Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 12
2.1 Классификация острой почечной недостаточности (ОПН) 12
2.1.1 Постренальная ОПН 12
2.1.2 Преренальная ОПН 12
2.1.3 Ренальная ОПН 13
2.2 Экспериментальные модели ОПН 15
2.3 Патофизиология ишемической ОПН 21
2.3.1 Патология сосудистого русла 21
2.3.2 Патология канальцев нефрона 23
2.3.3 Воспаление 25
2.3.4 Нарушения цитоскелета 30
2.3.5 Изменения внутриклеточной концентрации кальция 31
2.4 Патофизиология аминогликозидной нефротоксичности 32
2.4.1 Патология канальцев нефрона 33
2.4.2 Патология гломерулярного аппарата 36
2.4.3 Патология сосудистого русла 37
2.4.4 Воспаление 39
2.5 Роль митохондрии в патогенезе ОПН 41
2.5.1 Свидетельства митохондриальной дисфункции при ОПН 41
2.5.2 Окислительный стресс 42
2.5.3 Нитрозильный стресс 46
2.5.4 Апоптоз и неспецифическая проницаемость митохондрии 48
2.6 Митохондрия как мишень новых терапевтических подходов к лечению ОПН 53
2.6.1 Гипотермия 53
2.6.2 Ишемическое прекондиционирование 54
2.6.3 Эритропоэтин и фармакологическое прекондиционирование 56
2.6.4 Митохондриально-направленные антиоксиданты 58
3. Материалы и методы 61
3.1 Используемые реактивы: 61
3.2 Моделирование ишемии/реперфузии почки 61
3.4 Изучение кровотока при помощи высокочастотной допплеровской техники 62
3.5 Моделирование аминогликоизидной токсичности 64
3.6 Изучение глубины гипотермии 64
3.7 Определение продукции активных форм кислорода 65
3.8 Определение малонового диальдегида (МДА) в ткани почки 66
3.9 Определение концентрации белка 67
3.10 Гистологические исследования 67
3.11 Иммуноблотинг 68
3.12 Иммуногистохимическое окрашивание срезов почки 70
3.13 Определение суммарного карбонилирования белков.. 70
3.14 Статистическая обработка результатов 71
4. Результаты 72
4.1 Влияние SkQR1 на ОПН 72
4.1.1 Влияние SkQR1 и гипотермии на 90-мин ишемию почки 72
4.1.2 Влияние SkQR1 на 40-мин ишемию почки 78
4.1.3 Влияние SkQR1 на гентамициновую токсичность 83
4.2 Влияние ишемического прекондиционирования на ОПН 87
4.2.1 SkQR1 активирует сигнальные пути ишемического прекондиционирования 87
4.2.2 Нефропротекторное действие ишемического прекондиционирования при 40-мин ишемии почки 91
4.2.3 Нефропротекторное действие фармакологического прекондиционирования при гентамициновой токсичности 97
4.3 Влияние разобщения дыхания и окислительного фосфорилирования на ишемию/реперфузию почки 103
4.4 Изменения почечного кровообращения при ишемии/реперфузии почки 110
5. Обсуждение 119
5.1 Антиоксидантное действие SkQR1 119
5.2 Нефропротекторный эффект гипотермии 122
5.3 Нефропротекторный эффект активации сигнальных путей ишемического прекондиционирования 123
5.4 Нефропротекторный эффект разобщения дыхания и окислительного фосфорилирования 127
5.5 Механизмы нефропротекции при аминогликозидной токсичности 130
5.6 Патология почечного кровообращения 132
6. Выводы 137
7. Список литературы
- Экспериментальные модели ОПН
- Апоптоз и неспецифическая проницаемость митохондрии
- Моделирование аминогликоизидной токсичности
- Изменения почечного кровообращения при ишемии/реперфузии почки
Экспериментальные модели ОПН
Постренальная ОПН возникает в случае обструкции мочевыводящих
путей, как лежащих внутри почки, так и внепочечных отделов урогенитального тракта. Причиной обструкции могут явиться камни, опухоли, стриктуры, расстройства тонуса. Увеличенное сопротивление току мочи приводит к увеличению давления в собирательной системе почки, которое затем распространяется выше: происходит рост давления в канальцах нефрона. В конечном итоге, обструкция мочевыводящих путей увеличивает давление в капсуле Боумена, что препятствует фильтрации плазмы и низкомолекулярных веществ и таким образом снижает СКФ.
ОПН (или преренальной азотемии) говорят в том случае, когда уменьшение СКФ не связано с повреждением канальцев, клубочков или микрососудистого русла почки, при этом не изменена проходимость мочевыводящих путей. Таким образом, СКФ уменьшается из-за падения давления в капиллярах клубочка. Это происходит при гиповолемии. Причиной этого падения может быть как истинная гиповолемия, развивающаяся в результате длительной диареи, рвоты, применения диуретиков, кровопотери, так и ложная гиповолемия. Последняя возникает при системной вазодилатации (сепсис, анестетики) или при снижении сердечного выброса. Констрикция сосудов почки (рефлекторная – при операции на аорте и желчных путях; применение иммуносупрессоров циклоспорина и такролимуса) также может приводить к преренальной азотемии.
Благодаря нескольким механизмам ауторегуляции почечного кровотока, почка способна поддерживать СКФ на необходимом для нормальной фильтрации уровне при изменении системного АД в широких пределах (от 70-80 мм рт.ст. до 170 мм рт.ст.). Поэтому преренальная ОПН зачастую наблюдается на фоне приёма лекарственных средств, нарушающих работу этих механизмов. К ним относятся ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента (АПФ), антагонисты ангиотензиновых рецепторов, нестероидные противовоспалительные средства (НПВС). Другим предрасполагающим фактором является атеросклероз. Поэтому часто преренальная азотемия развивается у пожилых людей.
Преренальная ОПН разрешается при удалении провоцирующего её фактора. Затянувшаяся преренальная ОПН, как правило, переходит в ренальную форму (Ярмагомедов А.А., 2005; Thadhani R. et al., 1996; Lameire N., 2005).
Падение СКФ в случае ренальной азотемии обусловлено повреждением ткани почки. В связи с этим, в последнее время в научной литературе всё чаще используется термин «острое повреждение почки» («acute renal injury») (Malyszko J., 2010).
Около 85% случаев ренальной ОПН связано с повреждением канальцев и называется острым канальцевым некрозом (ОКН), тогда как 15% случаев ренальной ОПН обусловлено острым интерстициальным нефритом или острым гломерулонефритом (Ярмагомедов А.А., 2005; Thadhani R. et al., 1996).
Термин ОКН происходит от гистопатологической картины ренальной ОПН. При ОКН наблюдаются значительные патологические изменения в корковом слое и наружной зоне мозгового вещества. Внутренне мозговое вещество, как правило, не подвержено патологическим изменениям. Собственно выраженный некроз канальцев наблюдается сравнительно редко. Чаще наблюдается гибель отдельных клеток, как в результате некроза, так и по механизму апоптоза (Bonventre J.V., 1993). К перманентным признакам ренальной ОПН относится потеря щёточкой каёмки, вакуолизация эпителия канальцев, их дилатация. Эпителий становится плоским, базальная мембрана истончается. Эти изменения наблюдаются в проксимальном отделе нефрона. При этом показано, что чувствительность к повреждению разных сегментов проксимального канальца сильно варьирует и зависит от этиологического фактора, вызвавшего ОКН. Например, при ишемии почки больше всех страдает S3-сегмент. Дистальные сегменты нефрона не подвержены таким тяжёлым изменениям, однако, при гистологическом исследовании в их просвете часто обнаруживают цилиндры, образованные дебрисом, а также живыми и мёртвыми клетками, слущенными в просвет канальца. В наружной зоне мозгового вещества часто наблюдается застой крови и гиперемия, в коре и мозговом веществе почки обнаруживают лейкоцитарную инфильтрацию (Schrier R.W et al., 2004; Lameire N., 2005; Shimizu A. et al., 1994; Шейман Дж.А., 1999).
Причиной канальцевого некроза может стать использование нефротоксических препаратов, ишемический инсульт почки или резкое увеличение концентрации гемоглобина или миоглобина в крови (соответственно, нефротоксическая, ишемическая и пигментная формы ренальной ОПН).
Ишемия почки, как причина ОКН наблюдается чаще всего – в 55-75% случаев (Lameire N., 2005). Этиология ишемической ОПН, по сути дела, была описана ранее – при обсуждении этиологии преренальной ОПН. Почечная недостаточность возникает при нарушении перфузии органа, прежде всего, потому, что фильтрация в капиллярах клубочка происходит под действием давления крови. Однако, если ишемия была длительной, то после восстановления кровотока СКФ не нормализуется. Это связано с тем, что ишемия и реперфузия запускают ряд событий, приводящих к серьезной дисфункции канальцевого аппарата почки и микрососудистого русла органа. Эти процессы будут подробно обсуждаться далее. Реципиенты почечных трансплантатов составляют ещё одну большую популяцию людей, сталкивающихся с ишемической ОПН. Ишемический инсульт почки наблюдается при тромбозе и тромбоэмболии почечной артерии.
Часто ОКН оказывается результатом действия нескольких факторов. Например, при сепсисе, приводящем к мощной системной вазодилатации, и как следствие к ишемии органа, препаратом выбора зачастую становятся аминогликозидные антибиотики, проявляющие мощное нефротоксическое действие. Последние эпидемиологические исследования показывают, что ОКН в большинстве случаев развивается на фоне предсуществующей хронической почечной недостаточности или заболеваниях, нарушающих кровоснабжение почки (атеросклероз, гипертоническая болезнь, сахарный диабет, сердечная недостаточность) (Schrier R.W et al., 2004; Ярмагомедов А.А., 2005; Thadhani R. et al., 1996; Lameire N., 2005).
Апоптоз и неспецифическая проницаемость митохондрии
В большинстве случаев ренальной ОПН, заболевание развивается на фоне выраженной гипоперфузии почки, поэтому большинство моделей направлено на воспроизведение именно этого состояния. Наиболее широкое распространение получила модель временной окклюзии почечной артерии (Badenoch A.W. and Darmady E.M., 1947). В качестве экспериментальных животных, как правило, используют крыс, реже мышей, в некоторых случаях кроликов или собак. Животных вводят в состояние наркоза, доступ к почке осуществляют посредством лапаротомии, окклюзию почечной артерии – или выделенной из сосудистого пучка, или вместе с почечной веной – производят путём наложения лигатуры или атравматического микрососудистого зажима. Для получения классической картины ОПН время ишемии варьируют от 40 до 60 мин (в случае крыс). В некоторых случаях, в зависимости от цели исследования, время ишемии могут увеличивать (для получения более сильного повреждения) или наоборот уменьшать (для изучения повреждения органа, не приводящего к развитию ОПН или для изучения феномена ишемического прекондиционирования). После окончания времени ишемии проходимость артерии восстанавливают. Окклюзии могут подвергать как обе почки (билатеральная ишемия/реперфузия), так и одну (унилатеральная ишемия/реперфузия). В последнем случае операция сопровождается контралатеральной нефрэктомией.
Уже через час реперфузии значительно изменяются физиологические показатели, как-то СКФ и фракционная экскреция натрия (Ogawa T. et al., 2001). На первые сутки после операции наблюдают ярко выраженную почечную недостаточность, о которой судят по увеличению концентрации мочевины и креатинина в крови животного (Wilson D.R. et al., 1984). Максимума эти изменения достигают на вторые или третьи сутки эксперимента, после чего функционирование почки начинает восстанавливаться, почти полностью возвращаясь к норме в течение 7 дней после операции (Noiri E. et al., 1994; Kramer A.A. et al., 1999). Ряд авторов отмечает наличие смертности в данной модели, однако, её выраженность значительно отличается в разных работах (Nemoto T., Burne M.J., et al. 2001; Nemoto T., Yokota N., et al., 2001).
Характер повреждения почки при окклюзии почечной артерии у животных обнаруживает целый ряд сходств с теми патологическими изменениями, которые наблюдают при ренальной ОПН у людей. Они включают в себя потерю щёточной каёмки проксимальных канальцев, большую чувствительность к повреждению проксимальных отделов нефрона, нежели дистальных, образование гиалиновых цилиндров в просвете нефрона, многократное падение СКФ, наличие ремиссии. В то же время у экспериментальной модели и реальной ОПН наблюдаются и различия. Так, степень некроза почечного эпителия у животных, подвергшихся ишемии/реперфузии гораздо выше, чем у людей с ОКН; при этом некрозу у животных подвержены только проксимальные канальцы. Обоснованные опасения по поводу адекватности таких моделей вызывает тот факт, что в клинической практике крайне редко наблюдается полная ишемия почки. К тому же есть основания предполагать, что гемодинамический ответ на ишемию/реперфузию почки может быть принципиально различным у грызунов, собак и человека в силу различий в морфологии органа у разных видов. Однако, несмотря на эти недостатки, модель временной окклюзии почечной артерии в настоящее время является основной в исследовании ОПН (Lieberthal W., Nigam S.K., 2000; Rosen S., Heyman S.N., 2001).
Менее распространённым методом моделирования ишемической ОПН является внутрипочечное введение норадреналина. Данную манипуляцию производят на собаках, реже на крысах. В бедренную артерию наркотизированного животного вводится ангиографический зонд. Затем зонд аккуратно вводят в почечную артерию и располагают так, чтобы избежать её окклюзии. Струйное введение норадреналина в дозе 0,75 мкг/кг/мин длится 40 мин, после чего зонд выводят из сосуда. Ряд исследователей производят предварительную контралатеральную нефрэктомию. Изменение физиологических параметров наблюдают через разные временные отрезки – от часа до нескольких суток. Динамика и характер почечной недостаточности, наблюдаемой при внутрипочечном введении норадреналина совпадают с изменениями, возникающими вследствие непосредственной окклюзии почечной артерии (Cronin R.E. et al., 1978; Burke T.J. et al., 1984).
Второй наиболее распространённой экспериментальной моделью ОПН является рабдомиолиз, вызываемый в/м инъекцией глицерина (Oken D.E. et al., 1966). Данная модель воспроизводит пигментную ОПН, развивающуюся вследствие массивного разрушения поперечно-полосатой мускулатуры и последующей миоглобинурии. Для индукции рабдомиолиза используют крыс или кроликов. Животных лишают воды на 24 часа, после чего производят в/м инъекцию 50% водного раствора глицерина в дозе 8-10 мл/кг веса животного. Дозу делят поровну между двумя задними лапами. Функциональные параметры почки оценивают на первые или вторые сутки после инъекции. На этих сроках у животных развивается ярко выраженная почечная недостаточность, с многократным увеличением концентрации маркёров повреждения органа, включая, KIM-1 и NGAL (Korrapati M.C. et al., 2012). Важным преимуществом данного протокола перед другими моделями ОПН является максимальное соответствие клинической практике повреждающего воздействия, а также его комплексное воздействие на организм животного в целом. Однако, не понятно, насколько данные полученные в таких экспериментах могут быть экстраполированы на ОПН ишемического или нефротоксического генеза.
Ещё одним экспериментальным подходом, приближенным к многофакторной этиологии заболевания, является изучение ОПН, возникающей на фоне экспериментального сепсиса у животных. На данный момент существует две общепринятые модели сепсиса: введение эндотоксина и перевязка слепой кишки с её последующей перфорацией. В первом случае грызунам в/б или в/в вводят липополисахарид (ЛПС) – компонент бактериальной стенки грамотрицательных микроорганизмов. Стандартной дозой является 5-15 мг/кг ЛПС. В течение нескольких часов после инъекции у животных развивается выраженная артериальная гипотония (Elmore S.P. et al., 1992; Hoque A.M. et al., 1996), резко возрастает продукция провоспалительных цитокинов. Уже через 6 часов наблюдают признаки почечной недостаточности, достигающей пика к первым стукам после инъекции (Cunningham P.N. et al., 2004; Knotek M. et al., 2001). Для данной модели характерна высокая смертность (Takahashi K. et al., 2012). В случае второй модели, под наркозом вскрывают брюшную полость и накладывают лигатуру на слепую кишку дистальнее илеоцекального клапана. После этого слепая кишка перфорируется хирургической иглой. Количество перфораций и длину лигируемого сегмента кишечника варьируют, что даёт возможность воспроизводить патологический процесс различной тяжести. В результате операции содержимое кишечника выходит в брюшную полость, что приводит к развитию полимикробной бактериемии и сепсиса. Нарастает системное воспаление, резко падает артериальное давление, при этом наблюдают полиорганную недостаточность. Через 12 часов после операции увеличивается концентрация креатинина в крови животных и признаки почечной недостаточности сохраняются в течение 48 часов (Yang Q.H. et al., 2009). В тоже время, целому ряду авторов не удалось получить ОПН при перевязке и перфорации слепой кишки, что говорит о недостаточной воспроизводимости ОПН в данной модели (Pedersen P.V. et al., 1989).
Моделирование аминогликоизидной токсичности
Эксперименты in vitro показали, что провоспалительные цитокины (ИЛ-1, ФНО и ИФН) приводят к нарушению актинового цитоскелета, потере полярности распределения интегринов и Е-кадгерина и слущиванию клеток (значение этих изменений для патофизиологии ОПН будет рассмотрено в следующем разделе) (Glynnel P.A. et al., 2001).
Провоспалительные цитокины и хемокины привлекают в почку лейкоциты и активируют их. Инфильтрация нейтрофилов и моноцитов/макрофагов наблюдается уже в первые часы после ишемии/реперфузии (Miyazawa S. et al., 2002; Ysebaert D.K. et al., 2000). Эти клетки генерируют АФК, протеазы, эластазу, миелопероксидазу, лейкотриены и другие ферменты и биологически активные вещества, повреждающие ткань и способные вызывать вазоконстрикцию (Ярилин А.А., 1999). Однако, до сих пор нет чётких данных, определяющих роль этих клеток в патофизиологии ишемической ОПН (Friedewald J.J. and Rabb H., 2004). Различные подходы, направленные на предотвращение адгезии нейтрофилов (мыши, дефицитные по ICAM-1, лиганды селектинов, ингибирование СD11/CD18 взаимодействия) демонстрируют свою эффективность в предотвращении ОПН и снижают инфильтрацию (Kelly K.J. et al., 1996; Nemoto T. et al., 2001; Rabb H. et al., 1994). Уменьшение выраженности нейтрофильной инфильтрации часто наблюдается при защите почки при ишемии/реперфузии (Chiao H. et al., 1997; Donnahoo K.K. et al., 1999), однако, экспериментальная нейтропения не оказывает благотворного эффекта (Paller M.S., 1989). Удаление же моноцитов/макрофагов из периферической крови наоборот предотвращало развитие ОПН и повреждение почки. Введение животным моноцитов/макрофагов восстанавливало почечную недостаточность, использование же антагонистов А2А аденозиновых рецепторов (экспрессируемых на макрофагах) снова нивелировало её (Day Y.J. et al., 2005).
В последнее время растёт количество данных, свидетельствующих об участии лимфоцитов в патогенезе ишемической ОПН (Linfert D. et al., 2009). Среди цитокинов, продуцируемых после ишемии/реперфузии, есть цитокины привлекающие и активирующие Т-клетки, а ICAM-1, селектины и СD11/CD18 участвуют и в адгезии лимфоцитов (Friedewald J.J. and Rabb H., 2004). Мыши дефицитные по CD4/CD8-положительным лимфоцитам были защищены от ишемической ОПН (Rabb H. et al., 2000). В последующем исследовании авторы проверили, какая из популяций Т-лимфоцитов ответственна за развитие ОПН и обнаружили, что животные, лишённые CD8-клеток не были защищены от ишемии/реперфузии, тогда как отсутствие CD4-лимфоцитов предотвращало повреждение почки. Адаптивный перенос CD4-лимфоцитов восстанавливал повреждение, однако, этого не происходило, если клетки переносили от мышей нокаутных по ИФН или CD28 (Burneaney M.J. et al., 2001). Основными лигандами CD28 являются молекулы В7-1 и В7-2, и это взаимодействие необходимо для активации лимфоцитов. Антитела, предотвращающие CD28–В7 костимуляцию, обладали выраженным нефропротекторным действием, при этом было обнаружено, что именно блокирование В7-1, а не В7-2, защищает от ишемической ОПН (De Greef K.E. et al., 2001). В этой же работе было показано, что ишемия/реперфузия in vivo индуцирует экспрессию В7-1 на эндотелии vasa recta в наружном мозговом веществе. Через два часа реперфузии в микрососудистом русле этого участка почки наблюдали накопление лейкоцитов, в то время как использование анти-В7-1 антител предотвращало появление этого феномена.
Эти данные хорошо согласуются с классическими работами по описанию морфологии ОКН у человека, описывающими мононуклеарные лейкоциты в vasa recta (Solez K. et al., 1979). Также они могут объяснять, каким образом Т-лимфоциты участвуют в повреждении почки, в то время как большинство исследователей обнаруживают лимфоцитарную инфильтрацию не ранее, чем через сутки после ишемии/реперфузии (Ysebaert D.K. et al., 2000; Ysebaert D.K. et al., 2004), т.е. уже после того, как развилась тяжёлая почечная недостаточность. Можно предполагать, что адгезия лимфоцитов, обусловленная CD28–В7-1 взаимодействием, приводит к резкому замедлению кровотока в капиллярах vasa recta, что приводит к драматическому снижению почечного кровотока в наружном мозговом слое почке (Olof P. et al., 1991) и длительной гипоксии S3-сегмента нефрона. Эта гипотеза косвенно подтверждается другой работой, где мыши, нокаутные по гену, активирующему рекомбинацию-1 (RAG-1), не были защищены от ишемии/реперфузии почки (Park P. et al., 2002). Ген кодирует лимфоцит-специфическую рекомбиназу, и животные нокаутные по этому гену не имеют ни зрелых Т-лимфоцитов, ни зрелых В-лимфоцитов (в то время как ишемическое повреждение почки предотвращается не только отсутствием Т-клеток, но и В-лимфоцитопенией (Burneaney M.J. et al., 2003)). Однако, в данной модели наблюдается повышенное количество NK-клеток, также несущих на поверхности CD28 антиген.
Дальнейшие исследования роли CD4-лимфоцитов в патогенезе ишемической ОПН показали, что блокирование дифференцировки по пути Тh1 приводит лишь к незначительному улучшению функции почки, в то время как блокирование Тh2-пути значительно усиливало повреждение (Yokota N. et al., 2003). Это может быть связано с продукцией Тh2 противовоспалительных цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-10. И действительно, ИЛ-4 дефицитные мыши имели такую же степень повреждения почки после ишемии/реперфузии, как и STAT6(– /–) животные (ингибирование дифференцировки по пути Тh2) (Yokota N. et al., 2003). Интересно отметить, что мыши, дефицитные по Т-клеточному рецептору, также устойчивы к ишемическому повреждению почки (Savransky V. et al., 2006; Hochegger K. et al., 2007).
Наконец, ишемия/реперфузия почки in vivo приводит к активации системы комплемента по альтернативному пути. Иммуногистохимическое окрашивание канальцевого эпителия выявляет потерю полярности распределения ингибитора альтернативного пути активации Crry (белок становится диффузно распределённым в цитоплазме клетки вместо строгой локализации на базальной мембране) через два часа после начала реперфузии и фиксацию С3-компонента (первый шаг альтернативного пути активации) на базальной поверхности эпителия проксимальных канальцев через 6 часов после ишемии/реперфузии (Thurman J.M., Ljubanovic D. et al., 2006). Эксперименты in vitro показали, что при гипоксии клеток проксимальных канальцев система комплемента резко увеличивает лизис клеток, а антитела к фактору В (одному из необходимых компонентов альтернативного пути активации комплемента) нивелирует этот эффект. В опытах in vivo такие антитела уменьшали повреждение почки и предотвращали развитие апоптоза (Thurman J.M., Royer P.A. et al., 2006). В ряде работ было показано, что различные подходы, предотвращающие активацию комплемента, защищают животных от ишемической ОПН, а недостаток ингибиторов альтернативного пути активации комплемента увеличивает тяжесть почечной недостаточности (Thurman J.M., Ljubanovic D. et al., 2006; Zheng X. et al., 2006; Arumugam T.V. et al., 2003; Yamada K. et al., 2004; Rabb Н., 2009). Становится ясным, что антивоспалительная стратегия может оказаться эффективной в разработке терапевтических подходов для лечения ОПН.
Изменения почечного кровообращения при ишемии/реперфузии почки
Далее мы поставили ряд экспериментов для того, чтобы выяснить, насколько важную роль играет активация сигнальных путей ИПК в нефропротекторном действии SkQR1. Первоначально активация сигнальных путей ишемической толерантности была описана как результат ишемической тренировки (прекондиционирования) органа. Поэтому мы изучили влияние самого ИПК на ишемию/реперфузию почки. Непосредственно перед 40-мин ишемией мы подвергали почку коротким (15 сек) эпизодам ишемии и реперфузии. Сосудистый пучок пережимали на 15 сек, после чего на 15 сек кровоток восстанавливали, и такой цикл повторяли 4 раза. Такая схема ИПК оказывала мощное нефропротекторное действие. Через 48 ч после ишемии/реперфузии мы наблюдали 4-х кратное снижение концентрации креатинина и мочевины, по сравнению с животными, подвергнутыми только ишемии/реперфузии. Концентрация маркёров почечной недостаточности падала почти до тех же значений, что и у ложнооперированных животных, что говорит, о сохранении функции почки (рис. 18).
Известно, что защитный эффект ИПК при ишемии сердца и мозга исчезает при старении. Мы исследовали влияние старения на последствия И/Р почки и ИПК. Мы поставили эксперименты на крысах возрастом 20 мес. Прежде всего, мы сравнили тяжесть почечной недостаточности, развивающейся в результате 40-мин ишемии у молодых и старых крыс. Через 48 ч после операции мы не обнаружили статистически значимых различий между обеими возрастными группами по концентрации маркёров почечной недостаточности, что о говорит о том, что старение не приводит к более выраженному нарушению функции органа (рис. 19А,Б).
После этого мы подвергли старых крыс ИПК. На вторые сутки после 40-мин ишемии концентрация креатинина была такой же, как и у 20-мес крыс перенесших только ишемию/реперфузию, а концентрация мочевины даже несколько выше. Таким образом ИПК у старых не приводило к улучшению функции органа, а значит старение уменьшает ишемическую толерантность не только сердца и мозга, но и почки (рис. 19А,Б).
Рис. 18. Ишемическое прекондиционирование предотвращает развитие почечной недостаточности после 40-мин ишемии. Животных подвергали 40-мин ишемии почки. Температуру животных в течение наркоза поддерживали на уровне 37оС. Степень почечной недостаточности оценивали по концентрации креатинина (А) и мочевины (Б) в крови через 48 ч после ишемии. Ишемическое прекондиционирование осуществляли путём пережатия почечной артерии на 15 сек с последующей 15 сек реперфузией. Цикл повторяли 4 раза. «ЛО» n=5; «И/Р» n=13; «И/Р+ИПК» n=4. ЛО - ложнооперированные животные; И/Р - ишемия/реперфузия; ИПК - ишемическое прекондиционирование; - р 0,001.
В этих экспериментах мы так же оценивали выраженность окислительного стресса по концентрации МДА в гомогенатах почечной ткани через 48 ч после ишемии. У старых животных уровень МДА был выше, чем у молодых, но это увеличение было статистически недостоверным. ИПК почки перед длительной 40-мин ишемией не приводило к падению концентрации МДА у 20-мес животных по сравнению с животными, которые перенесли только ишемию/реперфузию (рис. 19В).
Другим способом активировать сигнальные пути ИПК является использование фармакологических агонистов данных сигнальных путей. Из литературных данных известно, что активация -опиоидных рецепторов приводит к фосфорилированию GSK-3р. В нашем исследовании мы использовали гексапептид даларгин, являющийся аналогом лейцин-энкефалина. Мы вводили данное вещество по той же схеме, что и SkQR1: в/б за 3 ч до начала ишемии через 1, 18, 30, 42 ч после начала реперфузии. Если доза каждой инъекции составляла 50 мкг/кг, то использование даларгина не улучшало функцию почки: концентрация креатинина и мочевины на 2-е сут после операции не отличались от аналогичного показателя у крыс, не получавших препарат. При уменьшении дозы до 10 мкг/кг для каждой инъекции, мы наблюдали уменьшение концентрации маркёров почечной недостаточности, которое, однако, не было статистически достоверным. Достоверный защитный эффект появлялся при уменьшении дозы каждой инъекции до 2 мкг/кг (рис. 20).
Защитный эффект ишемического прекондиционирования на функцию почки исчезает с возрастом. Молодых (3-4 мес) и старых (20 мес) животных подвергали 40-мин ишемии почки. Температуру животных в течение наркоза поддерживали на уровне 37оС. Степень почечной недостаточности оценивали по концентрации креатинина (А) и мочевины (Б) в крови через 48 ч после ишемии. Через 48 ч реперфузии измеряли концентрацию МДА в гомогенатах почечной ткани (В). ИПК осуществляли путём пережатия почечной артерии на 15 сек с последующей 15 сек реперфузией. Цикл повторяли 4 раза. «ЛО» n=5; «И/Р (3-4 мес)» n=17 «И/Р (20 мес)» n=2; «И/Р(20 мес)+ИПК» n=3. ЛО - ложнооперированные животные; И/Р - ишемия/реперфузия; ИПК -ишемическое прекондиционирование; - р 0,001; н/д - нет достоверных отличий. А
Агонист -опиоидных рецепторов даларгин предотвращает развитие почечной недостаточности после 40-мин ишемии. Животных подвергали 40-мин ишемии почки. Температуру животных в течение наркоза поддерживали на уровне 37оС. Степень почечной недостаточности оценивали по концентрации креатинина (А) и мочевины (Б) в крови через 48 ч после ишемии. Даларгин вводили в/б за 3 ч до начала ишемии через 1, 18, 30, 42 ч после начала реперфузии, доза каждой инъекции составляла 2, 10 или 50 мкг/кг. «ЛО» n=5; «И/Р» n=6; «И/Р+даларгин 50 мкг/кг» n=4; «И/Р+даларгин 10 мкг/кг» n=5; «И/Р+даларгин 2 мкг/кг» n=6. ЛО – ложнооперированные животные; И/Р – ишемия/реперфузия; - р 0,001; - р 0,1 н/д – нет достоверных отличий.
Таким образом, было показано, что активация сигнальных путей ИПК имеет мощный нефропротекторный потенциал при ишемической ОПН. Для того, чтобы прояснить насколько важную роль активация путей ИПК играет в защитном действии, которое SkQR1 оказывает на функцию почки при ишемии/реперфузии, мы провели ряд экспериментов. Ранее нами было показано, что гентамициновая токсичность приводит к двукратному падению уровня эритропоэтина в почке. Так как мы предполагаем, что активация сигнальных путей ИПК под действием SkQR1 происходит через увеличение продукции эритропоэтина, то мы подвергли крыс ишемии/реперфузии через сутки после 6-дневного курса введения гентамицина (160 мг/кг/сут). Мы обнаружили, что при такой схеме эксперимента SkQR1 потерял своё защитное действие. На 2-е сут после ишемии концентрация креатинина и мочевины не различалась между животными, получавшими и не получавшими SkQR1 (рис. 21А,Б). А
