Содержание к диссертации
Введение
1 Литературная часть 8
1.1 Тритерпеноиды коры березы и их свойства. 8
1.1.1 Бетулин 11
1.1.2 Производные бетулина и их свойства 14
1.2 Фармакологическая активность бетулина и его производных 18
1.3 Способы улучшения растворимости бетулина и его производных 20
1.4 Механохимическая активация твердых веществ 25
1.4.1 Механическая активация и ее влияние на физико-химические свойства твердых веществ. 26
1.4.2 Влияние механических воздействий на физико-химические свойства лекарственных веществ . 28
1.4.2.1 Микронизация лекарственных веществ при механической обработке. 30
1.4.2.2 Аморфизация лекарственных веществ при механической обработке. 32
1.4.2.3 Получение твердых дисперсных систем лекарственных веществ
со вспомогательными веществами при механической обработке. 35
1.4.2.4 Механизмы увеличения скорости растворения и растворимости
лекарственных веществ при растворении твердых дисперсных систем. 37
1.4.3 Вспомогательные вещества в механохимии 39
1.4.3.1 Полиэтил енгликоль 40
1.4.3.2 Поливинилпирролидон 41
1.4.3.3 Арабиногалактан 44
1.4.3.4 Аэросил 47
1.5 Краткие выводы по литературному обзору 48
2. Экспериментальная часть 50
2.1 Реактивы и приборы 50
2.2 Получение механокомпозитов 51
2.3 Физико-химические исследования композитов 52
2.4 Фармакологические исследования композитов 54
2.4.1 Методика определения противоязвенной активности веществ
2.4.2 Методика определения противоопухолевой активности композитов на клетках асцитной аденокарциноми Эрлиха 56
2.4.3 Методика определения противоопухолевой активности композитов на раковых клетках легкого 57
3 Результаты и обсуждение 59
3.1 Физико-химические свойства механокомпозитов бетулина с поливинилпирролидоном и полиэтиленгликолем 59
3.2 Физико-химические свойства механокомпозитов диацетата бетулина с аэросилом. 65
3.3 Физико-химические свойства механокомпозитов диацетата бетулина с арабиногалактаном 68
3.4 Исследование растворимости композитов диацетата бетулина с полимерами в воде 75
3.5 Физико-химические свойства механокомпозитов дипропионтата бетулина с аэросилом и арабиногалактаном 76
4 Фармакологические исследования композитов 84
4.1 Токсикологическое исследование веществ 84
4.2 Исследование противоязвенной активности веществ 84
4.3 Исследование противоопухолевой активности бетулина и механоактивированных композитов
4.4 Изучение противоопухолевой активности композитов диацетата и дипропионата бетулина с арабиногалактаном 87
4.4.1 Противоопухолевая активность на клетках асцитной аденокарциномы Эрлиха 87
4.4.2 Противоопухолевая активность на клетках аденокарциномы легкого человека (А549) 89
Выводы 92
Список литературы 93
- Влияние механических воздействий на физико-химические свойства лекарственных веществ
- Физико-химические исследования композитов
- Физико-химические свойства механокомпозитов диацетата бетулина с арабиногалактаном
- Противоопухолевая активность на клетках асцитной аденокарциномы Эрлиха
Влияние механических воздействий на физико-химические свойства лекарственных веществ
В обзоре [137] подчеркивается, что различные операции приготовления лекарственных форм могут влиять на физико-химические свойства фармацевтических субстанций. Эти эффекты имеют особое значение при масштабировании механохимических процессов. Лекарственное вещество или лекарственная форма, претерпевшие какое-либо фазовое превращение при механической обработке, могут проявить измененную растворимость или скорость растворения, что может отрицательно сказаться на биодоступности. В обзоре рассмотрены наиболее распространенные механические операции, которые могут привести к изменению свойств лекарственных веществ, - измельчение и прессование (таблетирование). При измельчении частиц в жестких условиях, благодаря подведенной энергии, возможна аморфизация веществ или протекание полиморфных превращений. Образование «высокоэнергетических» аморфных материалов нежелательно в фармации, т.к. они термодинамически нестабильны и могут спонтанно переходить в кристаллические гидратные или негидратные формы, что сказывается на растворении и биодоступности. В случае измельчения гидратных форм возможна их дегидратация.
В работах [138-140], посвященных современным достижениям в области механохимического синтеза, особое внимание уделено синтезу в органических и металлоорганических системах. Рассматриваются наиболее распространенные модели взаимодействия твердых веществ при механической обработке - модель горячих точек и модель «магма-плазма», связанные с локальным разогревом твердого тела при механической обработке. Авторы [139] делают вывод, что вряд ли эти модели реализуются в случае органических и металлоорганических систем, поскольку наблюдалось бы разложение органических веществ при механической обработке. Тот факт, что разложение не наблюдается, позволяет предположить, что явления разогрева могут быть слишком краткими и/или локализованными, чтобы создать реакционные места для реакций. Авторы [139] отмечают следующие преимущества механохимического синтеза по сравнению с традиционными методами: большая эффективность по времени, материалам и использованию энергии, достижение повышенной реакционной способности реагентов, получение новых продуктов. Отмечены также недостатки механохимических методов, связанные с необходимостью очистки продуктов синтеза, трудностями масштабирования механохимического эксперимента, большими затратами энергии, низкой возможностью предсказания результатов и трудностями изучения механизма процессов, особенно, in situ.
Влияние механической активации на физико-химические свойства низкомолекулярных органических веществ изучено для целого ряда лекарственных препаратов, относящихся к разным классам химических соединений и обладающих разным фармакологическим действием.
Далее рассмотрены конкретные примеры физико-химических последствий механической обработки лекарственных веществ.
Микронизация лекарственных веществ при механической обработке. Важной чертой механической активации является то, что процесс активации не начинается, пока размер частиц не достигнет определённого значения, ниже которого измельчение не будет происходить. При достижении определённого размера частиц прекращается образование трещин и новой поверхности, и наступает пластическое течение материала [129]. Для каждого материала существует предельная степень измельчения, которая зависит от многих факторов: типа оборудования, интенсивности и продолжительности механической обработки, структуры и агрегатного состояния вещества, температуры, наличия влаги и других посторонних веществ и т.п. Характеристикой дисперсности материала служит удельная поверхность (SyA.) - отношение общей поверхности измельчённых частиц к единице объёма (или массы), обратно пропорциональная среднему диаметру частиц. Благодаря увеличению поверхности при измельчении может повышаться скорость растворения лекарственного вещества. Однако важность измельчения не исчерпывается повышением скорости растворения. Растворимость также зависит от размеров кристалла, согласно уравнению Оствальда- Фрейндлиха [141]: где р и М - плотность и молекулярный вес, соответственно, R -универсальная газовая постоянная, Т - абсолютная температура, Sr и Sro -растворимости сферического кристалла радиуса г и бесконечного радиуса (т.е. плоскости) и ysl - поверхностное натяжение жидкость - твердое. Механическая активация приводит к увеличению количества дефектов и образованию кристаллитов внутри кристалла. В уравнении г относится к радиусу кристаллитов. Хотя данное уравнение подвергалось в литературе критике, экспериментальные результаты показывают, что растворимость действительно увеличивается для достаточно маленьких кристаллитов (обычно, г 20 нм). Например, растворимость гризеофульвина в воде увеличивается с 11,9 мкг/см (макрокристалл) до 60,2 мкг/см (нанокристалл) [142], ацетата метилгидроксипрогестерона - с 1,2 мкг/см (макрокристалл) до 3,5 мкг/см (нанокристалл) [143], нимесульфида - с 11 мкг/см (макрокристалл) до 25 мкг/см (нанокристалл) [144]. Таким образом, хотя и трудно экспериментально проверить надежность уравнения в количественном аспекте, оно, по крайней мере, выполняется качественно. 1.4.2.2 Аморфизация лекарственных веществ при механической обработке.
Вследствие пластической деформации кристаллов при механической обработке, в них происходит образование точечных дефектов и дислокаций, уменьшаются размеры кристаллитов. Накопление дефектов приводит к постепенному разупорядочению структуры вплоть до полного уничтожения дальнего порядка в кристалле, т.е. его аморфизации.
Аморфные тела обычно имеют ближний порядок (на расстоянии порядка нескольких размеров молекул) и отличаются по физическим свойствам от кристаллических. На рис. 5[145] схематически изображены энтальпия (или удельный объем) твердого вещества как функция температуры.
Физико-химические исследования композитов
Композиты бетулина, диацетата и дипропионата бетулина и полимеров получали методом механической активации смеси. В качестве наполнителей использовали: поливинилпирролидон (Мг = 12 600 и 360 000) (Sigma-Aldrich) и полиэтиленгликоль (ПЭГ) (Mr = 4 000) (Sigma-Aldrich), аэросил торговой марки «Полисорб МП» а также арабиногалактан (АГ).
Механическую активацию (МА) исходных компонентов и смесей ДПБ с наполнителями проводили в ударно-шаровой мельнице SPEX-8000 (США) с массой шаров 60 г и диаметром шаров 0,6 см при продолжительности активации 5, 15 и 30 мин. Объём стальных барабанов 60 мл, отношение массы навески к массе шаров 1:30, нагрузка на шар 10g. Соотношение компонентов «активное вещество-наполнитель» составляло 1:3 и 1:9 (по массе). Продолжительность активации варьировалась от 5 до 30 минут. Для сравнения с механоактивированными образцами были приготовлены физические смеси простым перемешиванием исходных компонентов.
Рентгенофазовый анализ (РФА) проводили на дифрактометре D8 DISCOVER с двухкоординатным детектором GADDS (Bruker), CuKa -излучение.
ИК-спектры регистрировали методом нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) в диапазоне частот 4000-600 см"1 на Фурье ИК-спектрометре Digilab Excalibur 3100 (Varian) без прессования образцов.
Термоаналитические измерения проводились с использованием DSC-204 (Netzsch). Стандартные алюминиевые тигли были не запечатаны, только закрыты крышкой. Скорость нагрева составляла 6 К мин"1, газовый поток - 20 мл мин"1 (аргон). Масса образца составляла от 5,0 до 5,9 мг для различных веществ и смесей после механической активации. Также были исследованы образцы чистых необработанных диацетата и дипропионата бетулина. Потерю массы измеряли с использованием термовесов TG-209 (Netzsch) в открытых алюминиевых тиглях (диаметр 8 мм, высота 4 мм, масса 120 мг) при скорости нагрева 6 К/мин. (Измерения проводились для подтверждения широких эндо- и экзотермических эффектов от обезвоживания или разложения образца)
Растворение образцов проводили в течение 24 ч при Т = 37±1 С с использованием тестера растворимости 705 DS (Varian Inc, Netherlands). 200 мг смеси помещали в 250 мл воды. Отобранные пробы центрифугировали в течение 15 мин при 8000 об/мин и отфильтровывали с помощью мембранного фильтра (Millipore, d=0.2 мкм). Фильтрат объёмом -60 мл выпаривали и растворяли в этиловом спирте. Концентрацию ДПБ в
полученном спиртовом растворе определяли на жидкостном хроматографе Милихром А-02 (Эконова, Россия), колонка ProntoSil С18, подвижная фаза -вода-ацетонитрил. В качестве стандарта использовали спиртовые растворы бетулина и его диацилов. Полученные значения пересчитывали на первоначальный объём фильтрата.
Молекулярно-массовое распределение образцов определяли методом гель-проникающей хроматографии на хроматографе Agilent 1200 с рефрактометрическим детектором 1260 Infinity (30 С, PL aquagel-OH 40 300 7.5 мм, 0,1 М L1NO3, 1 мл/мин,). Калибровка колонки осуществлялась с помощью стандартных образцов декстранов (Sigma-Aldrich) с молекулярными массами 10600, 20000, 41272, 70000. Хроматограммы нормированы на максимум поглощения рефрактометрического детектора.
Исследования пленок ДАБ-АГ методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) проводились на сканирующем зондовом мультимодовом микроскопе Solver Р47 (НТ-МДТ, Москва), укомплектованным 14 мкм сканером (сканирование образцом). Исследования проводились при комнатной температуре на воздухе. В качестве зондов в полуконтактной моде АСМ применялись поставляемые производителем микроскопа кремниевые кантилеверы с константой жесткости около 6 Н/м. Сканирование производилось не менее чем в 3-4 точках на нескольких параллельно обработанных образцах. Скорость сканирования составляла 1-2 Гц, число точек на сканируемой площадке было 256 на 256 либо 512 на 512. Сглаживания или иной обработки изображений не проводилось. 2.4 Фармакологические исследования композитов 2.4.1 Методика определения противоязвенной активности веществ Исследование противоязвенного действия бетулина и его композитов проводили в экспериментах in vivo согласно требованиям Фармакологического комитета МЗ и СР РФ.
Работа выполнялась на 30 самцах белых беспородных крыс массой 300 г. Содержание животных, после карантина в 14 дней, осуществлялось в соответствии с правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). В период экспериментов крысы находились при температуре воздуха +20 - 22 С, влажности не более 50%, в световом режиме день-ночь в стандартных пластиковых клетках. Перед экспериментом животные подвергались 18-часовой пищевой депривации.
Экспериментальная модель язвообразования осуществлялась путем введения через металлический зонд в желудок 4.5 мл 0,1 н НС1. Животных методом случайной выборки распределяли на 5 групп по 6 животных в каждой группе (Таблица 2).
Физико-химические свойства механокомпозитов диацетата бетулина с арабиногалактаном
Исчезновение рефлексов ДАБ на рентгенограммах механоактивированных смесей подтверждает распределение тонко диспергированного вещества в матрице носителя с образованием механокомпозита. Согласно данным рентгенофазового анализа смесей ДАБ с АГ можно утверждать, что механоактивированные композиции ДАБ с АГ, являются рентгеноаморфными.
Учитывая линейные размеры молекулы ДАБ и сопоставляя молекулярную массу ДАБ с молекулярной массой комплекса, можно предположить, что ДАБ может взаимодействовать с несколькими макромолекулами АГ.
Можно было ожидать, что механохимическая активация будет способствовать комплексообразованию между ДАБ и АГ. Однако содержание ДАБ в плёнке, полученной выпариванием водного раствора механически активированной смеси, практически не отличалось от содержания ДАБ в пленках, полученных в случае физических смесей аналогичного состава. Следовательно, как в случае механоактивированных, так и в случае физических смесей, можно получить ДАБ в виде комплекса с АГ путем растворения смесей в воде и испарения растворителя [204-205].
Исследование растворимости композитов диацетата бетулина с полимерами в воде Растворимость чистого диацетата бетулина в воде очень низка. Поэтому было проведено исследование поведения композитов диацетата бетулина с водорастворимыми полимерами в воде.
Была сделана сравнительная оценка поведения диацетата бетулина, физической смеси и активированных в течение 15 минут смесей диацетата бетулина с аэросилом в этаноле. Полученные результаты практически не показали различия между содержанием диацетата бетулина в растворах активированных смесей, физической смеси диацетата бетулина с аэросилом, а также чистого диацетата бетулина.
Исследование растворимости композитов в воде проводили согласно методике 2.3 при температуре 37,5 С в течение 48 часов. В таблице 5 представлены результаты определения содержания диацетата бетулина в растворе при растворении композитов и физических смесей в воде по данным ВЭЖХ.
Полученные данные показали, что после механической активации диацетата бетулина с аэросилом содержание ДАБ в растворе снижается с 1,2 до 0,8 мг/л по сравнению с физической смесью компонентов. Возможно, это связано с укрупнением частиц аэросила при механической активации, что препятствует выделению ДАБ в раствор. При этом после МА ДАБ с АГ наблюдается увеличение содержание ДАБ в растворе в 10 раз по сравнению с чистым ДАБ и в 2 раза по сравнению с физической смесью компонентов. Таблица 5. Концентрация диацетата бетулина в водных растворах физических смесей и механокомпозитов диацетата бетулина с наполнителями
При этом содержание ДАБ в пленках, полученных выпариванием водных растворов физических смесей ДАБ - АГ, определенное с помощью ВЭЖХ анализа экстрактов в хлороформе, составляет 2 - 2,5 % от массы плёнки. При растворении пленки в воде были получены растворы с концентрацией ДАБ 150-180 мг/л [206]. Физико-химические свойства механокомпозитов дипропионтата бетулина с аэросилом и арабиногалактаном
Получение композитов было проведенопо методике, описанной в пункте 2.2. На рисунке 22 представлены электронно-сканирующие ДПБ, Si02 , смеси ДПБ с АГ механоактивированных в течение 15 и смеси ДПБ с SiC 2 механоактивированных в течение 15 и 30 минут.
Из рисунка 22 видно, что исходный ДПБ представляет собой кристаллы с размером от 10 до 100 мкм. В результате механической обработки кристаллы дипропионата бетулина измельчаются до размеров 5-10 мкм. Механическая обработка с полимерами приводит к тому, что дипропионат бетулина теряет кристаллическую форму. Смесь ДПБ с АГ и SiC 2 является однородной, состоит из агрегатов частиц размером 5-30 мкм. Можно предполагать, что смеси гомогенизируются в результате диспергирования и перемешивания компонентов.
Электронные микрофотографии: а) ДПБ перекристаллизованный из этанола; б) аэросил; в) смесь ДПБ-Si02, MA 15 минут; г) смесь ДПБ-АГ, МА15 минут.
Результатом механохимической обработки является разупорядочение кристаллической структуры дипропионата бетулина, что подтверждается физико-химическими исследованиями.
На рисунке 23 представлены дифрактораммы перекристаллизованного дипропионата бетулина и после механической активации (МА). H
Согласно представленным дифрактограммам после механоактивации ДПБ в течение 15 минут наблюдается заметное уширение рефлексов, что является следствием сильного диспергирования образца. Однако положения основных рефлексов ДПБ практически не изменяются. Это свидетельствует об отсутствии фазовых переходов ДПБ в данных условиях обработки. Дифрактограммы ДПБ МА в течение 30 минут аналогична дифрактограмме ДПБ МА в течение 15 минут (рисунок 23).
Методом ВЭЖХ подтверждено, что химический состав образцов дипропионата бетулина после механической активации не изменяется. На рисунке 24 представлена дифрактограмма смеси ДПБ с Si02, механоактивированной в течение 5-30 минут.
Противоопухолевая активность на клетках асцитной аденокарциномы Эрлиха
Противоопухолевую активность исследуемых веществ оценивали по их способности вызывать апоптоз и некроз в клетках асцитной аденокарциномы Эрлиха в экспериментах in vitro.
Фактическая скорость роста опухолей определяется продолжительностью митотического цикла, величиной пролиферативного пула и степенью клеточных потерь. Наибольшее значение имеют величина пролиферативного пула и степень клеточных потерь. Поэтому для исследования противоопухолевого эффекта бетулина и его композитов определяли долю апоптотических и некротических клеток в популяции асцитных клеток под влиянием исследуемых веществ и уровень клеточной пролиферации.
Исследование показало, что доля клеток в состоянии некроза в контрольной популяции асцитных клеток составляла 21,4+2,0, а в состоянии апоптоза - 7,1+1,0 (таблица 5). Бетулин увеличивал долю некротических клеток в 3 раза, а долю апоптотических клеток - в 2 раза. В отличие от бетулина механоактивированные композиты резко уменьшали долю клеток в состоянии апоптоза (практически до нуля), однако долю некротических клеток увеличивали в 3,5 раза.
Результаты исследований показали, что в контрольной пробе исчезла популяция клеток, имеющая высокий уровень флуоресценции, и увеличивалась популяция клеток, имеющая низкий уровень флуоресценции, что свидетельствовало о высоком уровне пролиферации. Снижение уровня флуоресценции было связано с тем, что при каждом клеточном делении флуоресцентный краситель равномерно распределялся между дочерними клетками, и, таким образом, флуоресценция отдельных клеток снижалось, но количество флуоресцирующих клеток увеличивалось.
Таким образом, очевидно, что как бетулин, так и его композиты, обладали способностью к элиминации опухолевых клеток, однако механизм их воздействия был, по-видимому, разным. Также исследуемые вещества проявили антипролиферативный эффект, что свидетельствует о том, что бетулин и его композиты увеличивают скорость не только клеточной элиминации, но и тормозят деление опухолевых клеток, проявляя ярко выраженный противоопухолевый эффект.
Достоверность отличий от контроля, Р 0,05. Полученные данные показывают, что общая доля элиминирующихся клеток у исходных ДАБ и ДПБ примерно одинаковая и составляет около 28-29%. При этом доля асцитных клеток в состоянии апоптоза увеличивается до 36% у механокомпозита ДАБ-АГ и до 41% у механокомпозита ДПБ-АГ, т.е более чем ВІЗ раз по сравнению с контролем.
Известно, что внутриклеточный кальций является наиболее важным внутриклеточным мессенджером, уровень которого изменяется под влиянием внешних сигналов и, таким образом, он регулирует функциональное состояние клетки и предопределяет путь ее развития. Многократное увеличение внутриклеточной концентрации катионов кальция стимулирует клеточное деление.
Для выявления возможных механизмов действия исследуемых веществ определяли изменение содержания кальция, натрия и калия в клетках АКЭ. Популяция асцитных клеток в контрольных образцах делилась на 2 фракции: с высокой и сниженной концентрацией катионов кальция. Все исследуемые вещества - механокомпозиты, а также исходные ДАБ, ДПБ уменьшали долю клеток с высокой концентрацией кальция, свидетельствуя о подавлении уровня пролиферации асцитных клеток (рис. 29 а, 30а).
Изменение концентрации катионов кальция (а), натрия (б) и калия (в) в клетках АКЭ под влиянием механокомпозита ДАБ с АГ (2), ДАБ (3) и АГ (4) в сравнении с контролем (1). Интенсивность флуоресценции Интенсивность флуоресценции Интенсивность флуоресценции
Все исследуемые вещества снижали также концентрацию внутриклеточного калия и натрия, подтверждая запуск апоптоза клеток, причем в большей степени содержание катионов калия в клетке снижалось под воздействием механокомпозитов ДАБ с АГ и ДПБ с АГ (рис. 24 б, в; 25 б,в).
Противоопухолевая активность на клетках аденокарциномы легкого человека (А549) Противоопухолевую активность исследуемых веществ также определяли в экспериментах in vitro в культуре клеток аденокарциномы легкого человека А549 (American Tissue Culture Collection, USA) в контроле с культурой здоровых эпителиальных клеток легкого MRC5 (American Tissue Culture Collection, USA).
Проведено сравнительное исследование противоопухолевой активности по отношению к раковым клеткам легкого диацетата и дипропионата бетулина, их физических смесей с арабиногалактаном, а также композитов ДАБ и ДПБ с АГ, полученных в виде пленок. Все исследуемые вещества, как исходные диацилы бетулина ДАБ и ДПБ, так и их физические смеси с АГ, и пленки с АГ, вызывали апоптотические процессы в клетках аденокарциноми легкого А549 (табл. 9 и 10).
Анализ полученных результатов показывает, что противоопухолевая активность чистого ДПБ значительно превышает активность ДАБ. Активность физической смеси ДАБ с АГ не отличается от активности исходного ДАБ, однако поскольку мы брали смеси с соотношением «активный компонент - наполнитель» 1:9, то содержание ДАБ в композите в 9 раз меньше, чем в чистом веществе. Поэтому ДАБ в смеси обладает большей противоопухолевой активностью, чем чистый ДАБ. Ввиду возможного комплексообразования ДПБ с АГ в растворе, противоопухолевая активность физической смеси ДПБ с АГ снижена по сравнению с чистым ДПБ.
![Ионообменные свойства полимера на основе фенилкаликс[4]резорцинарена](/i/i/4587/328952.png "Ионообменные свойства полимера на основе фенилкаликс[4]резорцинарена Федяева Оксана Николаевна")
