Введение к работе
Актуальность темы. Изучение действия ксенобиотиков на иммунный гомеостаз и возможности коррекции его нарушений при помощи перспективных иммуностимуляторов является одной из наиболее актуальных проблем физиологии, токсикологии и иммунологии. Это определяется использованием в Вооруженных Силах Российской Федерации (ВС РФ) разнообразных токсичных химических веществ, в частности, ядовитых технических жидкостей, загрязнением окружающей среды различными соединениями, ростом интоксикаций различными соединениями, вызывающими связанные с вторичными иммунодефицитными состояниями различные инфекционные заболевания [Золотухин А.Н. и соавт., 1982; Александров В.Н., Емельянов В.И., 1990; Бадюгин И.С. и соавт., 1991; Хаитов Р.М. и соавт., 1995; Loose L.D., 1985; Miller K., 1985; Luster M.J. et al., 1987; Sullivan J.B., 1989].
Особую актуальность эта проблема приобрела в связи с тем, что в последнее десятилетие частота острых интоксикаций различными химическими соединениями и, в частности, спиртами существенно увеличилась [Алиев Н.А., 1991; Алиев Н.А., Мустафаев М.А., 1992; Лукомская М.И., 1992; Немцов А.В., 1995]. Зарегистрированное в 2000-2005 годах увеличение частоты острых отравлений алкоголем и ядовитыми спиртами в Российской Федерации, в частности, метанолом, по сравнению с предыдущими пятью годами, имеет тенденцию к дальнейшему увеличению [Нужный В.П. и соавт., 2004].
Метанол (метиловый спирт, карбинол, древесный спирт) применяется в качестве топлива для двигателей, в лабораторной практике, как растворитель в химическом производстве, для денатурирования этилового спирта, входит в состав ряда антифризов. Отравления чаще всего связаны с ошибочным использованием его вместо этилового спирта с целью опьянения. Существуют основания рассматривать метанол в качестве суррогата алкоголя [Лужников Л.А., Костомарова Л.Г., 2000; Нужный В.П. и соавт., 2004].
Отравления метанолом по числу летальных исходов занимают одно из первых мест среди интоксикаций другими спиртами [Кожемякин Л.А. и соавт., 1991; Нужный В.П., Прихожан Л.М., 1996; Нужный В.П., 2001; 2005]. Это связано с постоянно увеличивающимся потреблением этилового спирта [Алиев Н.А., 1991, 1992; Нужный В.П., Прихожан Л.М., 1996], которое может сопровождаться в случаях использования вместо него с целью опьянения метанола групповыми и даже массовыми острыми отравлениями.
Одной из причин высокой смертности после острого отравления метанолом [Кожемякин Л.А. и соавт., 1991] могут являться инфекционные осложнения и заболевания, связанные с формированием вторичного иммунодефицита. При этом влияние метанола на систему иммунитета нуждается в дальнейшем изучении [Забродский П.Ф., 1998; Маркизова Н.Ф. и соавт., 2004; Descotes J., 1986; Luster M.I. et al., 1987; Jeya Parthasarathy N. et al., 2005].
Данные о влиянии метанола на гуморальные и клеточные иммунные реакции имеют как теоретическое, раскрывая неизвестные механизмы регуляции иммуногенеза, так и практическое значение, позволяя осуществлять целенаправленную фармакологическую коррекцию нарушений иммунного гомеостаза с целью снижения различных инфекционных осложнений [Хаитов Р.М. и соавт., 1995; Забродский П.Ф., 1998; Descotes J., 1986; Luster M.I. et al., 1987; Georgiev V.S., Yamaguuchi H., 1993].
Таким образом, учитывая достаточно широкое распространение и использование в промышленности, технике и быту метанола, высокую летальность при отравлении им, недостаточно изученные особенности его действия на физиологические механизмы регуляции системы иммунитета, следует заключить, что проблема изучения нарушения иммунного гомеостаза при остром отравлении метанолом, обоснование фармакологической коррекции его нарушений в постинтоксикационный период важна как в теоретическом, так и в практическом отношении.
Цель работы
Изучение характера изменений механизмов регуляции иммуногенеза при остром отравлении метанолом и разработка патогенетически обоснованных направлений медикаментозной коррекции выявленных нарушений.
Для достижения указанной цели сформулированы следующие задачи исследования:
1. Изучить влияние острой интоксикации метанолом на содержание лимфоцитов в органах системы иммунитета и миграцию колониеобразующих единиц из костного мозга в селезенку.
2. Исследовать особенности влияния острой интоксикации метанолом на гуморальный иммунный ответ и на кооперацию Т- и В-лимфоцитов, определяющую тимусзависимое антителообразование.
3. Определить характер изменения клеточных иммунных реакций и функции естественных клеток-киллеров (ЕКК) после действия метанола.
4. Оценить роль функции коры надпочечников, активности эстераз Т-лимфоцитов, перекисного окисления липидов в нарушении иммунного статуса под влиянием метанола.
5. Оценить влияние антидотов метанола, ингибиторов и индукторов
Р-450-зависимых монооксигеназ на реализацию его иммунотоксических эффектов и обосновать коррекцию иммунодефицитного состояния после острой интоксикации метанолом.
Научная новизна исследования
Экспериментально проведена характеристика иммунотоксических эффектов метанола и обосновано применение перспективных средств медикаментозной коррекции нарушений показателей системы иммунитета. Изучены особенности нарушения физиологических механизмов иммуногенеза при остром воздействии метанола.
В экспериментах на животных показана дозозависимая редукция миграции КОЕс из костного мозга в селезенку после острой интоксикации метанолом. При остром отравлении метанолом снижается содержание Т-лимфоцитов в тимусе и лимфоцитов в органах системы иммунитета.
Экспериментально показано, что острая интоксикация метанолом в прямой зависимости от дозы снижает гуморальный иммунный ответ более выраженно в продуктивной фазе антителогенеза по сравнению с индуктивной.
Установлено, что метанол в прямой зависимости от концентрации снижает эффект кооперации лимфоцитов, поражая преимущественно В-клетки. Поражающий эффект метаболитов метанола в эквимолярных концентрациях на кооперацию Т- и В-лимфоцитов уменьшался в следующем порядке: муравьиная кислота, формальдегид. Установлено, что действие метанола на исследованный показатель прямо связано с его концентрацией.
В экспериментах на животных выявлено, что острое отравление метанолом снижает функцию Т-клеток, реакцию гиперчувствительности замедленного типа (функцию Тh1-лимфоцитов и макрофагов), характеризующую как первичный, так и вторичный клеточный иммунный ответ. При остром воздействии метанола происходит дозозависимое уменьшение антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) преимущественно в продуктивной фазе иммуногенеза по сравнению с индуктивной фазой. Выявлено выраженное нарастание эффекта супрессии от индуктивной к продуктивной фазе иммунного ответа при остром отравлении метанолом.
Отравление метанолом снижает активность ЕКК в прямой зависимости от дозы. Редуцирующие эффекты метанола на функцию ЕКК in vitro прямо зависят от концентрации. При действии метаболитов метанола установлено снижение их иммунотоксического эффекта в последовательности: муравьиная кислота, формальдегид.
Определена роль кортикостерона, эстераз Т-клеток и перекисного окисления липидов в реализации иммунотропных эффектов метанола. Установлено, что концентрация кортикостерона, соизмеримая с содержанием этого гормона в крови при отравлении метанолом, играет весьма существенную роль в супрессии показателей системы иммунитета. Снижения активности ацетилхолинэстеразы в Т-лимфоцитах тимуса и селезенки, a-нафтил-АS-ацетатэстеразы и a-нафтилбутиратэстеразы в Т-клетках при действии метанола не выявлено.
Впервые доказано, что острое отравление метанолом в дозе 1,0 DL50 вызывает редукцию иммунных реакций, обусловленных активностью Th1-лимфоцитов, в меньшей степени по сравнению с иммунным ответом, связанным с функцией Th2-клеток.
В экспериментальных исследованиях показано, что метанол инициирует ПОЛ, что проявляется снижением активности антиоксидантной системы (редукция каталазы и пероксидазы) и увеличением содержания малонового альдегида в плазме крови.
Впервые проведена оценка влияния на формирование постинтоксикационного иммунодефицитного состояния, вызванного метанолом, средств антидотной терапии при отравлении данным спиртом (этанолом и 4-метилпиразолом), фолината кальция, индукторов и ингибиторов Р-450-зависимых монооксигеназ (фенобарбитала и препарата 2-диэтиламиноэтил-2,2-дифенилпропилацетат-SKF-525A) и иммуностимуляторов миелопида (10 мкг/кг) и полиоксидония (100 мкг/кг). Показано, что этанол и фенобарбитал увеличивают иммунотоксичность метанола, а 4-метилпиразол, препарат SKF-525A, а также иммуностимуляторы снижают ее. Полиоксидоний и миелопид обладают выраженной иммуностимулирующей активностью и практически полностью восстанавливают показатели системы иммунитета при интоксикации метанолом. При интоксикации метанолом в дозе 1,0 DL50 в условиях антидотной терапии отравления этанолом введение фолината кальция в комбинации с миелопидом, фолината кальция в комбинации с полиоксидонием, миелопида в комбинации с полиоксидонием обеспечивает полное восстановление всех исследованных параметров системы иммунитета.
Практическая значимость работы заключается в доказательстве того, что в результате острой интоксикации метанолом формирование иммунодефицитного состояния сопровождается преимущественным поражением В-лимфоцитов метаболитом спирта формиатом, а применение в качестве антидота этанола усиливает иммунотоксичность метанола. Это создает возможность использования наиболее эффективных лекарственных средств (ингибиторов Р-450-зависимых монооксигеназ и фолината кальция), а также иммуностимуляторов. Показано, что при остром отравлении метанолом для восстановления наиболее чувствительных к токсиканту В-лимфоцитов целесообразно использование производных фолиевой кислоты (фолината кальция), ингибиторов Р-450-зависимых монооксигеназ, миелопида и полиоксидония.
Положения, выносимые на защиту
1. При остром отравлении метанолом дозозависимо снижается содержание Т- и В-лимфоцитов в органах системы иммунитета, уменьшаются миграция колониеобразующих единиц из костного мозга в селезенку, Т-зависимое и Т-независимое антителообразование преимущественно в индуктивной фазе антителогенеза по сравнению с продуктивным периодом антителогенеза. При этом в большей степени поражаются Th2-лимфоциты, с функцией которых связан синтез IgG, по сравнению с Th1-клетками, влияющими на продукцию В-лимфоцитами IgM.
2. Острое отравление метанолом дозозависимо уменьшает функцию Т-лимфоцитов, реакцию гиперчувствительности замедленного типа (функцию Th1-клеток и макрофагов), антителозависимую клеточную цитотоксичность и активность естественных клеток-киллеров.
3. Нарушение механизмов регуляции иммунного гомеостаза при действии метанола связано с иммуносупрессивным эффектом кортикостерона вследствие активации гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы, а также инициацией перекисного окисления липидов.
4. Применение 4-метилпиразола (антидота метанола), фолината кальция и иммуностимуляторов миелопида и полиоксидония увеличивает показатели иммунного статуса после отравления метанолом.
Апробация и реализация работы, публикации
Результаты исследований были доложены на межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины» (Иркутск, 2006); на межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием (Саратов, 2006); заседаниях секции прикладных проблем безопасности хранения и уничтожения химического оружия Поволжского отделения АВН (октябрь 2005 г., май 2006 г., январь 2007 г.); совместных научных конференциях кафедр нормальной физиологии ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава»; технологий уничтожения химического оружия и токсичных веществ ГОУ ВПО «Саратовский военный институт радиационной, химической и биологической защиты МО РФ»; военной психофизиологии ГОУ ВПО «Саратовский военно-медицинский институт МО РФ» (декабрь 2005 г., апрель 2006 г., май 2007 г.); научно-практических конференциях ГОУ ВПО «Саратовский военно-медицинский институт РФ МО» (апрель 2006 г., апрель 2007 г.) и внедрены в педагогический процесс кафедр нормальной физиологии ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава»; технологий уничтожения химического оружия и токсичных веществ ГОУ ВПО «Саратовский военный институт радиационной, химической и биологической защиты МО РФ»; токсикологии и медицинской защиты ГОУ ВПО «Саратовский военно-медицинский институт МО РФ».
По теме диссертации опубликовано 14 работ.
Объем и структура работы
Диссертационная работа изложена на 159 страницах машинописного текста, состоит из обзора литературы, материалов и методов исследований, трех глав собственных экспериментальных и клинических исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 43 таблицами; Библиографический указатель включает 266 источников отечественной и зарубежной литературы.
