Введение к работе
Актуальность исследования. Хронический вирусный гепатит С представляет собой медленную инфекцию, исходом которой является развитие латентного хронического воспаления печени с дальнейшим прогрессированием в цирроз печени и гепатоцеллюлярную карциному. В 85% случаев острой HCV-инфекции наступает хронизация, лишь у 15%) инфицированных HCV возможно спонтанное выздоровление [Su A.I. et al., 2002; Berkes J. et al., 2005; Santos C. et al., 2010]. Лечение хронического вирусного гепатита С является одной из наиболее актуальных проблем современной медицины. Однако, несмотря на то, что постоянно разрабатываются новые и совершенствуются хорошо известные схемы применения основных противовирусных препаратов (интерфероны, аналоги ігуклеозидов и др.), эффективность данной терапии составляет не более 75 % [Конусова В.Г. и соавт., 2003; McHutchison J.G. et al., 2009].
Высокая антигенная изменчивость вируса гепатита С - одно из основных препятствий к созданию эффективных вакцин на основе живых культур или полноразмерных рекомбинантных белков, что связано, в первую очередь, с изменчивостью аминокислотной последовательности вирусных протеинов [Richardson М.М. et al., 2005; Железникова Г.В. и соавт., 2007]. Естественное течение хронической HCV-инфекции подвержено значительным межиндивидуальным вариациям. Известно, что у части больных имеет место медленный темп прогрессирования фиброза. В то же время существует группа пациентов, у которых формирование цирроза печени происходит быстро (через 10-15 лет после инфицирования) [Friedman S.L. et al., 2003; Зайцев И.А. и соавт., 2009].
В последние годы особое внимание уделяется изучению генетических факторов, способных модифицировать скорость фиброгенеза при хронической HCV-инфекции [Абдуллаев СМ. и соавт., 2006; Morgan T.R. et al., 2008; Thomas D.L. et al., 2009]. Среди этих факторов особая роль принадлежит полиморфизму генов-регуляторов метаболизма - АРОЕ (аполипопротеин Е), HFE (белок наследственного гемохроматоза), SOD2 (супероксиддисмутаза-2) и гену 1L6 (интерлейкин 6) [Richardson М.М. et al., 2005].
Известно, что HCV циркулирует в плазме в комплексе с вырабатываемыми печенью липопротеинами очень низкой плотности (ЛПОИП) в мембранных везикулах, в которых идет репликация вируса. Помимо всех основных компонентов репликативного комплекса, везикулы содержат белки, необходимые для сборки ЛПНП, включая аполипопротеин Е [Huang Н. et al., 2007].
Прогрессивное развитие фиброза с исходом в цирроз печени наблюдается у 20-30% больных с хронической HCV-инфекцией. Помимо внешних факторов, модифицирующих естественное течение хронического гепатита С (например, злоупотребление алкоголем) определенную роль в ускорении фиброгенеза играет полиморфизм гена HFE [Maher J.J. et al., 2001; Hellier S. et al., 2003; Richardson M.M. et al., 2005]. Известно, что гетерозиготы по гену HFE характеризуются умеренным повышением уровня железа в организме [Абдуллаев СМ. и соавт., 2006].
Активация процессов свободнорадикального окисления является патогенетическим звеном развития многих вирусных заболеваний печени, при этом избыточное образование активных форм кислорода проявляется на самых ранних стадиях процесса [Нагоев Б.С. и соавт, 2003; Loguercio С. et al., 2003; Elchuri S. et al., 2005]. Среди антиоксидантов, нормализующих уровень АФК и продуктов ПОЛ, особое место принадлежит супероксиддисмутазе 2 типа, которая катализирует реакцию дисмутации - взаимодействия двух супероксидных радикалов друг с другом, превращая токсичный кислород в менее токсичную перекись водорода [Чурилова И.В. и соавт., 2002].
Излишняя продукция IL-6 ведет к увеличению экспрессии рецептора ЛПОНП [Hashizume М. et al., 2010], тем самым повышая проникновение вируса гепатита С в комплексе с ЛПОНП внутрь клетки. Кроме того, IL-6 участвует в обострении хронических, так и в переходе острых воспалительных процессов в хронические [Thornton A. et al., 1991; Decker К. et al., 1993].
Исходя из недостаточности фундаментальных знаний о механизмах генетической предрасположенности организма человека к воздействию вируса гепатита С в настоящее время не разработана система индивидуального прогнозирования характера течения, вероятности развития осложнений и эффективности лечения хронического вирусного гепатита С.
Цель исследования - установить роль полиморфизма генов HFE, АРОЕ, SOD2 и IL6 в патогенезе хронического вирусного гепатита С у представителей европеоидной популяции, проживающих на территории Томской области.
Задачи исследования:
-
Проанализировать характер распределения аллельных вариантов генов HFE, АРОЕ, SOD2 и IL6 у больных хроническим вирусным гепатитом С и здоровых доноров, принадлежащих к европеоидной популяции Томской области.
-
Оценить взаимосвязь полиморфизма генов HFE, АРОЕ, SOD2 и IL6 с активностью воспалительного процесса в печени при хроническом вирусном гепатите С.
3. Установить характер ассоциации аллельных вариантов генов HFE, АРОЕ, SOD2 и IL6 с тяжестью фиброза печени у больных хроническим вирусным гепатитом С.
Научная новизна. Впервые проведено сравнительное клинико-лабораторное и морфологическое обследование больных хроническим вирусным гепатитом С, имеющих различные темп прогрессирования фиброза и степень активности воспалительного процесса в печени, с определением у них частоты генотипов и аллелей полиморфных маркеров комплекса генов (НЕЕ, АРОЕ, SOD2 и IL6), белковые продукты которых принимают участие в различных этапах патогенеза хронической HCV-инфекции. На большой группе здоровых доноров изучена распространенность генотипов и аллелей полиморфизма вышеуказанных генов в российской популяции.
Показана ассоциация хронической HCV-инфекции и носительством генотипов ЕЗ/ЕЗ гена АРОЕ, Val/Val гена SOD2 и D/D гена HFE. Определены «профибротические» (SOD2 Val/Val; HFE 63H/D и 63D/D) и «протективные» (SOD2 Ala/Ala и Ala/Val; HFE 63Н/Н) генотипы, ассоциированные, соответственно, с быстрым и медленным темпами прогрессирования фиброза печени. Кроме того, установлена связь наличия аллеля G полиморфного варианта G174C промотерного региона гена IL6 с активностью воспалительного процесса в печени при HCV-инфекции.
Теоретическая и практическая значимость. Результаты проведенного исследования, позволившие выделить генетические факторы, влияющие па особенности течения HCV-инфекции, степень фиброза и активность воспаления печени, имеют значение для оценки прогноза хронического вирусного гепатита С. Установлены гены, носительство полиморфных вариантов которых, влияет на особенности клинико-морфологической картины хронической HCV-инфекции. Проведенное исследование позволит индивидуализировать тактику ведения больных ХВГС, учитывая данные клинического и генетического обследования.
Положения исследования могут служить основанием для разработки стратегии изучения молекулярных и клеточных механизмов формирования длительной персистенции HCV в организме. Полученные фундаментальные знания представляют основу для разработки новых подходов к патогенетически обоснованной терапии и своевременной профилактики развития хронической HCV-инфекции, а также осложнений, возникающих при длительной вирусной персистенции.
Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедры фундаментальных основ клинической медицины (по дисциплине «Клиническая лабораторная диагностика» в разделе
«Диагностика инфекционных заболеваний», по дисциплине «Молекулярные основы патологии» в разделе «Молекулярно-генетические основы предрасположенности организма к инфекционным заболеваниям») ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
У HCV-инфицированных пациентов европеоидной популяции, проживающих на территории Томской области, частота встречаемости аллеля ЕЗ и генотипа ЕЗ/ЕЗ гена АРОЕ выше по сравнению с таковыми у здоровых доноров. При этом у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С не выявлено взаимосвязи аллельного полиморфизма гена АРОЕ со степенью фиброза и активностью воспаления печени.
-
Частота встречаемости аллеля Val гена SOD2 и гомозигот с генотипом Val/Val достоверно выше у больных HCV-инфекцией по сравнению с аналогичными показателями у здоровых доноров. Степень фиброза печеночной ткани у больных хроническим гепатитом С сопряжена с увеличением частоты встречаемости аллеля Val и генотипа Val/Val гена SOD2. При этом не было выявлено взаимосвязи между носительством полиморфизма гена SOD2 и степенью воспалительного процесса в печени.
-
При исследовании полиморфизма H63D гена HFE установлено, что частоты встречаемости аллеля D и генотипа D/D достоверно выше у больных хроническим вирусным гепатитом С, существенны различия частот встречаемости полиморфизма H63D гена HFE у больных ХГВС с различной выраженностью фиброза печени, наряду с отсутствием различий частот встречаемости полиморфных вариантов гена HFE у больных с различной степенью активности воспалительного процесса в печени.
-
Анализ полиморфизма C282Y гена HFE у здоровых людей и больных гепатитом С не выявил достоверных различий в частотах распределения генотипов и аллелей. Кроме того, не было обнаружено различий частот встречаемости данных полиморфных аллелей и генотипов гена HFE у больных гепатитом С в зависимости от степени фиброза и активности воспаления печени.
-
В результате проведенного анализа полиморфизма C174G в промотерной области гена IL6 не выявлено статистически достоверных различий в исследованных группах (здоровые и больные HCV-инфекцией). При оценке значения полиморфизма C174G гена IL6 в развитии фиброза также были получены не достоверные различия частот встречаемости вариантных аллелей и генотипов гена у больных HCV-инфекцией с различной степенью фиброза печени. При изучении распределения аллелей и генотипов полиморфизма C174G гена IL6 в зависимости от степени активности воспаления выявлено, что
аллель G и генотип G/G ассоциированы с выраженной степенью воспалительного процесса печени.
Апробация работы. Результаты исследования были доложены и обсуждены на IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2009), IV международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2010), II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Вопросы патогенеза типовых патологических процессов" (Новосибирск, 2010), XVI межгородской конференции молодых ученных «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано б печатных работ, в том числе 2 - в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.
Объем и структура диссертации. Текст диссертации изложен на 119 страницах и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические рекомендации и список литературы, состоящий из 77 отечественных и 154 иностранных работ. Работа проиллюстрирована 1 рисунком и 17 таблицами.
Личный вклад автора. Анализ литературных данных по теме диссертации, планирование исследования, выделение ДНК, подбор праймеров, амплификация исследуемых генов, рестрикция амплификатов со специфическими рестриктазами, детекция результатов, статистический анализ результатов, написание диссертации выполнены лично автором.
