Содержание к диссертации
Введение
1.Обзор литературы 10
1.1. Зимняя спячка 10
1.1.1. Физиолого-биохимические параметры зимней спячки 11
1.1.2. Характеристика интегративной деятельности мозга зимнеспящих животных 16
1.2. Моноаминергические системы мозга 16
1.2.1. Структурная и биохимическая организация моноаминергических систем мозга 16
1.2.2. Роль моноаминов в регуляции интегративной деятельности мозга животных 22
1.2.3. Роль моноаминергических систем в механизмах гибернации 26
1.3. Моноаминоксидаза 31
1.3.1. Роль МАО в регуляции функционального состояния ЦНС в норме и патологии 37
1.3.2. Моноаминоксидаза и гибернация 40
1.4. Липиды и их роль в формировании и функционировании клеточных мембран 43
1.4.1. Роль липидного состава нейрональных мембран в регуляции процесса гибернации и его связь с активностью мембранных белков и моноаминов 46
1.5. Группа непосредстенно ранних генов и их роль в регуляции интегративной деятельности мозга 49
1.5.1. Индукция экспрессии c-fos гена, вызываемая нейромедиаторами...50
1.5.2. Роль транскрипционного фактора c-fos в механизмах регуляции гибернации 52
Глава 2. Объект и методы исследования 55
2.1. Экспериментальные животные 55
2.2. Экспериментальные установки 55
2.3. Методики изучения исследовательского поведения зимнеспящих животных 57
2.4.Направленные фармакологические вмешательства в активность моноаминергических систем мозга у гибернаторов 57
2.5. Биохимический анализ активности моноаминоксидазы в структурах головного мозга 58
2.6. Метод высокоэффективной тонкослойной хроматографии липидов 60
2.7. Иммуногистохимический метод определения экспрессии c-fos генов 62
2.8. Химические вещества, использованные в работе .65
2.9. Статистическая обработка результатов 65
Глава 3. Результаты исследования 65
3.1.Особенности интегративной деятельности мозга зимнеспящих животных 65
3.1.1. Особенности исследовательского поведения сусликов в открытом поле 65
3.1.2,Особенности исследовательского поведения сусликов в норковой камере 70
3.2.Роль серотонин- и норадренергической систем мозга в регуляции интегративной деятельности мозга сусликов 74
3.2.1. Сезонные особенности влияния предшественников синтеза серотонина и норадреналина на поведение сусликов 74
3.2.2. Характер изменения активности МАО - А мозга сусликов в разные периоды годового цикла 80
3.3. Сезонные особенности изменения липидного состава мембран клеток коры головного мозга сусликов 88
3.4. Экспрессия c-fos генов в структурах головного мозга спящих и пробуждающихся сусликов 96
Обсуждение 102
Заключение 110
Выводы 111
Список литературы 112
- Структурная и биохимическая организация моноаминергических систем мозга
- Роль липидного состава нейрональных мембран в регуляции процесса гибернации и его связь с активностью мембранных белков и моноаминов
- Биохимический анализ активности моноаминоксидазы в структурах головного мозга
- Особенности исследовательского поведения сусликов в открытом поле
Введение к работе
Изучение эндогенных нейрохимических механизмов и факторов, регулирующих интегративную деятельность мозга человека и животных при разных функциональных состояниях ЦНС, является одним из важных направлений современной нейробиологии.
Зимнеспящие животные представляют собой уникальную природную модель для исследования механизмов регуляции этих процессов. В предшествующих исследованиях лаборатории было обнаружено, что состояние ЦНС зимнеспящих животных в течение годового цикла претерпевает изменения от глубокого снижения активности во время гибернации или торпора до демонстрации сложных паттернов поведенческой активности в периоды эутермии (Семенова и др., 1999; Семенова и др., 2000).
Установлено, что значительные сезонные изменения метаболизма, биохимического статуса и поведения зимнеспящих животных находятся под контролем ЦНС, а также ряда эндогенных факторов, среди которых особо следует отметить моноамины (Слоним, 1979; Heller, 1989; Popova, 1993; Колаева, 1993; Nurnberger, 1995). Известно, что моноамины играют также ключевую роль в регуляции процессов памяти, внимания и эмоциональной устойчивости организма к действию стресс-факторов (Gromova, 1982; 1988; Семенова, 1992; Shihetal., 1999).
К настоящему времени накоплены экспериментальные данные,
свидетельствующие об участии нейромедиаторных систем мозга и, в частности,
моноаминергических в механизмах регуляции процесса гибернации (Попова и
др., 1973; Popova et al., 1993; Nurnberger, 1995). Показано, что понижение
активности норадренергической системы, обусловленное введением блокатора
аі-адренорецепторов, задерживает выход животных из состояния спячки
(Пастухов, 1986), в то время как снижение уровня активности
серотонинергической системы, обусловленное разрушением ядер шва,
сопровождается необратимым ее прекращением (Spafford, Spengelley, 1971).
Сведения об активности ферментов, участвующих в синтезе и метаболизме моноаминов в головном мозге зимнеспящих животных, в частности, ключевого фермента их дезаминирования - моноаминоксидазы формы А (МАО А), весьма ограничены и противоречивы (Popova et al., 1993; Войтенко, 1999).
Рассматривая особенности изменения активности мембраносвязанного белка МАО А, следует отметить, что на его функционирование в митохондриях значительное влияние оказывает липидный состав мембран. При этом важное значение придают содержанию остатков сиаловых кислот в гликолипидах мембран, а также состоянию и составу фосфолипидов. Обработка митохондрий нейроминидазой или фосфолипазами снижает активность МАО А (Горкин и Медведев 1955). Показано, что липиды в мембранах нейронов головного мозга гибернирующих животных связываются со свободными доменами белков в период их спячки, изменяя положение последних в мембране. При выходе животных из состояния гибернации развивается обратный процесс (Aloa 1980, Azzam et al., 2000). Такие смещения, могут приводить к структурно-функциональным изменениям мембранных белков и, возможно, к изменению субстратной специфичности МАО А, что по-разному отразится на содержании моноаминов, в частности, серотонина и норадреналина. Однако этот вопрос практически не исследован.
В последнее десятилетие получены данные, указывающие на то, что развивающиеся под влиянием факторов внешней среды изменения интенсивности синтеза нейромедиаторов, в том числе моноаминов, числа и плотности их рецепторов на поверхности нейрональных мембран, а также количества межнейрональных синаптических контактов базируются на индукции экспрессии непосредственно ранних генов (Sheng and Greenberg 1990). Последние, в частности c-fos, являются маркерами нейронов, в которых
можно ожидать долговременных пластических перестроек (Grimm et al., 1997; Lamprecht et al.,1996; Mileusnic et al., 1996). Описано увеличение экспрессии мРНК ранних генов в гиппокампе, гипоталамусе и базальных ганглиях головного мозга зимнеспящих животных в период их пробуждения (Bitting et al., 1994; O'Haraetal., 1999).
В связи с вышеизложенными данными возникает вопрос о структурной локализации нейронов, экспрессирующих транскрипционный фактор c-fos и о роли его взаимодействия с моноаминами и липидами в механизмах регуляции сложных форм поведения у зимнеспящих животных.
Цели и задачи
Цель данной работы состояла в изучении роли моноаминергических систем мозга, различных фракций липидов и экспрессии c-fos гена в механизмах регуляции исследовательского поведения зимнеспящих животных в разные периоды годового цикла.
Основные задачи исследования:
1.Изучить сезонные особенности ориентировочно - исследовательской активности длиннохвостых якутских сусликов (Citellus undulatus).
2.Исследовать особенности влияния предшественников синтеза норадреналина - Ь-3,4-диоксифенилаланина (L-ДОФА) и серотонина - 5-окситриптофана (5-ОТФ) на исследовательское поведение зимнеспящих животных в различные периоды годового цикла.
3. Исследовать роль моноаминоксидазы формы А в регуляции
интегративной деятельности мозга сусликов в различные периоды годового
цикла.
4. Исследовать количественные и качественные сезонные изменения
липидного состава мембран клеток коры головного мозга сусликов в
сопоставлении с изменением активности МАО А.
5. Исследовать изменения экспрессии c-fos гена в различных структурах
головного мозга сусликов в период выхода животных из состояния спячки.
Структурная и биохимическая организация моноаминергических систем мозга
Впервые, используя флуоресцентный гистохимический метод, шведский ученый Фальк начал структурное и детальное изучение МА систем мозга в 1962 году (Falk et al., 1962). К настоящему времени заложены основы современных представлений о МА системах мозга и дано подробное описание и классификация моноаминсодержащих нейронов ЦНС (Dahlstrom, Fuxe, 1965; Anden et al., 1966; Bjorklund, Nobin, 1973).
Структурная организация и проводящие пути серотонинергической системы. Скопления нейронов, содержащих серотонин, согласно классификации Дальстрем и Фукса (Dalstrom, Fuxe, 1965), обнаружены в продолговатом (группы В1-В4), среднем мозге (группы В7-В9) и на уровне моста (группы В5-В6). Скопление тел нейронов, которые содержат норадреналин, занимают, в основном, латеральные области продолговатого, среднего мозга (соответственно, А1-А4, А8-А9), моста (А5-А7), вентромедиальные части среднего и промежуточного мозга (соответственно А10-13) (Bjorklund, Nobin,1973).
Аксоны МА нейронов формируют нисходящие пути - от большинства нейронов продолговатого мозга - в спинной мозг, и восходящие пути — к структурам переднего мозга (Ungerstedt,1971; Буданцев,1976; Узбеков, Пигарева,1979) (рис.1).
В формирование эмоциональных состояний и регуляции интегративной деятельности мозга наибольший вклад вносят ядра, дающие начало восходящим МА проекциям мозга. С помощью гистохимической методики Фалька - Хилларпа показано, что восходящие 5 - ОТ - ергические пути идут от среднемозговых ядер шва (Ungerstedt,1971). Описано шесть пучков волокон восходящих к структурам конечного мозга. Они берут начало от дорзального (В7) (O Hearn, Molliver, 1984) и медианного (В8) ядер шва (Azmitia, Segal, 1978; Dahlstrom, Fuxe, 1965; Ungersterdt, 1971). Обнаружено, что два пучка проходят в вентролатеральной (первый пучок) и в вентромедиальной (второй пучок) области медиального продольного пучка переднего мозга (МППМ). Они иннервируют латеральные (базальные ганглии, амигдала, периформная кора) и медиальные (гиппокамп, септум, цингулярная кора) структуры конечного мозга, соответственно. Оставшиеся четыре пучка - кортикальный, перивентрикулярный, аркуатный и медиальный, проходят вне МППМ и иннервируют теменно-височную область неокортекса, хвостатое ядро, скорлупу (третий пучок), перивентрикулярные области таламуса и гипоталамуса (четвертый пучок), черное вещество, латеральное коленчатое тело, супрахиазматическое ядро гипоталамуса (пятый пучок), мамиллярные тела и межножковое ядро (шестой пучок) (Azmitia, Segal, 1978).
Структурная организация и проводящие пути норадренергической системы. Источником восходящих норадренергических проекций в мозге позвоночных животных является, в основном, голубоватое место (синее пятно) (locus coeruleus, А6) (Dahlstrom, Fuxe, 1965; Ungerstedt, 1971; Swanson, Hartman, 1975). Маеда и Шимизу (Maeda, Shimizu, 1972) исследовали восходящие НА -ергические волокна к конечному мозгу от клеточных групп А6, А7, А5 (по Дальштром и Фуксу). Они показали, что существует две системы восходящих к конечному мозгу волокон от НА - ергических нейронов. Эти системы локализованы в мосту и обозначены как церуло - кортикальная и понто -гипоталамическая. Аксоны первой системы начинаются от клеток основной части голубоватого места и поднимаются к центральному серому веществу. Вышеуказанные аксоны иннервируют неокортекс, мезокортекс, архикортекс и палеокортекс. Свэнсон и Хартман (Swanson, Hartman, 1975), используя иммунофлуорисцентный метод, подтвердили наличие двух восходящих НА -ергических путей: дорзального и вентрального. Первый НА - ергический путь оканчивается в неокортексе и гиппокампе, а второй - в области гипоталамуса. Наиболее богатые НА проекции идут к латеральному гипоталамусу, супраоптическому и паравентрикулярному ядру (Swanson, Hartman, 1975).
Пути синтеза серотонина и норадреналина. Современные представления о путях образования 5 - ОТ и дальнейших его превращениях базируются на исследованиях, которые проводились в лаборатории Юденфреда в 1954 году (Udenfriend et al.,1956). В последующие годы эта схема претерпела значительные изменения и дополнения на основании дальнейших исследований (рис.3) (Ильюченок, 1972; Мецлер, 1980).
В настоящее время считается установленным, что в живом организме 5 -ОТ образуется из триптофана. Последний в результате гидроксилирования превращается в 5 - окситриптофан (5 - ОТФ), который является непосредственным предшественником 5 - ОТ (Ильюченок, 1972). Блокада активности ферментов на первой или второй стадиях с помощью, соответственно, ПХФА (Кое, Weissman, 1966) или а - метил - ДОФА нарушает процесс синтеза этого амина. Последующее превращение 5 - ОТ связано, в основном, с процессом окислительного дезаминирования с помощью фермента моноаминоксидазы формы А (МАО — А). Специфическим конечным продуктом данного пути катаболизма 5 - ОТ является, 5- оксииндолуксусная кислота (Буданцев, 1976). Впервые представление о последовательности процессов, приводящих к образованию катехоламинов, было высказано Блашко (Blaschko, 1973).
Роль липидного состава нейрональных мембран в регуляции процесса гибернации и его связь с активностью мембранных белков и моноаминов
Адаптация пойкилотермных животных к низкой температуре окружающей среды сопровождается увеличением доли ненасыщенных жирных кислот (Aloia, 1978; Geiser, 1990; Коломийцева и др., 1997; Azzam, 2000.) в фосфолипидах и снижением молярных соотношений холестерин/фосфолипиды в органах тканях и мембранах органелл. Биологический смысл таких изменений состоит во флюидизации мембран при адаптации организма к снижению температуры для оптимизации метаболизма (Крепе, 1981).
Попытки выявить роль липидов в адаптивных изменениях метаболизма гомойотермных животных, способных к гетеротермному состоянию в период зимней спячки, приводили к неопределенным результатам. Роль фосфолипидов в функции нейрональных рецепторов в настоящее время интенсивно исследуется (Коломийцева и др., 1997; Popov et al., 1992). К настоящему времени установлено, что во время вхождения животного в спячку, когда температура мозга снижается до 2-3С, происходят глубокие изменения синапсов, в том числе рестрикция шипиков и распад синаптических контактов. Последующий выход из состояния спячки приводит в считанные часы к полному восстановлению этих структур мозга (Popov et al., 1992).
Как было сказано выше, у истинно зимнеспящих животных - сусликов -спячка состоит из циклов - баутов оцепенения, чередующихся с нормотермией. Быстрая смена альтернативных состояний мозга сусликов представляет уникальную модель для изучения механизмов синаптической пластичности и, в частности, фосфолипидного состава синаптических мембран, участвующих в проведении нервного возбуждения. В работах Коломийцевой И. К. с сотрудниками показано, что фосфолипиды синаптосом мембран нейронов коры головного мозга гибернирующих животных принимают участие в сезонных изменениях функциональных свойств головного мозга зимнеспящих животных (Коломийцева и др., 1997). Выявлено снижение содержания сфингомиелина и фосфотидилэтаноламина у зимнеспящих сусликов по сравнению с летними животными. По мнению авторов, это может быть объяснено тем, что у летних сусликов мембрана синаптосом обогащена фосфотидилэтаноламином, обладающим склонностью к образованию гексогональных структур, усиленно метилизирующихся при воздействии нейромедиаторов и влияющим на ригидность мембраны (Коломийцева и др., 1999а). Сфингомиелин у летних сусликов в цитоплазматической мембране принимает участие в проведении сигнала через сфингомиелиновый цикл. Сезонные колебания количества фосфолипидов в синаптической мембране головного мозга сусликов особенно отражаются на фосфотидилхолине и сфингомиелине. Метаболизм этих двух фосфолипидов связан таким образом, что холин и фосфотидилхолин используется в синтезе сфингомиелина. Торможение синтеза сфингомиелина способствует накоплению фосфотидилхолина. Подавление гидролиза фосфотидилхолина у зимнеспящих сусликов может способствовать снижению количества лизофосфотидилхолина. Таким образом, для зимнеспящих характерно накопление фосфотидилхолина при ускоренном метилировании фосфотидилэтаноламина и угнетении фосфолипиз Аг и С и при соответствующем угнетении образования сфингомиелина и лизофосфотидилхолина (Коломийцева и др., 1997). Известно, что гибернация сопровождается глубокими изменениями метаболизма белков и регуляторных пептидов нервной ткани зимнеспящих животных (Эмирбеков, 1980; Kramarova et al., 1983). Помимо этого у них могут значительно изменяться секреция и обратный захват нейромедиаторов. Показано, например, что вход глутамата в синаптосомы мозга зимнеспящих сусликов значительно изменен (Zharikova et al., 1992). В настоящее время изучение физиологических механизмов, регулирующих состояние клеток и организма вцелом весьма актуально всвязи с продолжающимся загрязнением окружающей среды физическими и химическими факторами. Неблагоприятные экологические и технические воздействия снижают адаптационные способности организма. Гибернация в этой связи является одним из ярких и уникальных примеров проявления адаптационных возможностей живыми системами в широком диапазоне. Можно предположить, что овладение пониманием механизмов гибернации позволит создать принципиально новые технологии в области биологии и медецины. Эти знания могут быть использованы, в частности, для совершенствования технологий консервации генетических ресурсов.
Липиды обеспечивают разделение физико-химических фаз, поддерживают электрические потенциалы, участвующие в различных механизмах регуляции жизнедеятельности клетки и организма. В отличие от нуклеиновых кислот и белков, липиды только в последние годы становятся объектами массовых биохимических исследований. Они являются одними из наименее изученных компонентов клетки. У гибернирующих животных концентрации ряда липидов изменяются при различных их функциональных состояниях (Каламийцева и др., 1992). В настоящем исследовании нами предпринята попытка изучения динамики максимально полного спектра липидов одновременно. Это стало возможным благодаря созданию метода количественного анализа, позволяющего на одной хроматограмме анализировать как весь спектр фосфолипидов, так одновременно и весь спектр нейтральных липидов.
Можно предположить, что конформационное состояние клеточных мембран и их пассивная способность удерживать электрический потенциал, возможно, ключевым образом зависит от соотношения между наиболее гидрофильными и наиболее гидрофобными составляющими общего спектра липидов. Именно этим фракциям липидов в данной работе было уделено особое внимание как при подборе методов разделения липидов, так и при анализе полученных результатов.
Биохимический анализ активности моноаминоксидазы в структурах головного мозга
Для количественной оценки 23 фракций липидов в коре головного мозга сусликов в разные периоды годового цикла использовали модернизированный нами метод высокоэффективной тонкослойной хроматографии на пластинках, покрытых силикагелем (MERCK, 20x10см) (Peuchant et. al., 1989; Aiken, Huie, 1991; Калмыков и др., 2004).
Процедура гомогенизации. Участок коры больших полушарий (500мг) помещали в стеклянный гомогенизатор, куда затем добавляли 50 мкл насыщенного метабисульфата натрия и 50 мкл насыщенного ЭДТА, после этого приливали 2 мл изопропанола. Полученную смесь гомогенизировали при 3000 оборотах в мин. (6 "ударов" тефлонового пестика). К гомогенату добавляли 1 мл изопропанола с последующей однократной гомогенизацией. Полученный гомогенат помещали в пробирку, а гомогенизатор споласкивали еще двумя миллилитрами изопропанола, эти 2 мл объединяли с предыдущим гомогенатом.
Пробирки с гомогенатом центрифугировали на центрифуге "К-70" с большой крестовиной в течение 10 мин. при скорости вращения 1200 оборотов в мин. Полученный супернатант объединяли с предидущим.
Процедура отмытия экстракта липидов от водорастворимых примесей. К 5 мл полученного экстракта добавили 5 мл гексана, затем 1 мл 7% сульфата натрия, содержащего 0,3% ЭДТА и 0,3% раствор метабисульфата. Полученную смесь энергично встряхивали 50 раз в пробирках с притертыми пробками (шлиф 19). После расслоения верхнюю фазу отбирали в чистые пробирки. К остатку в предидущей пробирке добавляли 5 мл гексана и встряхивали 50 раз. После расслоения верхнюю фазу отбирали и добавляли к предидущим очищенным экстрактам. Остаток, полученный в результате опыта, отбрасывался. Полученные очищенные экстракты упаривали в токе азота. После сушки пробы растворялись последовательно в 0,2 мл этанола и 0,2 мл хлороформа. Эти смывы переносили в эппендорфовские пробирки (1,5 мл) с крышками (потом их помещали в холодильник при -20С до нанесения на хроматограмму).
Нанесение липидного экстракта на хроматограмму.Перец, нанесением на пластинку экстракты из холодильника полностью упаривали и растворяли в определенном количестве хлороформа. Концентрация липидов 50 мкг на 5 мкл на 5 мм (раствор примерно 1%). Мягким грифелем наносили полосу соответствующего размера под липидный старт в 1 см от края пластины. Пластины последовательно промывали метанолом и системой № 1 для хроматографии фосфолипидов. Промывку осуществляли путем хроматографирования в камере, используя промежуточную сушку между растворителями. После этого активировали пластину 1 час при 105С.
Хроматографическое разделение липидов. Камеру, выложенную изнутри фильтровальной бумагой заполняли растворителем, чтобы он образовал слой 5 мм на дне камеры. Камера заполняется не менее чем за час до начала хроматографирования. Первая система растворителей - хлороформ:метанол: метил ацетат: вода (54:33:9:4 по объему). Вторая система растворителей — хлороформ:этилацетат (94:6 по объему). Третья система растворителей — гексан: хлороформ (25:75 по объему). Время элюции первой системой 9 мин., второй — 10 мин., третьей - 11 мин. Перед сканированием для индукции флуорисценции пластинки с разделенными липидами обрабатывали 10 мин. в парах концентрированной соляной кислоты при окрашивании парами йода.
Сканирование проведено на сканере СД - 1М, связанном с электронным интегратором хроматографических данных "Chromatopac G-R3A" (Zhimadzu, Japane). Интегратор автоматически рассчитывал относительное содержание индивидуальных липидов по отношению к суммарному их количеству на основании отношения площадей пиков пятен. На одной пластинке одновременно исследовали и фосфолипиды и нейтральные липиды. Результаты статистически обработаны по t-критерию Стьюдента по программе CSS ("Complete Statistical System with Graphics and data Management, Version D640, 1988, StatSoft, Inc.").
Эксперимент проводили в феврале-марте. Животных содержали с ноября по март (период гибернации) в темном помещении с температурой 4С.
Анализ уровня экспрессии c-fos генов проводили в головном мозге двух групп животных: гибернирующих и выходящих из состояния гибернации. У спящих животных, контрольной группы (п=3) на 14-ый день гибернации проводили забор материала в лабораторной комнате с температурой +4С. Забор материала пробуждающихся после 14-дневной спячки животных (п=3) проводили при температуре +13С, спустя 2,5 часа после начала пробуждения. У спящих животных температура мозга составила +4С, а у пробуждающихся -+30С. Из каждого мозга на замораживающем микротоме "ИМ 505Е" (США) при температуре -18С было приготовлено 100 пар фронтальных срезов толщиной 20 мкм. Зона приготовления срезов соответствовала координатам от +6,2 до -9,6 мм от брегмы по стереотаксическому атласу (Pellegrino a. Cushman, 1967). В эксперимент был взят каждый 10-ый срез: первый срез каждой пары использован для иммуногистохимической окраски, проведенной в соответствии с протоколом стрептавидин - биотин - пироксидазного иммуногистохимического набора ("Vector Laboratories", США), второй срез -для окраски по Нисслю. В первом случае для реакции использованы поликлональные кроличьи антитела к белку FOS ("Calbiochem", Ab-5 Cat. № РС38, США) в разведении 1:2000. Изображения срезов мозга получены с помощью микроскопа Olympus ВХ-50 (Япония) и видеокамеры Nicon АСТ-1 (Япония) с разрешением 3840x3072 пикселей, при 100%-ой освещенности без фильтров и при увеличении 9 и чувствительности 30 люксов. Полученные препараты анализировали с использованием компьютерных программ Image Pro Plus 3.0 и Abode Photoshop 3.0. При анализе материала учитывали количество экспрессирующих нейронов, а также плотность распределения fos-положительных клеток в исследованных структурах на площади в 1 мм . Результаты обработаны с использованием дисперсионного однофакторного анализа Annova и U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.
Особенности исследовательского поведения сусликов в открытом поле
Результаты биохимического исследования обмена липидной компоненты мембран клеток коры головного мозга сусликов в разные периоды годового цикла выявили существенные различия в уровне ее активности.
На Рис. 13 приведены данные сканирования окрашенной йодом хроматограммы липидов коры головного мозга животных на рис. 14 и 15 -результаты их последующей обработки на электронном хроматографическом интеграторе.
В таблице 8 представлены данные об изменении спектра относительного содержания липидов мембран клеток коры головного мозга сусликов при пяти различных функциональных состояниях: выход из спячки, бодрствование, вхождение в спячку, спячка и пробуждение между баутами. Представленная в таблице 8 последовательность липидных фракций соответствует расположению липидных фракций на хроматограмме (Рис. 13 А, Б). Так, в период выхода животных из состояния гибернации содержание фосфолипидов снижено (лизолецитина и фосфатидной кислоты достоверно повышено р 0,05), а жирных кислот и холестерина - повышено по сравнению с состоянием бодрствования. В то же время в период бодрствования доля лизолицетина (р 0,05) в суммарном спектре всех липидов повышается, а сфингомиелина, фосфатидилинозитола, фосфатидной кислоты и фосфатидилэтаноламина — имеет тенденцию к увеличению по сравнению с состоянием спячки. Одновременно с этим уменьшается доля жирной кислоты 79, диацилглицерина и эфиров холестерина в суммарном спектре всех липидов коры головного мозга сусликов, на фоне повышения доли холестерина (р 0,05) и жирной кислоты 72 по сравнению с состоянием спячки (Табл. 8). Из таблицы видно, что в период вхождения сусликов в спячку доля лизолицетина и неидентифицированного липида 31 незначительно увеличивается, а сфингомиелина и фосфатидилхолина достоверно снижается (р 0,05; р 0,01), тогда как доля остальных фосфолипидов имеет тенденцию к уменьшению по сравнению с состоянием гибернации. В то же время, содержание холестерина достоверно повышается (р 0,01), а жирных кислот, диацилглицерина и эфиров холестерина — имеет тенценцию к снижению по сравнению с контролем.
Таким образом, наблюдается незначительное снижение содержания холестерина, но существенное, и в ряде случаев достоверное, повышение относительного содержания эфиров холестерина, диацилглицерина и жирных кислот, а также значительное снижение доли лизолецитина и сфингомиелина в суммарном спектре всех липидов коры головного мозга сусликов в состоянии гибернации.
На Рис. 16 показаны наиболее существенные сезонные изменения относительного содержания ряда индивидуальных фракций фосфолипидов и гликолипидов (% от общей суммы всех липидов). На рисунке видно, что относительная доля содержания лизолицетина в суммарном спектре всех липидов мембран клеток коры головного мозга в период гибернации составляет 0,14 ± 0,02, сфингомиелина - 0,68 ± 0,08 отн. ед. (Рис. 6 А, Б), а жирных кислот и холестерина - 3,23 ± 0,15 и 20,90 ± 1,84 отн. ед. соответственно (Рис. 6 В, Г). В период выхода животных из состояния спячки относительная доля содержания лизолицетина увеличивается в 4,8 раза (р 0,01), а сфингомиелина - в 2 раза по сравнению с периодом гибернации. Доля жирных кислот уменьшается на 30%, а холестерина увеличивается в 1,4 раза, а соответственно по сравнению с периодом гибернации (Рис. 6 В, Г). В период бодрствования доля содержания лизолецитина в 4,2 раза (р 0,01) выше, а сфингомиелина в 1,6 раза выше по сравнению с периодом гибернации. Одновременно доля холестерина увеличивается в 1,2 раза (р 0,05), доля жирных кислот уменьшается на 49% (р 0,01) по сравнению с зимним периодом (Рис. 6 В, Г). Доля лизолецитина в период подготовки к спячке выше в 2,2 раза (р 0,05), а доля холестерина в 1,3 раза (р 0,01) выше, чем в период гибернации (Рис.6 Г). Таким образом, состояние гибернации и подготовки к ней у сусликов сопровождается значительным снижением содержания лизофосфолипидов и сфингомиелина, наиболее гидрофильных липидов, и увеличением ряда наиболее гидрофобных относительно выхода животных из спячки и бодрствования.
Наиболее высокая относительная доля лизолицетина и сфингомиелина выявлена в период выхода сусликов из спячки наряду с низким содержанием фосфатидилхолина и высоким содержанием фосфатидилэтаноламина в суммарном спектре всех липидов коры головного мозга сусликов. В состоянии бодрствования наблюдается еще более сниженное содержание лизолицетина и сфингомиелина на фоне значительного увеличения содержания фосфатидилэтаноламина и увеличения фосфатидилхолина. Это соотношение сохраняется при всех исследованных функциональных состояниях сусликов, несмотря на общее снижение доли наиболее гидрофильных липидов в суммарном спектре всех липидов коры головного мозга сусликов (Таблица 8). В то же время, содержание жирных кислот, диацилглицерида и эфиров холестерина в состоянии гибернации достигает наиболее высоких значений, а в состоянии выхода сусликов из спячки - наиболее низких.
