остатком в четвертом положении.
3. Зервамицины оказывают влияние на двигательную активность мышей CD-I при однократном внутрибрюшинном введении в дозе 0,01 мг/кг. Между Zrv-IIA и Zrv-IIB было обнаружено характерное различие в их действий на двигательную активность.
4. Побочные эффекты зервамицинов носят обратимый характер и сопровождаются уменьшением болевой чувствительности и снижением температуры тела.
5. Зервамицин может проникать через гематоэнцефалический барьер и накапливаться в головном мозге.
6. К зервамицину как потенциальному антибиотику следует относиться с большой осторожностью в силу того, что у него обнаружено выраженное нейротоксическое действие.
Апробация работы
Основные результаты работы были доложены, обсуждены и опубликованы в материалах следующих симпозиумов и конференций: VII, VIII и XI международные Пущинские школы молодых ученных (2003, 2004, г. Пущино); VII чтения памяти академика Ю.А.Овчинникова (2003, г. Пущино); XI международная конференция «Ломоносов-2004» (2004, г. Москва); III российский симпозиум «Белки и пептиды» (2007, г. Пущино); конференция «Фармакология практическому здравоохранению» (2007, г. Санкт-Петербург), «Биомедицинская инженерия - 2007» школа-конференция молодых ученных (2007, Пущино), "Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции" (2008. Пятигорск), Всероссийский конгресс студентов и аспирантов - биологов «Симбиоз Россия — 2008» (2008.Казань)
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, из них 2 статьи в рецензируемых журналах.
Нежелательные реакции (HP) антибиотиков
Под аллергией понимают измененную реакцию организма на действие чужеродных веществ, возникающую после предшествующего контакта с ним или вследствие высокой наследственной чувствительности организма. Аллергические реакции не связаны с фармакологическими свойствами лекарств (Hemandezrujillo et al., 2004). Клинические проявления аллергических реакций могут реализоваться немедленно (это наиболее опасные реакции) или быть замедленного типа. Эти патогенетические механизмы придают аллергическим реакциям особую, иногда очень яркую окраску и определяют сложный комплекс клинических проявлений (Roujeau, 2006). Однако чаще эти HP возникают при повторных введениях определенных веществ, сенсибилизирующих организм, даже при введении ничтожно малых количеств (сотых и тысячных долей грамма). Из всех видов аллергических реакций для жизни наиболее опасен анафилактический шок, который развивается очень быстро: смертельные реакции этого типа протекают в течение нескольких секунд или минут после введения препарата. Аллергические реакции на антибиотики могут быть различными - начиная от легкого зуда кожи до анафилактического шока, представляющего угрозу жизни. При проявлении каких-либо признаков аллергии при приеме антибактериальных препаратов следует немедленно прекратить их прием (Сох et al., 1988). Прямые токсические реакции наблюдают чаще аллергических, хотя при их диагностике также возникают определенные затруднения (Amsden et al., 2000).
Эти реакции обусловлены фармакологическим действием антимикробного агента на органы и ткани макроорганизма; они не связаны с противобактериальным эффектом препарата и имеют прямую зависимость от количества введенного вещества (Голиков и др., 1986.). Токсические реакции характерны для каждой отдельной группы антибактериальных средств (пенициллинов, аминогликозидов, полимиксинов, нитрофуранов и т. д.). Их выявляют, как правило, только при передозировке препаратов, то есть когда лекарственные средства применяют максимальных дозах в течение продолжительного периода времени, или при значительном завышении разовой дозы антибактериального препарата (Bartlett., 2000). Обычно токсические реакции подразделяют на группы в связи с селективным тропизмом каждого препарата с определенными тканями организма (нейротоксические, гепатотоксические, нефротоксические реакции и т.п.). Однако это деление также в значительной мере условно, так как ни одно лекарственное вещество не действует строго специфично в отношении одной или двух определенных систем организма, а затрагивает в той или иной степени функции всех систем и органов (Demoly et al., 1998). Для практического пользования более приемлемо описание токсических реакций для каждой группы антибактериальных препаратов. Такое подразделение характеризует действие препарата на организм в целом и позволяет заранее учитывать возможность возникновения целого комплекса определенных симптомов при применении конкретных препаратов (Kampf, 1996, de Rosa et al., 2004). Пенициллины и цефалоспорины относятся к малотоксичным веществам и при любом способе клинического применения не вызывают побочных реакций (Kelkar and Li, 2001). В условиях эксперимента при введении доз, значительно превышающих максимальные терапевтические, установлено нейро- и нефротоксическое действие препаратов этой группы, но эти явления носили обратимый характер и проходили после отмены препаратов (Lauer and Walker, 2001., Kanazawa et al., 2003). Тетрациклины - относительно нетоксичные вещества, однако при длительном применении оказывают неиротоксическую активность: основное их побочное действие - это сильное местнораздражающее влияние на ткани при парентеральном (внутримышечном, подкожном) введении; большинство лекарственных форм тетрациклинов на органической (полимерной) основе лишены этого недостатка. При пероральном применении тетрациклины в редких случаях могут вызывать осложнения со стороны желудочно-кишечного тракта: потерю аппетита, рвоту, диарею; но такие реакции возникают при использовании максимальных доз антибиотиков и обычно исчезают вскоре после отмены препарата или окончании курса лечения (Quintiliani et al., 1999). Гепатотоксическое действие тетрациклинов (вид жировой дистрофия печени) установлено только в экспериментальных условиях при длительном введении лабораторным животным антибиотиков в дозах, значительно превышающих терапевтические, причем эти явления носят, как правило, обратимый характер (Scholar and Pratt, 2000., Schwartz et al., 1976). Аминогликозиды обладают как нейротоксическим действием, так и нефротоксическим (Ackerman et al., 2006). Побочное влияние аминогликозидов можно свести к минимуму, если избегать по возможности их внутривенного введения, а при необходимости инъекции в вену следует вводить медленно, назначать точные терапевтические дозы и не затягивать курс лечения, а также не применять антибиотики этой группы в комбинациях с другими лекарственными веществами, оказывающими нейро- и нефротоксическое действие (Murakami et al., 1999). Полимиксины могут оказывать нефро- и нейротоксическое, а также (при парентеральном применении) местнораздражающее действие. (Danner et al., 1989). Нитрофураны.
Токсическое действие нитрофуранов выявляют только при завышении лечебной дозы свыше 5 мг на 1 кг массы, а также при длительном (более 7-1 Одн.) введении терапевтических доз (D Arcy, 1985). При этом развиваются полиневриты, нарушается обмен веществ, поражаются почки и печень, наблюдаются диспепсические явления. Снижается естественная иммунологическая реактивность организма, но формирование искусственного иммунитета и активность ретикулярной системы не нарушаются (Neal et al., 1988). Низкая молекулярная масса нитрофуранов способствует их проникновению через стенки кровеносных сосудов, лимфатических капилляров, плацентарный барьер, поэтому они могут оказывать отрицательное действие на плод, уменьшать количество и активность спермиев в эякуляте (Воусе et al., 1995) Таким образом, большинство антибактериальных средств, на сегодняшний день, проявляют не только, избирательно угнетающее жизнедеятельность микроорганизмов действие, но и оказывают токсическую активность на весь организм в целом. Нейротоксичность - это свойство химических веществ, действуя на организм немеханическим путем, вызывать нарушение структуры и/или функций нервной системы. В основе развивающегося токсического процесса может лежать повреждение любого структурного элемента нервной системы путем модификации пластического, энергетического обменов, нарушения генерации, проведения нервного импульса по возбудимым мембранам, передачи сигнала в синапсах. Нейротоксичность может быть проявлением
Структурно - функциональные особенности зервамицина
Это обстоятельство и объясняет многоуровневую проводимость зервамициновых каналов. Наиболее выгодная конформация мономера зервамицина формируется для каждого иона, проходящего через канал. Причем в молекуле изменяется положение только трёх групп: боковой группы Gin", гидроксильных групп Hyp10 и С - концевого Phel. При расположений мономеров в наиболее выгодных конформациях (при их количестве от 4 до 8) были построены энергетические профили движения в канале ионов Na+, К+, CL" и воды, а также просчитаны расстояния от движущейся частицы до мономера в местах с минимальной потенциальной энергией. Наименьший диаметр отверстия в канале, сформированном открыт) Зервамицины относятся к семейству пептаиболов, выделенных из гриба Emericellopsis salmosynnemata, они состоят из 15-ти аминокислотных остатков. Первичные структуры Zrv-IIA и Zrv-IIB практически идентичны за исключением аминокислотного остатка в четвертом положении, Zrv-IIA содержит а-аминоизомасляную кислоту, a Zrv-IIB - D-изовалин. Зервамицины действуют против прокариотических клеток. В связи с формированием ионных каналов, которые резко увеличить проницаемость клеток мембраны. Зервамицины в своей структуре содержат большое количество Aib, и содержат по крайней мере по одному Pro или Hyp (Karle et all., 1994) 1.4.5 Heiipo і рои иыс свойства зернами ни нов.
В процессе структурно — функционального исследования антибиотиков - пептаиболов была выявлена нейротропная активность Zrv-IIA и Zrv-IIB (Овчинникова и Мурашев 2007). Ранее аналогичные биологические свойства были обнаружены у пептаибола ампулоспорина (Amp), выделенного из гриба Sepedonium ampullosporinum HKI - 0053. Было показано, что ампулоспорин вызывает дозозависимое снижение двигательной активности и гипотермию при интерпеританиальном введении раствора антибиотика (Eddy and Leimbach 1953). Исследование пептаибола хризосперминта показало сопоставимую нейролептическую активность с ампулоспорином. Однако хризосперминт не проявляет антимикробную активность в диапазоне, в котором ампулоспорин. В дозировке 1-100 мг/кг обнаружено снижение температуры тела, что указывает на способность проникать хризосперминта в ЦНС. Первые признаки снижения температуры были обнаружены на 30 минуте после введения ампулоспорина, и продолжали наблюдаться 4 дня, в дозировке 40 мг/кг. Также было обнаружено и снижение двигательной активности животных (Neuhof et al. 2007). При внутрибрюшинном введении Zrv-IIA и Zrv-IIB самцам крыс Wistar в тесте «Открытое поле» было обнаружено снижение двигательной и исследовательской активности (Овчинникова и Мурашев 2007). При исследовании нейротропной активности на самцах мышей CD-I в тестах «Норковая камера», «Приподнятый крестообразный лабиринт» и «Принудительное плавание» были выявлены различия в эффективности этих пептаиболов (Ovchinnikova et all. 2007). Зервамицины при внутрибрюшинном введении у крыс Wistar в тесте «Открытое поле» вызывали снижение двигательной и исследовательской активности (Овчинникова и Мурашев 2007). Они также проявляли нейротропную активность у мышей CD-I в тестах «Норковая камера», «Приподнятый крестообразный лабиринт» и «Принудительное плавание» (Ovchinnikova et all. 2007).
В работе, посвященной исследованию нейротропных свойств ампуллоспорина, высказано предположение, что он может вызывать изменения состава нейротрансмиттерного рецептора, кальциевого сигнального каскада и системы вторичных мессенджеров и приводить тем самым к пластической реорганизации ткани мозга, изменению синапсов и метаболических путей, проникая через гематоэнцефалический барьер и накапливаясь в структурах головного мозга экспериментальных животных Krugel et all. 2006). Структурное сходство ампуллоспорина и зервамицинов позволяет предположить, что влияние последних на поведение экспериментальных животных может быть связано с аналогичным механизмом их нейротропного действия (Овчинникова и, Мурашев 2007). Таким образом, имеющиеся в литературе данные предполагают значительную важность изучения нейротропной активности пептаиболов зервамицинов, не только в виду их способности проявлять нежелательные реакций, но изучению их способности проникать через гематоэнцефалический барьер и оказывать действие на ЦНС. Поэтому полученные в ходе исследования данные о двигательной, анальгетической и термической активности, а также фармакокинетическая активность будут являться существенным вкладом в изучение нового семейства антибактериальных средств - пептаиболов и их представителей Зервамицина НА и Зервамицина ИВ.
Методика оценки нейротоксичности в модифицированном тесте Ирвина
Изучение фармакокинетики меченых тритием пептидов эксперименты in vivo проводили на самцах мышей CD-I массой 28-31 г. Раствор анализируемого меченого пептида упаривали досуха и растворяли в физиологическом растворе. Животным внутрибрюшинно вводили смесь «холодного» и меченого антибиотика - пептаибола Зервамицин в суммарной дозе 2 мг/кг, при этом мышь получла 10 мкСі. Крыс умерщвляли методом декапитации, исследуемые ткани извлекали в течение 1-1,5 мин и замораживали в жидком азоте. Фракция, содержащие меченые пептиды, выделяли с помощью экстракции органическими растворителями при дроблении в клеточном измельчителе. Для этого 1-2 г замороженной ткани помещали в клеточный измельчитель, добавляли 20 мл 90% ацетонитрила, содержащего 1% трифторуксусной кислоты и измельчали в течение 10 минут. Смесь центрифугировали при 4С 15 минут при 12000 g. Отбирали супернатант и высушивали его в роторном испарители. Сухой остаток растворяли в 1 мл метанола. Центрифугирования при тех же условиях супернатант снова высушивали в роторном испарители, сухой остаток растворяли в 100 мкл 0,1% TFA и замораживали. Хранили при -20С. Анализ биодеградации пептидов с использование ВЭЖХ Методика определения содержания меченого пептида и его метаболита основана на определении радиоактивности хроматографических пиков соответствующих немеченых фрагментов, предварительно введенных в исследуемый образец перед разделением и выделенных по данным УФ — детекции (масса меченого пептида и его [ Н] метаболитов, подвергнутых хроматографическому разделению по данной методике, слишком мала для их непосредственного наблюдения с помощью УФ - детекции). Разделение смеси пептидных фрагментов проводили методом ВЭЖХ на колонке -47-Kromasil СІ8 - 5 jum (4 150 мм) при 20С. В качестве детектора использовали спектрофатометр Beckman модели 165 (Altex) при одновременной детекции на длинах волн 254 и 280 нм.
Полученные образцы пептидных экстрактов из тканей (объем 40мкл) смешивали с 30 мкл раствора исследуемого не меченого зервамицина и его метаболитами (по 5 мкг каждого пептида), подвергали градиентному элюированию и определяли радиоактивность каждого из пиков. Полученные результаты рассчитывали в н/г ткани. Экстракты упаривали досуха на вакуумном роторном испарителе, сухие остатки перерастворяли в 2 мл метанола. Фракции, содержащие зервамицины, подвергались дальнейшей очистке с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) на обращеннофазовой колонке SGX RPS (Separon, Чехия, 5 мкм, 4x250 мм) в течение 30 мин при скорости потока элюента 2 мл/мин в линейном градиенте растворов А и Б, содержащих метанол, ацетонитрил и воду в следующих пропорциях: раствор А - 60% метанола, 5% ацетонитрила и 35% воды; раствор Б - 80% метанола, 15% ацетонитрила и 5% воды; затем в течение 8 мин колонку при той же скорости потока элюента промывали раствором Б. Детекция зервамицинов осуществлялась при длине волн 206 и 280 нм. Зервамицин ПА элюировался с колонки на 30-ой мин, зервамицин ИВ - на 32-ой. Опыты был выполнены на мышах CD-I, зервамицин вводили однократном внутрибрюшинном. Срок последующего наблюдения составил 3 суток, в течение которых учитывали характер и длительность симптомов интоксикации, сроки гибели и количество павших животных от каждой введенной дозы. Количественные параметры токсичности с уточнением характеристик потенциальной опасности смертельного отравления рассчитывали пробит-анализом по методу Литчфилда и Уилкоксона.
Опыты были выполнены на бодрствующих мышах-самцах CD - 1, массой 27-32 г. Для скрининга нейротоксической активности пептаибола Zrv-IIA и Zrv ПВ животных разделили на 2 контрольные, интактные и 30% этанол, и 6 экспериментальных групп. Zrv-IIA и Zrv-IIB, вводили в дозировках 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг и 4 мг/кг. Введение осуществляли внутрибрюшинно предварительно растворив в 30% этаноле, группе животных достаточной для статистической обработки результатов. Оценку параметров производили по бальной системе. Регистрацию параметров осуществляли на 20, 60, и 120 минутах после введения Зервамицина. При осмотре все показатели регистрировали без применения специального оборудования и приборов. После инъекции Зервамицина каждое животное помещали в индивидуальную клетку и регистрировали в течение 120 минут показатели физиологического состояния, а также их продолжительность и степень тяжести, ранжируя по бальной шкале (от слабого до тяжелого проявления) с применением модифицированного теста Ирвина .Так как клинические признаки, отмечаемые во время периода введения животным вещества, могут быть связаны не только с действием вещества, но и с общим состоянием животного, тщательно отмечали и документировали все отклонения от нормы, наблюдаемые как у животных, которым вводится вещество, так и у контрольных животных. Изучение двигательной активности мышей после введения пептаибола Зервалшиин. Опыты выполнены на бодрствующих мышах - самцах CD — 1 , массой 27-32 г. Животные содержались в стандартных условиях (22±2С, 12-часовая
Влияние пептаибола зервамицин на параметры функциональной батареи тестов по оценке нейротоксичности в модифицированном тесте Ирвина
За контроль движения отвечает согласованная деятельность разных отделов нервной системы, таких как спиной мозг, ствол/мозжечок, базальные ганглии и кортекс. Со стороны соматической нервной системы в регуляцию локомоторной активности включены кости, суставы, мышцы. Предварительный тест, показал дозазависимое снижение двигательной активности, однако проявление эффектов может быть как нейротропным действие, так и нейротоксическим проявлением исследуемых пептаиболов зервамицина. Для оценки нейротоксического действия зервамицинов был применен тест Ирвина. В тесте Ирвина была использована максимальная толерантная доза, а также более низкие дозы, 0.5 мг/кг, 2 мг/кг и 4 мг/кг, при которых наблюдались наиболее выраженные эффекты зервамицинов. Тестирование осуществлялось в клетке, на открытой площадке и в руках. Осмотр в клетке показал, что Интактные животные, 30% этанол и Zrv-IIA 2 мг/кг не отличаются на 20 и 60 минуте эксперимента друг от друга по параметру: апатия (Рис 11), пассивность (Рис. 12). Однако Zrv-IIB в дозе 2 мг/кг достоверно отличался от животных получавших 30% этанол по обоим параметрам на 20 и 60 минуте эксперимента. Zrv-IIB 2 мг/кг не проявлял отличий между 20 и 60 минутой эксперимента, однако достоверно отличие наблюдалось между 20 и 120 минутой, а также между 60 и 120 минутой эксперимента. Увеличение дозировки Zrv-IIB до 4 мг/кг способствовало достоверному отличию между 20 минутой и 120 минутой, а также между 60 и 120 минутой эксперимента. Введение пептаибола зервамицин способствует проявлению признака апатия в тесте Ирвина. Статистическая обработка полученных результатов показала, что в дозе 2. мг/кг нами обнаружено отличие между Zrv-IIA и Zrv-IIB на 20 минуте эксперимента.
Однако в дозе 4 мг/кг отличий между изоформоми обнаружено не было (Рис. 11). На 20 минуте эксперимента обнаружено достоверное отличие между Zrv-IIA 2 мг/кг и Zrv-IIA 4 мг/кг. Достоверных отличий между Zrv-IIB в дозировках 2 и 4 мг/кг нами обнаружено не было. Zrv-IIA 2 мг/кг на 20 и 60 минуте эксперимента не отличался от 30% этанола. Однако Zrv-IIB 2 мг/кг, Zrv-IIA 4 мг/кг, Zrv-IIB 4 мг/кг отличались достоверно от 30% этанола на 20 и 60 минуте. Все обнаруженные изменения были обратимыми и возвращались к норме к 120 минуте после введения препарата. Результаты осмотра животных в клетке показали, что введение пептаибола Зервамицин способствует проявлению признака сгорбленость (Рис 12) у экспериментальных и контрольных животных. Обнаружено достоверное отличие у Zrv-IIA 4 мг/кг и Zrv-IIB 4 мг/кг между 20 и 120 минутой эксперимента, а также 60 и 120 минутой. В дозе 2 мг/кг не обнаружено отличий между изоформами зервамицина. В дозе 4 мг/кг достоверное отличие обнаружено только на 60 минуте между изоформами. Однако данный параметр явно проявлял доза эффект исследуемого пептаибола. Наблюдалось достоверное отличие между Zrv-IIA 2 мг/кг и Zrv-IIA 4 мг/кг на 20 и 60 минуте, а также между Zrv-IIB 2 мг/кг и Zrv-IIB 4 мг/кг. В дозе 4 мг/кг зервамицины достоверно отличаются от 30% этанола. Обнаруженные изменения были обратимыми и возвращались к норме через 120 минут. На Рис 13 представлены результаты при осмотре животных в клетке, показатель покусывание частей тела. Результаты исследования показали, что Zrv-IIA 4 мг/кг и Zrv-IIB 4 мг/кг достоверно отличаются между 20 и 120 минутой, а также 60 и 120 минутой эксперимента.
Не было обнаружено достоверных отличий и между изоформами зервамицина в одинаковых дозировках. Однако на 20 и 60 минуте эксперимента наблюдали достоверное доза зависимое различие между 2 мг/кг и 4 мг/кг пептаибола Zrv. Этот показатель возможно можно рассматривать как анальгетический эффект исследуемого пептаибола. Примечание: А - Зервамицин ПА; В - Зервамицин ПВ. 1 - Интактные, 2 - 30% этанол, 3 Зервамицин 0.5 мг/кг, 4 - Зервамицин 2 мг/кг, 5 - Зервамицин 4 мг/кг. - Р 0,05 относительно группы «30% этанол». # - Р 0,05 относительно группы «Интактные».
