Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 10
1.1. Самоорганизация липидов и липид-(со)полимерных систем 10
1.1.1. Самоорганизация липидов на примере лецитина. Строение клеточной мембраны 10
1.1.2. Самоорганизация макромолекул на границе раздела фаз 22
1.1.3. Полимеризационный липидный монослой 29
1.2. Методы исследования тонких пленок моно- и бимолекулярных слоев 34
1.2.1. Метод смачивания 34
1.2.2. Термодинамика поверхностного слоя 37
1.2.3. Монослои Ленгмюра на основе полимеров и амфифильных сополимеров 43
2. Экспериментальная часть 50
2.1. Исходные вещества и методики очистки 50
2.1.1 .Синтез полимеров и сополимеров 52
2.1.2. Синтез фосфатидилхолина (лецитина яичного) 53
2.2. Методы исследования 56
2.2.1. Методика получения монослоев Ленгмюра 56
2.2.2. Измерение краевых углов смачивания 61
3. Обсуждение результатов 65
3.1. Смачивание и термодинамические свойства тонких пленок амфифильных (со)полимеров и их смесей с лецитином 66
3.1.1. Поверхностная и межфазная энергия Гиббса как мера сродства ВМС к полярным и липофильным биологически системам и средам 67
3.1.2. Определение поверхностной энергии Гиббса сополимеров 68
3.1.3. Определение межфазной энергии Гиббса и ее составляющих для гидратир о ванных сополимеров 72
3.1.4. Смачивание смесевых пленок "лецитин - сополимер" 79
3.2. Физико-химические закономерности формирования и свойства монослоев. Метод Ленгмюра 85
3.2.1. Монослои амфифильных"сополимеров и их смесей с лецитином на водной субфазе 86
3.2.2. Вязкость сильно разбавленных растворов сополимера Gr-NBrm 92
3.2.3. Влияние характера растекания растворов на свойства монослоев 95
3.2.4. Электронные спектры поглощения 97
3.3. Амфифильные статистические сополимеры как компоненты мембраны фосфолипидных везикул (липосом) 103
3.3.1. Агрегативная устойчивость везикулярных систем 106
3.3.2. Изучение адсорбции лекарственного препарата на поверхности 109
3.3.3. Механизм введения лекарственного препарата во внутреннюю полость везикул 113
Выводы 116
- Методы исследования тонких пленок моно- и бимолекулярных слоев
- Синтез фосфатидилхолина (лецитина яичного)
- Физико-химические закономерности формирования и свойства монослоев. Метод Ленгмюра
- Агрегативная устойчивость везикулярных систем
Введение к работе
В настоящее время активно используется метод моделирования, в рамках которого получают и исследуют искусственные мембраны как упрощенные модели биологических мембран. Важным требованием, предъявляемым к моделям мембран, является их устойчивость в условиях эксперимента. Традиционно используемые модельные мембраны - везикулы1 (липосомы), монослои на поверхности вода-газ, «черные» липидные мембраны", как и биологические мембраны, весьма лабильны, что в определенной степени ограничивает метод исследования.
В последнее время активно развивается направление по созданию стабильных искусственных липидных мембран, основанное на использовании липидов с полимеризуемыми группами [1]. Полученные таким образом высокостабильные полимерные везикулы используются для изучения механизмов взаимодействия везикул с клетками, фиксации ферментов в линидной мембране, создания средств направленного транспорта биологически активных веществ в организме и искусственных переносчиков кислорода. Полимерные моно- и мультимолекулярные слои находят применение при создании биосенсоров, модификации поверхности имплантантов и получении гемосовместимых материалов, при разработке запоминающих устройств [2].
Методы исследования тонких пленок моно- и бимолекулярных слоев
Многочисленными исследованиями продемонстрирована возможность корреляции поверхностных свойств полимеров и смачиваемости их поверхности различными жидкостями [33]. Смачивание — это поверхностное явление, заключающееся во взаимодействии жидкости с твердым телом или другой жидкостью при наличии линии одновременного контакта трех несмешивагощихся фаз, одна из которых обычно является газом (воздухом). В зависимости от числа фаз, участвующих в смачивании, различают два основных случая. 1. Смачивание при полном погружении твердого тела в жидкость, в котором участвуют только две фазы - жидкость и твердое тело. Иммерсионное смачивание реализуется обычно при смачивании порошков и мелких частиц. 2. Контактное смачивание, в котором на ряду с жидкостью и с твердым телом контактирует третья фаза - газ или другая жидкость. Возможны такие случаи, когда в смачивании участвуют четыре разных фазы - твердое тело, газ, две жидкости. Характер смачивания определяется, прежде всего, физико-химическими взаимодействиями на поверхности раздела фаз, которые участвуют в смачивании. Интенсивность этих взаимодействий при иммерсионном смачивании характеризуется теплотой смачивания. Контактное смачивание характеризуется чаще всего величиной краевого угла - угла между поверхностями жидкости и твердого тела на границе с окружающей средой. Наиболее наглядно представление о краевом угле можно получить из примера контакта капли жидкости с поверхностью твердого тела или пузырька газа с твердой поверхностью в жидкости. Поверхностная и межфазная энергия Гиббса имеет двойную размерность - энергии Дж/м: и силы Н/м. В последнем случае говорят о поверхностном натяжении, которое направлено тангенциально к поверхности и в сторону се сжатия. В таблице 1.2 приведены вектора поверхностного натяжения в различных системах. Необходимо различать равновесные и неравновесные краевые углы. Равновесный краевой угол 0{) зависит только от термодинамических свойств системы, а именно, от поверхностных натяжений на границе раздела фаз, участвующих в смачивании. Поэтому для каждой системы при данных внешних условиях равновесный краевой угол имеет одно определенное значение. Краевые углы, которые измерены при отклонении системы от состояния термодинамического равновесия, называются неравновесными. Во время контакта фаз, участвующих в смачивании, неравновесные краевые углы могут изменяться. Краевые углы, изменяющиеся в процессе растекания жидкости по поверхности твердого тела, называются динамическими.
Для динамических краевых углов характерно, что их изменение происходит при перемещении линии смачивания. Зависимость динамических краевых углов от времени характеризует скорость растекания жидкости. Неравновесные краевые углы могут также изменяться при постоянной площади смачивания вследствие постепенного изменения свойств системы или объема капли за счет различных физико-химических процессов - испарения жидкости, взаимного растворения твердого тела и жидкости, адсорбции, химических реакций и так далее. В таких случаях изменение неравновесных краевых углов определяется уже не скоростью растекания жидкости, а одним из сопутствующих физико-химических процессов. В зависимости от значений равновесного краевого угла различают три основных случая. 1. Несмачивание (плохое смачивание) - краевой угол тупой: 18О" 0О 9О (вода на парафине или тефлоне). 2. Смачивание (ограниченное смачивание) - краевой угол острый: 9О 0() О (вода на металле, покрытом окисной пленкой). 3. Полное смачивание. Равновесный краевой угол не устанавливается, капля растекается в тонкую пленку (ртуть на поверхности свинца, очищенной от оксидной пленки). Величина равновесного краевого угла определяется соотношением сил притяжения жидкости к твердому телу и сил взаимного притяжения между частицами самой жидкости. Равновесный краевой угол представляет одну из важнейших характеристик смачивания. Уравнение, определяющее величину равновесного краевого угла, можно вывести разными способами. Наиболее строг и последователен метод, основанный на известном положении термодинамики о том, что в состоянии равновесия свободная энергия системы минимальна. В связи с этим для определения условий равновесия при смачивании необходимо учитывать энергетические изменения, которые происходят на поверхности раздела фаз. Количественной энергетической характеристикой поверхности твердых тел и жидкостей служат удельная поверхностная энергия Гиббса ys, граница раздела твердое тело - жидкость, две несмешивающиеся жидкости характеризуют ys и YSI-1.2.2. Термодинамика поверхностного слоя. Значения поверхностной и межфазной энергии Гиббса связаны простыми соотношениями с работой когезии WK и адгезии Wa. Напомним, что под этими терминами подразумевается притяжение атомов и молекул внутри одной фазы и двух разных фаз. Естественно, что в последнем случае имеется в виду поверхность (граница раздела фаз) и пограничные слои. При разрыве цилиндра одной фазы единичной площади образуется две границы раздела на которых сконцентрирована поверхностная энергия Гиббса, следовательно Если разорвать цилиндр идентичной площади состоящий из двух контактирующих фаз на границе раздела, то Это соотношение называется уравнением Дюпре. Обычно 7s определяют как половинную энергию когезии AGKor. твердой пленки (твердого тела).
В настоящей работе величины ys и ysj находили исходя из значений равновесных углов смачивания идеальной поверхности твердого тела. Согласно уравнению Юнга: где ysv, ysi - межфазная энергия Гиббса на границах раздела твердое тело - пар, твердое тело - жидкость, соответственно; ylv- межфазное натяжение на границе раздела жидкость - пар; 60 - равновесный краевой угол смачивания. Фундаментальным уравнением используемым для нахождения межфазной энергии Гиббса по данным краевых углов смачивания является уравнение вида, предложенное в работе [44]: где Ф - параметр межмолекулярного взаимодействия (Ф !). Подставив уравнение (1.5) в уравнение Юнга (1.6), получим уравнение с одной неизвестной ys. В основе развиваемых теоретических представлений и предлагаемых экспериментальных методов измерения межфазных энергий и компонент межфазных энергий лежат следующие допущения: 1. Общая поверхностная энергия твердых тел и жидкостей может быть представлена как сумма дисперсионной и полярной компонент; 2. Работа адгезии, равная Wsl -/ +//- ys\ также определяется суммой дисперсионных и полярных компонент: 3. Как дисперсионная, так и полярная компонента работы адгезии могут быть выражены как среднегеометрические величины: 4. Компоненты свободной поверхностной энергии (в особенности, дисперсионные компоненты) твердых тел в неполярном окружении не зависит от природы неполярной фазы, (т.е. одинаковы для всех углеводородов и для воздуха). Отсюда следует, что На основании этого уравнения можно делать определенные выводы о совместимости полимерного материала со средой. Межфазное натяжение может быть равным нулю, если // = Ys и Yi = Ys Такой материал будет идеально совмещаться с водной средой (компонентами крови), не промотируя адгезии. С другой стороны, такой материал согласно представлениям о лиофильности должен самопроизвольно диспергироваться в кровь. Поэтому величина їй не должна быть меньше 3 мДж/м". Из последнего уравнения видно, что некоторые комбинации полярных и дисперсионных составляющих свободной поверхностной энергии твердого тела могут давать межфазное натяжение кровь — биоматериал —1—3 мДж/м . Таким образом, критерию совместимости с водной средой могут отвечать любые, по крайней мере, сильно различающиеся по свободным поверхностным энергиям полимеры. Очень многие полимеры, при У si - ЗмДж/м2, могут быть совместимы (кровесовместимыми) в течение короткого времени. Однако, совместимость с кровью со временем может ухудшаться.
Синтез фосфатидилхолина (лецитина яичного)
В работе был использован лецитин, полученный из яичного желтка экстракцией этанолом, подвергают многократным переосаждениям хлоридом кадмия. Материалы: свежие куриные яйца, ацетон, этанол, хлорид кадмия, хлороформ, сульфат натрия. Желтки куриных яиц (10 штук) гомогенизируют при 4000 об/мин в течение 30 сек. в ацетоне, охлажденном до -10...-15. Смесь фильтруют на воронке Бюхнера, и экстракт, содержащий нейтральные липиды, удаляют, процесс повторяют 6 раз, что обеспечивает полное удаление нейтральных липидов. Полученный порошок заливают 600 мл этанола, и смесь встряхивают в течение 1 часа при комнатной температуре, затем фильтруют па воронке. К сухому остатку прибавляют 300 мл этилового спирта и повторяют обработку, фильтраты соединяют и охлаждают до -10...-12". К раствору липидов добавляют 13 мл 50%-го раствора хлорида кадмия, выдерживают I час при температуре 3-5(. Полученный кадмиевый аддукт фосфатидилхолина отделяют и растворяют в 85 мл хлороформа, к хлороформному раствору липидов медленно прибавляют 600 мл этанола, содержащего 8 мл 50%-го раствора хлорида кадмия, и выдерживают ЗОмин при температуре 3-5, операцию повторяют четыре раза. Кадмиевый аддукт фосфатидилхолина растворяют в 120 мл хлороформа и добавляют 120 мл 30%-го этанола, смесь перемешивают 5 мин., водно-спиртовый слой удаляют, операцию повторяют до исчезновения реакции на ионы хлора. К раствору добавляют 40г безводного сернистого натрия и выдерживают 10-12 часов при темпепратуре 3-5. Хлороформный раствор липидов упаривают в атмосфере азота при 30 , полученное липидное масло растворяют в необходимом растворителе (или оставляют в виде хлороформного раствора). Полученный препарат содержит 90-95% фосфатидилхолина и 5-10% примесей фосфалипидов [73,74]. 2.2. Методы исследования Формирование моделей биосистем. Для моделирования биосистем были использованы сополимеры: Ст-ЫВПД (т2=0.5), Ст-4ВП (т2=0.9), Ст-МАК (т2=0.35) и природный фосфалипид - яичный лецитин с молекулярной массой М=7бб, а также двойные системы (их смеси). Тонкая пленка мембранонодобных структур. Предварительную подготовку подложек для формирования тонкой пленки лецитиновых, полимерных и смешанных мембранонодобных структур проводили по следующей методике.
Стеклянные подложки отмывали в хлороформе, затем выдерживали в горячем растворе хромовой смеси при 100 С в течение 20 минут, промывали 10 минут в горячей воде при 90 С, в холодной проточной воде и дважды в бидистиллированной воде комнатной температуры. Подложки подвергали терм о стабилизации при 160 С в течение трех часов. Поверхность стандартизовали по измерениям краевых углов смачивания натек. КаПЛИ ВОДЫ. Для формирования тонкой пленки, очищенные подложки погружали в хлороформный раствор определенной концентрации(0.0001-0.8 г/л) на 1 минуту при комнатной температуре и затем высушивали в вакуумном эксикаторе в течение не менее 60 минут. Контроль поверхности осуществляли измерением краевых углов смачивания. Везикулярные системы. Метод обращения фаз. 0.036 г. вещества (лецитина или смеси лецитина и ВМС) растворяли в 10 мл. хлороформа, добавляли 5 мл. бидистиллированной воды и обрабатывали УЗ в течение 1 минуты при 44 кГц. Затем добавляли 150 мл воды и подвергали повторному озвучиванию в течение 1-2 мин при 44 кГц. Полное удаление органического растворителя производили на водоструйном насосе [75,76]. Получение везикул на подложке. Растворяли лецитин или его смесь с ВМС (0.036г) в 10мл хлороформа и микрошприцом наносили раствор на специальную стеклянную плоскую подложку. Высушивание проводили под вакуумом. Затем подложку с высушенным слоем смеси лецитина и ВМС погружали в стакан с бидистиллированной водой на короткое время (—1 мин.) и сушили в вакуумном шкафу при комнатной температуре [77,78]. Получение мембраны. Мембрану получали с использованием метода Ленгмюра-Блоджетт на приборе, принцип действия которого основан на измерении зависимости поверхностного давления п от площади, занимаемой одной молекулой. Для получения мембран наносили на поверхность воды (субфазы) ЗОмкл хлороформного раствора (лецитина, сополимера, смеси). Электропривод двигает подвижный барьер 3 и сжимает монослой, который давит на неподвижного барьера 2. Под действием этой силы барьер 2 отклоняется, передавая сигнал через ИК-датчик 1. Напряжение с ИК-датчика 1 и электропривода (координаты барьера) автоматически вводятся в компьютер 6 через интерфейс. Калибровка прибора для определения параметров сжимаемости. Калибровку прибора проводили стандартными проверенными разновесами от 0 до 1г. Для этого тефлоновую ванну 4 (рис.2.1) промывали свежеприготовленной хромовой смесью, дистиллированной водой, дважды бидистиллированной водой.
Ванну 4 устанавливали на фиксаторы, помещали под пылезащитный прозрачный колпак и заполняли жидкой субфазой ( 1 мм выше уровня ванны). Поверхность жидкости очищали при помощи тефлонового барьера 3. Для этого барьер 3 помещали на край ванны 4, таким образом, чтобы он касался жидкой субфазы, затем барьер перемещали по всей поверхности субфазы, собирая с нее пыль и другие загрязнения. Эту процедуру повторяли многократно, используя каждый раз новый барьер. Устанавливали измерительный (неподвижный) барьер 2 на поверхность жидкой субфазы при помощи проволочного держателя таким образом, чтобы исключить зазоры и трение между стенками ванны 4 и измерительным барьером 2. Нагружали неподвижный барьер 2, связанный с весами Ленгмюра, разновесами от 10 до 1000мг, компенсировали отклонения показаний компьютера (весов Ленгмюра) 6 относительно нулевого положения и строили калибровочную зависимость показаний шкалы прибора от истинного значения массы m[ip=f(m„CT.) (рис.2.2) Проверяли соответствие полученных значений параметрам состояния стандартной диаграмме сжимаемости пальмитиновой кислоты на водной субфазе. Полученные результаты соответствовали литературным данным (рис. 2.3 а,б) [79]. Для получения плотноупакованного мономолекулярного слоя по методу Ленгмюра-Блоджетт необходимо нанесение на субфазу точно рассчитанного количества пленкообразующего вещества. Для полимеров проводили расчет количества вещества, приходящегося на единицу площади - м7мг. Полимеры растворяли в легколетучих органических растворителях, не смешивающихся с веществом субфазы. Для обработки экспериментальных данных была создана специальная компьютерная программа. Устанавливали нулевое значение показателя весов Ленгмюра и по каплям наносили из микрошприца по всей поверхности субфазы исследуемый полимер в легколетучем растворителе. Экспериментально устанавливали время достижения равновесного состояния моноструктуры полимера после испарения растворителя, которое для наших объектов исследования составляет 1 час. Компенсировали отклонение стрелки весов Ленгмюра, после чего приводили в действие механизм подвижного барьера 3, способного сжимать пленку со скоростью -1.2А"/мин-молекулу нажатием кнопки. После построения диаграммы сжимаемости все механизмы и датчики прибора были возвращены в исходное состояние. Измерение краевых углов смачивания было проведено по нескольким методикам: в условиях натекания, двухжидкостным погружным методом капли жидкости или воздушного пузырька. Прибор для измерения смачиваемости снабжен горизонтальным микроскопом 1 марки МПБ-2 для определения геометрических размеров капли и герметичной кюветой 2 (рис.2.4). Во всех случаях предварительно изучалась кинетика растекания капли жидкости 0=f(x) на изучаемой поверхности. Измерения проводили через определенное время, соответствующее области основного первого плато на кинетической кривой растекания, при 293К.
Физико-химические закономерности формирования и свойства монослоев. Метод Ленгмюра
Систематические исследования мономолекулярных слоев Ленгмюра статистических (со)полимеров стирола с полярными мономерами на поверхности водной фазы впервые проведены сотрудниками кафедры ВМС и коллоидной химии ННГУ [83]. Состояние монослоев, полученных из полуразбавленных растворов, и изложенных терминами л А-изотерм, интерпретировано в рамках скейлиыговой теории двухмерных полимерных растворов. Так, в изучаемых авторами условиях сополимер Ст-МВПД образуют монослои, представляющие собой двухмерную конденсированную фазу, а вода, на которой формируется монослой, является «0» (т.е. «идеальным») растворителем. Доказательством такого отнесения монослоев авторы считают удовлетворительное совпадение рассчитанной по экспериментальным данным и теоретически предсказанной величины критической скейлинговой экспоненты v для двухмерно ориентированных сополимеров CT-NBfm с Ш2 0.42 и т2=0.51. Состояния монослоев статистических сополимеров, полученных из разбавленных растворов, не исследованы. По аналогии с агрегатными состояниями обычного вещества мономолекулярные пленки можно разделить на три типа: газообразные, жидкие и твердые пленки. Газообразные пленки могут неограниченно расширяться, не претерпевая фазовых изменений, постоянные контакты между молекулами отсутствуют. В жидких пленках эти контакты, обусловленные межмолекулярным взаимодействием, возникают. Различают растянутые и конденсированные жидкие пленки. В последних большие оси молекул ориентируются перпендикулярно поверхности. Твердые пленки характеризуются строго линейными зависимостями л-А. Сжимаемость таких пленок мала и близка к сжимаемости твердого вещества, что указывает на плотную упаковку углеводородных цепей. Наблюдаемые нами эффекты минимальной добавки амфифильных статистических сополимеров в раствор или пленку лецитина (интересные реалогические свойства и экстремальная зависимость 9a=f(CBMC)) побудили нас детально исследовать состояние и свойства ленгмюровских монослоев сополимера, его смесей с лецитином при концентрациях ВМС ниже точки кроссовера, а также условия и физико-химические закономерности формирования монослоев. На рис/ 3.8, 3.9 приведены изотермы поверхностного сжатия 7t=f(A0) для монослоя яичного лецитина (чистота 98% І-олеил-2-пальмитоил-зп-фосфатидилхолина) и смесей с сополимерами . Экстраполяция на значение 71=0 позволяет оценить молекулярную площадь лецитина А0=0.54нм" (рис.3.8 кривая 1).
Теоретический расчет площади, занимаемой двумя плотно-упакованными гидрофобными цепями лецитина (модель щетки), дает величину AQ=0.41HM . Однако, в реальных условиях молекула лецитина в монослое содержит адсорбированную воду в своей полярной части. Поэтому общепринятым значением для плотно -упакованного лецитинового монослоя является величина А0=0.52-0.56 нм [6]. Принципиально иной характер имеют изотермы сжатия смесей лецитин - сополимер {рис.3.8 кривая 2, рис.3.9). На кривых 7c-f(A0) можно отметить две области, разделенные плато, различающихся но параметру сжимаемости р= — -В последнем случае экстраполяция величины А0 в I и во II областях равны (1.1±0.15)нм2 и (0.90±0.05)нм2, соответственно. Рассчитанные величины параметров сжимаемости (3=(0.2-Ю.7)- 1017Н/м3 в обеих областях изотермы сжатия позволяют рассматривать фазовые состояния монослоев как «жидко-твердые» пленки, предполагающие включение воды, связанной связями с полярными группами (со)полимера, в состав пленки. Переходная область, соответствующая двухмерному фазовому переходу (т.е. переходу к плотно упакованному монослою), сопровождаемому вытеснением части гидратационной воды, более четко выражена для смесей лецитина с (со)полимером Ст-4ВП (т2=0.9) (рис.3.9). Влияние сополимера на удельную площадь А0 более ощутимо в первой области. Во второй области возможны конформационные изменения полимерной цепи и изменения структуры монослоя, однако существенного вклада в величину А0 они не вносят и эффективная молекулярная площадь также значительно увеличивается по сравнению с Ао для лецитинового мономолекулярного слоя на границе раздела вода - монослой. Отсюда можно сделать вывод о том, что макромолекулы сополимеров иммобилизуются упомянутым слоем. На это же указывают заметно меньшие величины поверхностного давления, отвечающего коллапсу мономолекулярного слоя лецитина при малых добавках сополимера. Состояние монослоев смесей лецитина и сополимеров при массовом соотношении компонентов 100:3 практически не зависит от условий формирования монослоя на водной субфазе. В области поверхностных давлений от 0 до 30мН/м практически отсутствует гистерезис сжатия, что следует из практического совпадения кривых сжатия и обратного ему растекания, количество вещества и объем наносимой пробы (т.е. количество хлороформа) мало влияют на вид изотермы сжатия (табл.3.5.). Поскольку эффект значительного увеличения удельной площади проявляется при малых концентрациях ВМС в монослое, то в следующих опытах было изучено влияние концентрации раствора сополимера, его абсолютного количества и объема, наносимого на водную подложку, на изотермы сжатия. На примере сополимера Ст-ЫВПД (ІТІ2=0.5) показано, что при уменьшении концентрации раствора сополимера, наносимого на субфазу, существенно возрастает удельная площадь ВМС в монослое — от 0.34 до 30.5 нм2/звено (таблица 3.5., рис.3.10. а, б, в). Результаты данных исследований свидетельствуют о наиболее сильном влиянии сополимеров в лецитиновой пленке на энергетические свойства в области малого и сверхмалого относительного содержания ВМС. Принимая во внимание тот факт, что осаждение пленок осуществлялось из сильно-разбавленных растворов лецитина при крайне низком относительном содержании полимера в смеси (0.01-1%), необходимо учесть характерные изменения в природе растворов полимеров, происходящие с изменением их концентрации.
Наиболее простым и информативным методом для оценки последнего является вискозиметрия. Используемые в наших опытах концентрации сополимера существенно ниже точки кроссовера (порядка 0,1%-1% в зависимости от М.М.), которая разделяет растворы полимеров с изолированными клубками и взаимопроникновением последних. Отсутствие перекрывания клубков благоприятствуют их вытяжке и ориентации макромолекул при внешнем воздействии, например в потоке. Хорошо известно, что малые и сверхмалые добавки полимеров уменьшают вязкость жидкостей [84,85]. В этом случае вязкость растворов полимеров становятся меньше вязкости растворителя. Эффект связывают с разворачиванием полимерных клубков и ориентацией макромолекул по потоку, что способствует переходу от турбулентного к ламинарному течению [85]. Для объяснения описанного выше явления, были проведены две серии экспериментов. Во-первых, была измерена вязкость растворов сополимеров Ст-КВПД двух составов в широком диапазоне концентраций. Оказалось, что при малых концентрациях сополимера, вязкость растворов становится меньше, по сравнению с вязкостью растворителя (т/т0 1), при этом значения приведенной вязкости (числа вязкости) становятся отрицательными величинами. Так при концентрации полимера 0.05 — 0.5г/л найдены отрицательные и крайне низкие значения вязкостных характеристик: г]уіі/С(0.05.тг ) «-0.4.W-1; і]у,/С\0.5л-г ]) = -0.04л-г ] (табл.3.4). В области концентраций полимера 3 г/л числа вязкости приобретают положительное значение и соответствуют 0.33 л/г. Отметим, что лецитин снижает вязкостные характеристики изучаемых растворов. Растворы исходного лецитина в хлороформе в интервале концентраций от 0.05 до 5.0 г/л также характеризуются крайне низкими значениями вязкости: свежеприготовленные растворы имеют величины гуд/С от -0.04 до 0.09 л/г, а выдержанные в течение суток от -0.04 до 0.006л/г. Влияние сополимера Ст-NBTXU на состояние растворов более ощутимо в свежеприготовленных растворах полимера и его смесей с лецитином, тогда как в выдержанных растворах влияние Ст-МВПД минимально, а вязкостные характеристики определяются главным образом лецитином. Таким образом, вискозиметрические исследования подтвердили значительные изменения в структуре лецитиповых и полимерных растворов, и в их смеси в области малых концентраций компонентов.
Агрегативная устойчивость везикулярных систем
В настоящей работе рассмотрена возможность стабилизации везикулярных структур (повышение агрегативной устойчивости при хранении и кинетической устойчивости в организме) введением в систему амфифильных статистических сополимеров. Совокупность рассмотренных данных (раздел 3.1.2, 3.2) указывает на иммобилизацию сополимеров с гидрофобно-гидрофильными звеньями, в особенности ионогенных сополимеров в би- и монослой лецитина. Стоило ожидать, что это обстоятельство найдет отражение при визуализации везикул лецитина. Из данных, полученных методом атомной силовой микроскопии видно, что в ряду изучаемых сополимеров наилучшие результаты были достигнуты с использованием сополимера Ст-4ВГТ (гл2=0.9). Из рис. 3.15 видно, что в отсутствие сополимера наблюдаются следы слияния везикул. В присутствии малого количества сополимера в смесевой пленке, близкого к тому, что соответствует минимуму на кривых зависимости углов смачивания от состава смеси сополимер - ПАВ, следы слияния везикул практически отсутствуют. Особенно ярко этот эффект выражен для смеси лецитин - сополимер стирол - ВП. Видно, что присутствие данного сополимера полностью исключает следы слияния везикул, т.е. в максимальной степени стабилизирует везикулы. Можно полагать, что в данном случае фрагменты ламеллей лецитина армированы цепями амфифильных ионогенных сополимеров, как это было постулировано в работе [89] по отношению к полимер-коллоидным комплексам синтетических ПАВ с полиэлектролитами. Следует также отметить, что независимо от метода формирования (метод обращения фаз или получение на подложке) преимущественно образуются везикулы с размерами от 0.1 до О.Змкм (малые и большие), т.е находятся в «нано» диапазоне (рис.3.15). При большой массовой концентрации сополимера в смешанной пленке образуются большие олигомерные везикулы с размером О.Ы.Омкм (рис.3.15.). Из данных рис.3.15. видно, что при большой массовой концентрации ВМС в ряде случаев теряется везикулярная структура системы. Кроме того, она становится неустойчивой, наблюдается агрегация частиц.
Не исключено, что такое слияние обусловлено дополнительным электростатическим взаимодействием ионогенных звеньев ВМС, а также возможными межмолекулярными взаимодействиями ВМС и лецитина. Для изучения механизма введения доксорубицина (ДР) на поверхности везикулярных частиц нами изучена адсорбция ДР на поверхности тонкой пленки амфифильного сополимера и на поверхности везикулярных структур из водных растворов ДР. Везикулярные структуры на основе сополимера и лецитина получали методом обращения фаз с последующим инжектированием наноразмерной дисперсии через хроматографический шприц на стеклянную сухую подложку. Тонкий слой на подложке высушивали под вакуумом в среде аргона. Подложку с липидно-полимерными везикулами выдерживали в растворах ДР различной концентрации в течение нескольких часов. Величину эффективной удельной адсорбции ДР рассчитывали по формуле: С,, и Сж - начальная и равновесная текущая молярная концентрации, устанавливаемые методом электронной спектроскопии по полосам 480 и 500нм (реперные полосы ДР) в соответствии с калибровочным графиком; А - площадь поверхности подложек, на поверхность которых адсорбировался ДР; V - аликвота (л). На примере системы лецитин - полимер Ст-4ВП (т2=0.9) при массовом соотношении 100:5 рассчитанная величина А ф. для липид-полимерной пленки равна 8.3-10 ммоль-см"2. Показано, что ДР почти не адсорбируется на поверхность лецитина А-,фф = 1-10"13моль-см 2 и этой величиной можно пренебречь. В этом случае величину А,фф. (=8.3Т0" моль/см"") можно отнести за счет адсорбции ДР на поверхность полимера. Более детально процесс адсорбции был исследован на поверхности тонкой пленки сополимера. В качестве примера был выбран сополимер Ст-ЫВПД (пт2=0.5), имеющий неионогенное физиологически активное звено, и представляющий интерес для медицины. Исследование адсорбции ДР на поверхности тонкой пленки Ст-ЫВПД было проведено на основе анализа зависимости поверхностного натяжения от концентрации у=ґ(СдР) в растворе до и после адсорбции, а также изучением изотерм смачивания 9а= (Сдр). На рис.3.16. представлены изотермы поверхностного натяжения у=ґ(Сді ) до и после адсорбции. Расчет эффективной удельной адсорбции ДР на границе раздела «раствор — воздух» был выполнен графическим решением уравнения Шишковского. Рассчитанная величина Гтах=1.3Н0" моль/см2 была определена по значению коэффициента b=RiTmax в области концентраций ДР в координатах /о "У = Л)пС) в области средних концентраций. Го-Г = Ып(АС + 1) (3.25), где b =rmax-RT, А -эмпирический коэффициент, определяющийся природой жидкой поверхности; R - универсальная газовая постоянная, Я=8.31Дж/К-моль; Т-температура, К. Величина Гтач-1.31-10" моль/см" была определена по значению коэффициента b RTrmax в области высоких концентраций ДР. Величина эффективной адсорбции Алік, ДР на поверхности Ст-ЫВПД, вычисленная по формуле (3.24) равна А- фф.=Г=(3.7±0.1)10"0моль/см2. Изучение зависимости 8а=ДСщ ) на низкоэнергетических поверхностях полимеров позволяют рассчитать абсолютную адсорбцию по Гиббсу на границе раздела твердое тело - раствор [90], используя уравнение Юнга: При [ДР]ІП 0.96-10 3М и [ДР]ог=1.1-10-6М, а 1-103, этот результат совпадает с литературными данными [91] и отвечает практически 100% загруженности везикул.
Учитывая тот факт, что тонкая пленка Ст-ЫВПД однородная и гладкая (без пор), полученные высокие значения эффективной адсорбции позволяют предложить данный сополимер как компоненту липидных везикул, стабилизирующую везикулы, и способствующую связыванию ДР с мембраной (оболочкой везикул). Таким образом, на основе проведенных исследований можно сделать следующие выводы: 1. Амфифильные сополимеры Ст-МАК, Ст-4ВП, Ст- ЫВПД увеличивают агрегативную устойчивость липидных везикул, предотвращая их слияние во времени. 2. . Размер липид-полимерных везикул, полученных методом обращения фаз не превышает 0.2-0.3мкм. 3. На примере токсичного противоопухолевого антибиотика доксорубицина (ДР) показана принципиальная возможность заполнения им везикул лецитина, армированных амфифильным сополимером Ст-ЫВПД (trb=0.5) за счет эффектов сорбции на на поверхность полимерсодержащих везикул и на поверхность тонкой пленки сополимера Ст-ЫВПД. Спектральными измерениями Сдр, методами смачивания CosO-f( j ) и анализа изотерм поверхностного натяжения у=(Сд] ) по уравнениям Шишковского, Юнга и Гиббса рассчитана эффективная удельная адсорбция ДР на поверхности Ст-ЫВПД АЭфф.=(3.7 -4.0)-10"шмоль/см2. Внедрение ДР в оболочку везикулы и связывание его со Ст-ЫВПД позволит снизить концентрацию токсичного лекарственного вещества, увеличить его биодеградируемость и селективность действия. L. Выполнен комплекс физико-химических исследований по модификации липидных мембран синтетическими амфифильными сополимерами, применительно к «наноконтейнерной» технологии транспорта лекарственных средств. 2. Осуществлен первичный выбор статистических сополимеров, как возможных компонентов липидных мембран методом смачивания. Измерены углы натекания и оттекания на поверхности раздела пленок сополимеров стирола с N- винилпирролидоном, 4-ви ни л пиридином, метакриловой кислотой с воздухом, водой, неполярными жидкостями, найдены значения поверхностной и межфазной энергии Гиббса, их полярной и дисперсионной составляющих 7S{,w), Ts{w), 7S(o) В соответствии с коллоидно-химическими критериями биосовместимости, в качестве оптимальных были выбраны сополимеры Ст-ЫВПД (т2=0.5), Ст-4ВП (ггь=0.9) и Ст-МАК (ІГІ2=0.35) с минимальными значениями /S(.w)- (оь % 3. Методом смачивания и поверхностного сжатия монослоя ( анализ 71-А изотерм с использованием пленочных весов Ленгмгора) изучены свойства тонких пленок лецитин-(со)полимерных композиций.
![Монослои и тонкие пленки тиакаликс[4]аренов с иммобилизованным цитохромом с как биомиметическая модель антиоксидантной активности](/i/i/4714/575383.png "Монослои и тонкие пленки тиакаликс[4]аренов с иммобилизованным цитохромом с как биомиметическая модель антиоксидантной активности Кочетков Евгений Николаевич")
