Содержание к диссертации
Список использованных сокращений 4
Введение 5
ГЛАВА I. Состояние проблемы хранения лейкоцитов в условиях
околонулевых температур (обзор литературы) 10
Структура и функциональные свойства лейкоцитов 10
Способы получения лейкоцитного концентрата и его применение 20
1.3 Особенности хранения лейкоцитов в условиях околонулевых
температур 24
ГЛАВА II. Материалы и методы исследований 31
2.1 Получение лейкоцитного концентрата 31
2.2 Разработка метода хранения лейкоцитов в условиях околонулевых
температур (+2 - 0 С) 31
2.3 Методы исследования функционального состояния лейкоцитов до и после
хранения в условиях околонулевых температур (+2 * 0 С) 37
2.4 Методы изучения биологических особенностей хладоограждающего
раствора 41
ГЛАВА III. Результаты экспериментальных исследований 45
3.1 Сравнительное исследование влияния трех вариантов
хладоограждающего раствора на функциональные и морфологические
показатели лейкоцитов, хранившихся при +2 * 0 С 45
3.2 Изучение функциональных и морфологических особенностей лейкоцитов
в зависимости от срока экспозиции в условиях +2 -*- 0 С 50
Определение скорости образования продуктов перекисного окисления липидов в мембранах лимфоцитов, хранившихся при +2 -* 0 С 58
Влияние длительности хранения разработанного хладоограждающего раствора на его свойства 58
3.5 Биологические особенности разработанного хладоограждающего
раствора 59
3.5.1 Испытание на «острую токсичность» разработанного
хладоограждающего раствора 59
3.5.2 Изучение «хронической токсичности» разработанного
хладоограждающего раствора 60
3.5.3 Определение пирогенности разработанного хладоограждающего
раствора 64
3.5.4 Изучение переносимости экспериментальными животными трансфузий
аутологичных леикоцитных концентратов, подвергнутых охлаждению до
+2 -5- 0 С в течение 24 часов с разработанным хладоограждающим
раствором 65
Глава IV. Обсуждение результатов экспериментальных исследований 68
Выводы 76
Список использованной литературы 78
Список работ, опубликованных по теме диссертации 98
Список использованных сокращений
АКМ - активированные кислородные метаболиты
ГМБТОЭМ - гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина
ГМФШ - гексозомонофосфатный шунт
ГФ - Государственная Фармакопея
ДМАЦ - диметилацетамид
ДМСО - диметилсульфоксид
ЛД50- средняя летальная доза
ЛК - лейкоцитный концентрат
ЛКБ - лизосомально-катионные белки
МДА - малоновый диальдегид
МПО - миелопероксидаза
НАДФ - никотинамиддинуклеотидфосфат
НК - нормальные киллеры
НСТ - нитросиний тетразолий
ОМЭПС - сукцинат 3-гидрокси-6-метил-2-этилпиридина (мексидол)
ПВП - поливинилпирролидон
ПОЛ - перекисное окисление липидов
ССР - свободнорадикальные реакции
СЦК - средний цитохимический коэффициент
ФАН - фагоцитарная активность нейтрофилов
ЭДТА Na2 - динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты
CDF - цитратфосфатдекстроза
Введение к работе
Актуальность темы. Изучению возможности сохранения физиологических функций клеток и тканей в условиях различной степени охлаждения посвящены работы многих ведущих исследователей (Svedentsov Е.Р. et al., 1998, 2004, 2005; Goltsev A.N. et al, 2000; Halle P. et al, 2001; Nishimura M. et al, 2001; Белоус A.M., Грищенко E.A. 1994; Утёмов СВ., 1999; Сведенцов Е.П., 1999, 2007). Среди всех объектов исследования криофизиологов лейкоцитный концентрат (ЛК) ввиду своей нестойкости занимает особое место. Ядерные клетки крови обладают сложной внутренней организацией, повышенными процессами метаболизма и являются весьма неустойчивыми к действию факторов холодового стресса (Белоус A.M., Грищенко В.И., 1994). Благодаря своему уникальному положению в системе неспецифической резистентности и иммунитета, а также наличию рецепторов к огромному числу биологически активных веществ нейтрофилы быстро реагируют на малейшие изменения постоянства окружающей среды. Резко изменяются их функциональные свойства, морфологические и биохимические характеристики, происходит модификация биоцидных и цитохимических функций (Гребенюк А.Н. и соавт., 1998, 1999).
Основное внимание исследователей направлено на выяснение механизмов перестроек биологических систем лейкоцитов, происходящих в условиях криоанабиоза различной глубины, но при околонулевых температурах (+2 + 0 С) особенности функционирования ядерных клеток крови не изучены. До настоящего времени метода их краткосрочного хранения в указанном диапазоне температур не существует. Исследования влияния околонулевых температур (+2 -*- 0 С) на лейкоциты и их физиологические свойства расширят представления о механизмах повреждения ядерных клеток крови в цикле охлаждения-отогрева и позволят создать простой, эффективный, безопасный метод сохранения ЛК. Это сделает данную трансфузионную среду более доступной и расширит область
ее применения, особенно в тех условиях, когда отсутствует возможность использовать холодовой анабиоз для хранения ЛК.
Цель исследования - определить функциональную активность лейкоцитов крови человека, перенесших охлаждение при околонулевых температурах от +2 до О С под защитой разработанного хладоограждающего раствора.
Задачи исследования:
Изучить жизнеспособность, функциональную активность и морфологический состав лейкоцитов, хранившихся в условиях околонулевых температур разные сроки.
Установить оптимальную концентрацию ингредиентов хладоограждающего раствора путем сравнения влияния трех его вариантов на сохранение жизнеспособности и функциональной активности
лейкоцитов крови человека.
3. Оценить в опытах на животных «острую» и «хроническую
токсичность», пирогенность оптимального состава разработанного
хладоограждающего раствора и установить переносимость переливания
аутологичных ЛК после их хранения с данным раствором в течение 1 суток
при +2 -ь О С крупными экспериментальными животными (собаками).
Научная новизна. Впервые установлена возможность сохранения на высоком уровне функциональной активности нейтрофилов, целостной плазматической мембраны лейкоцитов, стабильности их морфологического состава в условиях околонулевых температур (+2 -ь О С) в течение 6 суток под защитой разработанного нетоксичного и не требующего отмывания хладоограждающего раствора.
Предложен эффективный и широкодоступный метод краткосрочного хранения лейкоцитов при +2 *- О С.
Теоретическая и практическая значимость. Результаты работы расширяют представления о механизмах холодового повреждения и защиты лейкоцитов крови человека в условиях околонулевых температур. Это создает предпосылки для разработки надежных и безопасных методов хранения лейкоцитов крови или других высокоспециализированных клеток. С учетом особенностей воздействия околонулевых температур (+2 + О С) на ядерные клетки крови предложен оригинальный хладоограждающий раствор (патент РФ № 2311027 от 27 ноября 2007 г.), эффективно работающий в указанном диапазоне температур и не требующий применения дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала. В работе дано научное обоснование применения каждого из ингредиентов препарата.
Под защитой данного хладоограждающего раствора удается сохранить на высоком уровне функциональную активность лейкоцитов в течение 6 суток, что в перспективе позволит решить трудности получения больших доз лейкоцитов.
Результаты исследования представляют интерес для учреждений физиологического, медицинского и биологического профиля, специалистов криобиологов и сотрудников криобанков.
Основные положения, выносимые на защиту:
Лейкоциты сохраняют физиологическую активность и морфологическую полноценность в течение 6 суток в условиях околонулевых температур (+2 -*- 0 С) под защитой разработанного хладоограждающего раствора.
Хладоограждающий раствор, содержащий гексаметилен-бистетраоксиэтилмочевину, сукцинат оксиметилэтилпиридина, желатиноль, глюкозу, цитрат натрия и воду для инъекций, является нетоксичным, апирогенным и хорошо переносится крупными экспериментальными животными (собаками) при аутологичных трансфузиях лейкоцитов, хранившихся в условиях околонулевых температур (+2 -*- 0 С).
Апробация работы. Результаты исследования представлены в виде научных сообщений на Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы регионального экологического мониторинга: научный и образовательный аспекты» (Киров, 2006), V Молодежной научной конференции Института физиологии Коми НЦ УрО РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2006), Научно-практической конференции молодых ученых «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Киров, 2007), Всероссийском совещании (Епифановские чтения): «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Киров, 2008), объединенном заседании Кировского филиала общества физиологов им. И.П. Павлова и Кировского областного научного общества гематологов и трансфузиологов (Киров, 2008), Ученом совете Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар, 2008), а также на IX Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (С.-Петербург, 2006), «VI Сибирском физиологическом съезде» (Барнаул, 2008).
Личное участие автора в получении результатов. Автором самостоятельно выполнена работа по изучению жизнеспособности, морфологического состава лейкоцитов, фагоцитарной и метаболической активности нейтрофилов, а также работа по определению скорости образования малонового диальдегида в мембранах лимфоцитов. Проведена статистическая обработка результатов исследования. Автор принимал участие в разработке хладоограждающего раствора, проведении его биологических испытаний и в написании статей.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 2 в журналах, рекомендованных ВАК; получен патент РФ №2311027 от 27 ноября 2007 г.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 99 машинописных страницах, состоит из «Введения», четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты
экспериментальных исследований, обсуждение результатов
экспериментальных исследований), «Выводов», «Практических
рекомендаций», «Списка использованной литературы» (173 источника, в т.ч. 64 иностранных), «Списка работ, опубликованных по теме диссертации». Диссертация содержит 24 таблицы, 9 рисунков.
Считаю своим долгом выразить глубокую благодарность за помощь в выполнении диссертационной работы: научному руководителю доктору медицинских наук профессору Евгению Павловичу Сведенцову, сотрудникам лаборатории криофизиологии крови Коми НЦ УрО РАН: к.б.н. Т.В. Тумановой, к.б.н. О.О. Зайцевой, к.б.н. О.Н. Соломиной, Г.А. Никулиной, сотрудникам ФГУ КНИИГ и ПК: к.м.н. СВ. Утемову, Н.Л. Ежовой, Ф.С. Шерстневу, к.м.н. Н.В. Рябову, к.б.н. Т.А. Коряковцевой, работникам библиотеки Л.Н. Устюжаниновой и В.Н. Нечаевой, работникам вивария.
