Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Анатомо-физиологические особенности вен 10
1.2. Строение стенки вен 13
1.3. Анатомо-физиологические особенности и молекулярные механизмы сокращения и расслабления сосудистых ГМК 16
1.4. Электрическая активность ГМК. Электромеханическое сопряжение в регуляции тонуса ГМК 19
1.5. Фармако-механическое сопряжение в регуляции тонуса ГМК 22
1.6. Роль эндотелия в регуляции сосудистого тонуса 24
1.7. Изменения в строении стенки вен при ХВН 26
1.8. Фармакотерапия ХВН 28
1.9. Резюме 37
2. Методы исследования
2.1. Выбор объекта исследования 39
2.2. Приготовление препаратов для исследования 40
2.3. Солевые растворы: состав, температура, рН 41
2.4. Регисттрация механической активности сегментов вен 43
2.5. Фармокологические и другие виды воздействия на мембрану ГМК и внутриклеточные сигнальные системы 45
2.6. Методы статистической обработки полученных данных 47
3. Результаты и сследований
3.1. Результаты исследований механизмов действия цикло-3 форт на ГМК сосудов
3.1.1. Состав препарата, применение в клинике и существующие представления о действии цикло-3 форт на ГМК кровеносных сосудов 48
3.1.2. Результаты исследования подкожной вены быка 49
3.1.3. Результаты исследования воротной вены крысы 55
3.2. Результаты исследований механизмов действия венорутона и троксевазина на ГМК сосудов
3.2.1. Характеристика препаратов, применение в клинике и существующие представления об их действии на ГМК кровеносных сосудов 65
3.2.2. Результаты исследования подкожной вены быка 66
3.2.3. Результаты исследования воротной вены крысы 73
3.3. Результаты исследований механизмов действия гепарина, фрагмина, фраксипарина на ГМК сосудов
3.3.1. Химическое строение, применение в клинике и существующие представления о действии гепарина, фрагмина и фраксипарина на ГМК кровеносных сосудов 79
3.3.2. Результаты исследования подкожной вены быка 81
3.3.3. Результаты исследования воротной вены крысы 86
4. Обсуждение результатов
4.1. Обсуждение результатов исследований механизмов действия цикло-3 форт на ГМК сосудов 96
4.2. Обсуждение результатов исследований механизмов действия венорутона и троксерутина на ГМК сосудов 100
4.3. Обсуждение результатов исследований механизмов действия гепарина, фрагмина, фраксипарина на ГМК сосудов 106
4.4. Резюме 114
5. Заключение 117
6. Выводы 123
7. Список литературы 124
- Анатомо-физиологические особенности вен
- Результаты исследования подкожной вены быка
- Результаты исследования воротной вены крысы
- Обсуждение результатов исследований механизмов действия гепарина, фрагмина, фраксипарина на ГМК сосудов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Вены большого круга кровообращения обеспечивают возврат крови, прошедшей через сосуды обменного типа, к сердцу, функционируют в условиях низкого трансмурального давления, которое на уровне сердца в мелких венах не превышает 20 мм.рт.ст. Вены нижних конечностей в этом отношении являются исключением. Даже при нормальном функционировании элементов стенки подкожных вен и сохранности клапанного аппарата в венах нижних конечностей трансмуральное давление выше, и при нарушении функции клапанов может достигать 100 мм рт. ст., поскольку на давление крови, создаваемое сердцем, накладывается гидростатическое давление столба крови. Стенка вен нижних конечностей подвергается значительно большему растяжению по сравнению с другими участками венозного русла, что создает определенные предпосылки для нарушения ее структуры и функции.
При длительной нагрузке на створки венозных клапанов их структура изменяется, и они не могут полностью выполнять свою функцию, что приводит к появлению так называемого «рефлюкса», т.е. обратного, от сердца, движения крови. Вследствие высокого венозного давления развивается венозный застой и прогрессирующие расширение вен. В стенке вен постепенно уменьшается количество гладкомышечных клеток (ГМК), сокращения которых обеспечивают сохранение ее тонуса. Просвет вены значительно увеличивается, створки клапанов постепенно перестают плотно смыкаться, формируется относительная, а затем и абсолютная клапанная недостаточность - основной признак хронической венозной недостаточности (ХВН).
ХВН нижних конечностей является самым распространенным заболеванием периферических сосудов (Савельев B.C., 2001; Савельев В.А., 2003; Стуров Н., 2008). До недавнего времени фармакотерапии ХВН уделялось незаслуженно мало внимания. Лекарственные препараты либо не использовались вовсе, либо им отводилась незначительная роль в терапии ХВН. В последние десятилетия ситуация изменилась к лучшему. Флебологи все больше склоняются к мнению, что консервативное лечение еще долгие годы будет, очевидно, основным методом оказания помощи больным с ХВН.
При лечении ХВН используются препараты, относящиеся к различным фармакологическим группам: венотоники, антикоагулянты и средства, улучшающие микроциркуляцию. Действие препаратов последней группы направлено, прежде всего, на улучшение обеспечения тканей конечности кислородом, а венотоники и антикоагулянты оказывают эффект на структурные стенки вен. Анализ литературных данных свидетельствует о недостатке, или, в ряде случаев, отсутствии конкретных сведений о влиянии препаратов вышеуказанных групп на сократительную функции гладкомышечных клеток вен и возможных механизмах их действия. Такое состояние проблемы частично
объясняется тем, что клиницистов по понятным причинам интересует, прежде всего, результат применения того или иного медикамента у конкретного пациента. Кроме того, даже в крупных клиниках, как правило, нет возможности исследовать фундаментальные механизмы действия того или иного медикамента.
На фармацевтическом рынке представлены различные препараты, относящиеся к группе венотоников:
препараты, содержащие растительные экстракты - сапонины (цикло 3 форте,
аэцин, эскузан), флавоноиды (микронизированный диосмин);
комбинированные препараты - анавенол и гинкор форт;
группа рутозидов - венорутон, троксерутин, троксевазин;
синтетические препараты - дипиридамол, дицинон, клопидогрель,
пентоксифиллин. Для подавляющего большинства из этих препаратов оценка венотонизирующего эффекта производилась по ряду субъективных (на основе различных опросников, заполняемых пациентами) и объективных методов диагностики, таких как измерение маллеолярного объема, ультразвуковая доплерография, фотоплетизмография, реовазография, компьютерная термография (Богачев В.Ю., 2005; Parrado F., Buzzi А., 1999; Boyle P. et al, 2003).
Кроме того, при лечении ХВН, для профилактики тромбозов широко применяются антикоагулянты: гепарин и его дериваты - низкомолекулярные гепарины.
Анализ литературных данных свидетельствует о явном дефиците или, в ряде случаев, отсутствии сведений о непосредственном или опосредованном местном влиянии препаратов вышеуказанных групп на сократительную функцию ГМК вен и возможных механизмах действия этих препаратов на ГМК сосудов. Таким образом, в проблеме компенсации нарушенных функций вен при ХВН раздел, связанный с применением венотоников и антикоагулятнов, не получил должного физиологического обоснования. Цель и задачи исследования Целью настоящей работы являлось изучение эффектов и механизмов действия, широко применяемых при лечении хронической венозной недостаточности, венотоников (цикло-3 форт, венорутон, троксевазин) и антикоагулянтов (гепарин, фраксипарин, фрагмин) на гладкомышечные клетки вен. Задачи исследования:
1. Изучить прямые и опосредованные эффекты венотоников и антикоагулянтов в рекомендуемых для клинического применения концентрациях на гладкие мышцы вен.
2. Исследовать эффекты и механизмы действия на гладкомышечные клетки
подкожной и воротной вен препаратов группы венотоников: венорутон, троксевазин,
цикло-3 форт.
3. Изучить эффекты и механизмы действия на гладкомышечные клетки подкожной
и воротной вен препаратов группы антикоагулянтов: гепарин, фраксипарин, фрагмин.
Научная новизна работы:
Получены новые данные, свидетельствующие о непосредственном и опосредованном влиянии венотоников и антикоагулянтов на ГМК вен.
Показано, что венотонизирующие препараты и препараты из группы антикоагулянтов оказывают как выраженное прямое, так и эндотелий-зависимое влияние на тоническую и фазную сократительную активность ГМК подкожной и воротной вен.
Установлено, что цикло-3 форт непосредственно стимулирует а-адренорецепторы сосудистых гладких мышц и блокирует К+- каналы мембраны ГМК, а также ингибирует эндотелиальную синтазу оксида азота.
Впервые обнаружено, что активирующее влияние венорутона и троксевазина на миоциты вен реализуется за счет высвобождения из эндотелиальных клеток эндотелина.
Представлены новые данные о важной роль эндотелия как посредника в реализации эффектов нативного и низкомолекулярных гепаринов на ГМК вен. Гепарины приводят к снижению тонуса и увеличению силы фазных сокращений ГМК вен посредством усиления продукции эндотелиоцитами оксида азота. Научная и практическая значимость работы
Теоретическая значимость работы заключается в раскрытии конкретных механизмов действия антикоагулянтов и венотонизирующих препаратов на ГМК венозных сосудов. Результаты исследования расширяют представления о путях и механизмах прямого и опосредованного эндотелием влияния венотоников и антикоагулянтов на фазную и тоническую активность гладких мышц вен. Полученные результаты могут быть использованы непосредственно в экспериментальных исследованиях сократительной функции сосудистых ГМК.
Практическая ценность работы определяется установлением общих закономерностей и выявлением механизмов действия венотоников и антикоагулянтов на гладкие миоциты венозных сосудов у животных и возможностью использования результатов проведенного исследования при разработке схем лечения ХВН у человека и способов стимуляции сократительной функции ГМК вен человека.
По результатам исследования внесены дополнения в лекционный курс по нормальной физиологии в Санкт-Петербургской государственной медицинской академии
им. И.И. Мечникова, Оренбургской государственной медицинской академии и Ивановской государственной медицинской академии.
Положения, выносимые на защиту
1. Цикло-3 форт оказывает сложное влияние на гладкомышечные клетки подкожной вены быка и воротной вены крысы:
а) цикло-3 форт активирует сократительный аппарат миоцитов вен за счет
стимуляции а-адренорецепторов гладкомышечных клеток;
б) цикло-3 форт блокирует К+- каналы мембраны гладкомышечных клеток, что
приводит к деполяризации мембраны и развитию сокращения;
в) цикло-3 форт ингибирует эндотелиальную синтазу оксида азота и таким образом
уменьшает базальную продукцию оксида азота и его дилатирующий эффект на гладкие
мышцы вен.
Венорутон стимулирует высвобождение из эндотелиальных клеток эндотелина, который, активируя эндотелии А рецепторы мембраны миоцитов, стимулирует сократительный аппарат гладких мышц вен и увеличивает тонус стенки сосудов.
Троксевазин увеличивает продукцию эндотелиальными клетками эндотелина который, активируя эндотелии А рецепторы мембраны ГМК, стимулирует сократительные реакции миоцитов вен и вызывает увеличение напряжения стенки сосудов.
4. Нефракционированный и низкомолекулярные гепарины усиливают продукцию эндотелиоцитами оксида азота, что приводит к дилатации подкожной вены. В воротной вене, обладающей спонтанной фазной активностью, гепарины стимулируют эндотелиальную синтазу оксида азота, вследствие этого понижается тонус и уменьшается частоты фазных сокращений и, по механизму хроноинотропной зависимости, увеличивается амплитуда фазных сокращений гладких мышц.
Апробация работы
Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на Конференции молодых ученых и сотрудников СПбГМА им. И.И. Мечникова «Мечниковские чтения» (Санкт-Петербург, 2002), на научно- практической конференции, посвященной 300-летию Санкт-Петербурга и 100-летию больницы Петра Великого (Санкт-Петербург, 2003), на III Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2003), на XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004), на научно- практической конференции "Проблемы укрепления здоровья и профилактика заболеваний" (Санкт-Петербург, 2004),
на научно-практической конференции "Исследования по приоритетным направлениям в медицине и биологии" (Санкт- Петербург, 2009).
По результатам диссертационного исследования опубликовано 8 работ, из которых 2 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации
Анатомо-физиологические особенности вен
Вены в организме человека выполняют множество функций. Они отводят кровь из капилляров органов и тканей, выполняя дренажную функцию; аккумулируют кровь с целью последующего ее использования (депонирующая функция); возвращают кровь к сердцу; участвуют в транскапиллярном обмене жидкости путем изменения соотношения пре- и посткапииллярного сопротивления (резистивная функция); принимают активное участие в обменных процессах с окружающими тканями (обменная функция); выполняют функции обширной рефлексогенной зоны (Покровский А.В., 1976; Ткаченко Б.И., 1979; 1984; Константинова А.Д. и др., 2000; Фаллер А. И др., 2008).
Наиболее характерными отличиями венозных сосудов от артериальных являются:
-высокое отношение радиуса к толщине стенки;
-сильная зависимость модуля упругости от степени растяжения;
-выраженная зависимость величины просвета от уровня трансмурального давления;
-способность изменять в определенных пределах свою емкость практически без изменений венозного давления;
-овальная формы сечения при низких уровнях трансмурального давления и способность к коллапсу;
-более низкий уровень давления и значительно больший общий объем;
-выраженное влияние экстраваскулярного давления на давление и кровоток в венах.
-наличие клапанов в венах. Емкость венозной системы значительно больше емкости артериальной. По мнению Wood (1965), венозные сосуды содержат более 70% всей крови. Большая емкость венозной системы сопровождается меньшей скоростью движения крови по венозным сосудам. Средняя скорость кровотока в органных венах 1 см/с, тогда как в соответствующих частях артериальной системы она значительно больше: 3-4 см/с (Burton А.С., 1965;KappertA., 1967).
Существенной особенностью венозных сосудов является небольшая толщина их стенки - она значительно меньше толщины стенки соответствующих артериальных сосудов. Этот признак обусловлен величиной внутривенного давления. Среднее давление в аорте и больших артериях равно 100 мм рт ст. в капиллярах- 30 мм рт ст, в венулах- 20 мм рт ст, в органных венах — 15 мм рт ст , в нижней полой вене - 10 мм рт ст (Тель Л.З. и др., 2007; Burton А.С., 1965). Все факторы, оказывающие существенное влияние на адекватный венозный возврат крови к сердцу, можно разделить на центральные и периферические. К центральным относят работу сердца и присасывающее действие диафрагмы при дыхании. К периферическим - наличие венозных клапанов, работу мышечно-венозных «помп», передаточную пульсацию артерий, венозный тонус (Думпе Э.П. и др., 1982; Яблоков Е.Г. и др., 1999; Тураев П.И., 2005).
Влияние работы сердца на отток венозной крови реализуется двумя путями: vis a tergo и vis a fronte (Лукьянов Е.К., 1966; Думпе Э.П. и др., 1982; Яблоков Е.Г. и др., 1999; Луцевич Э.В. и др., 2004; Тураев П.И., 2005).
Vis a tergo: пропульсивное усилие левого желудочка передается через капилляры на венулы и вены и обеспечивает постоянную подачу крови через капилляры к венулам нижних конечностей. Однако давление на венозном конце капилляра достаточно низкое, составляет около 17 мм рт. ст. Таким образом, запас кинетической энергии артериального потока почти полностью гасится на уровне капиллярного русла. Исходя из этого, фактор сердечного выброса хоть и оказывает влияние на венозный отток на этом уровне сосудистой системы нижних конечностей, но незначительное.
Vis a fronte: совокупность «присасывающих» факторов, реализующихся за счет работы правого предсердия и диафрагмы. Систолы желудочков приводят к быстрому падению давления в правом предсердии и системе нижней полой вены, и создает градиент давления. Это способствует движению крови из периферических вен в нижнюю полую. Существенное место также среди данных факторов занимает влияние дыхательных движений.
Среди периферических факторов, определяющих венозный отток крови из нижних конечностей, наиболее важным является работа мышечно-венозной «помпы». По локализации выделяют мышечно-венозную «помпу» стопы, голени, бедра и брюшной стенки. Во время физической нагрузки сокращения мышц приводят к сдавлению вен, содержащаяся в них кровь выбрасывается по направлению, определяемому клапанами, т.е. к сердцу. Возможность мышечно-венозной «помпы» выполнять эту работу зависит от развитости мышц, емкости вен, количества и распределения венозных клапанов (Феган Д., 1997). Отсутствие ретроградного кровотока в глубоких венах в период расслабления мышц, а также отсутствие заполнения поверхностных вен кровью из глубоких вен при мышечных сокращениях объясняется наличием ориентированных клапанов в глубоких и перфорантных венах (Савельев B.C. и др., 2001, Рашеле А.-А. и др., 2008).
На венозный отток оказывает определенное влияние передаточная пульсация артерий. Наружное соединительнотканное влагалище объединяет артерию и соответствующие вены в единый функционирующий комплекс. Пульсовая волна от артерии передается на близлежащие вены и в них приводит к формированию потока крови, направленного к сердцу благодаря наличию в них клапанов (Алексеев П.П., 1971).
Фактором, необходимым для возврата венозной крови к сердцу, служит венозный тонус. Он позволяет сохранять и регулировать емкость вен. Венозный тонус обеспечивается мышечным аппаратом этих сосудов. Вены получают иннервацию от соседних смешанных и симпатических нервов (Чернявская Г.В., 1970; Ткаченко Б.И. и др., 1971; 1973).
Результаты исследования подкожной вены быка
При изучении параметров сократительной деятельности изолированных сегментов подкожной вены быка (п=9) было установлено, что в обычных экспериментальных условиях эти препараты не проявляют спонтанной активности. После натяжения препарата, соответствующего трансмуральному давлению 15 мм.рт.ст. (Скопичев В.Г. и др., 2005), на протяжении 5-6 минут устанавливался определенный уровень тонуса, и при отсутствии воздействий тоническое напряжение не менялось длительное время (наблюдаемые иногда небольшие колебания тонуса были статистически недостоверными). Добавление в омывающий раствор цикло-3 форт в концентрации 50 мг/л приводило к медленному повышению уровня тонического напряжения (на 23+3,4%) (п=7) (рис 3.1.1). Действие препарата начинало проявляться на 2-3 минутах. Максимальное повышение тонуса достигалось к 20-22 минуте действия цикло-3 форт. Удаление цикло-3 форт из омывающего раствора сопровождалось медленным снижением тонуса. На 30-й минуте после удаления из раствора цикло-3 форт тонус вены оставался несколько повышенным.
Поскольку в описании препарата и в литературе акцент делается на способности экстракта иглицы, как действующего начала цикло-3 форт непосредственно стимулировать а-адренорецепторы ГМК стенки вен, в следующей серии экспериментов в физиологический раствор, омывающий сегмент подкожной вены, добавляли норадреналин в концентрации 10"6 моль/л (п=8). При действии норадреналина тонус ГМК препарата существенно повышался, достигая максимума на 2-3 минуте. На фоне максимальной реакции на норадреналин, в раствор вводили цикло 3 форт. В ответ на аппликацию цикло-3 форт тонус сегментов вен возрастал и составлял не более 18±3,2 % от значения в растворе норадреналина (рис 3.1.2).
Продолжая серию опытов по исследованию возможных адреномиметических свойств цикло-3 форт в раствор вводили неселективный блокатор ссі-адренорецепторов- фентоламин в концентрации 10 моль/л (п=8) и селективный блокатор ои-адренорецепторов - празозин в концентрации 10 моль/л (п=9). После 10-минутного действия адреноблокаторов в раствор вводили цикло-3 форт в концентрации 50 мг/л. В этом случае действие цикло-3 форт проявлялось медленнее, амплитуда тонического сокращения также была меньше по сравнению с эффектом цикло-3 форт в растворе Кребса и составляла не более 19+2,7% по сравнению с контрольными в физиологическом растворе Кребса (рис. 3.1.2).
В описании механизма действия цикло-3 форт указывается также на его способность стимулировать высвобождение норадреналина из симпатических нервных окончаний в стенке вен и таким образом приводить к повышению тонуса стенки. В научной литературе прямых доказательств подобного эффекта мы не смогли найти. В связи с этим мы провели серию опытов с электростимуляцией препаратов. Известно, что при электростимуляции гладкомышечных препаратов короткими электрическими стимулами прямого возбуждения ГМК не происходит. В этом случае возбуждаются только нервные окончания в стенке исследуемого сосуда, а стимуляция гладких мышц осуществляется медиатором, выделяющимся из нервных окончаний (McHale N.G., Roddie I.C., Thornbury K.D.,1980). В следующей серии опытов (п=8) мы стимулировали препараты подкожной вены электрическими импульсами амплитудой 50 В, частотой 20 Гц и длительностью 0,3 мс. Электрические импульсы генерировались сериями по 30 сек, с интервалом в 1 минуту. При электростимуляции препаратов регистрировался выраженный сократительный ответ. Электростимуляцию продолжали до тех пор, пока амплитуда сократительного ответа не уменьшалась до 20% от амплитуды первых сократительных реакций на электростимуляцию.
По окончании электростимуляции и формирования стабильного тонуса сегментов подкожной вены в раствор вводили цикло-3 форт. В этих экспериментах ответная сократительная реакция ГМК вены была несколько меньшей по сравнению с эффектом цикло-3 форт на сегменты вены без-предварительной электростимуляции (рис. 3.1.3) и составляла не более 15±2,8% по сравнению с контрольными в стандартном растворе. В то же время величина реакции сегмента подкожной вены на экзогенный норадреналин мало отличалась от таких же реакций препаратов подкожной вены на норадреналин без электростимуляции.
Результаты, описанные выше, дали основание сделать заключение о том, что помимо стимуляции а-адренорецепторов мембраны гладких мышц, цикло-3 форт действует на ГМК подкожной вены каким-то другим способом. Вполне логично было предположить, что цикло-3 форт оказывает непосредственное стимулирующее действие на ГМК вен.
Одним из важнейших пусковых факторов, приводящим к активации сократительного аппарата гладких мышц, является деполяризация мембраны ГМК. Деполяризация мембраны возбудимых клеток развивается как при входе в клетки по градиенту концентрации Na+ и Са2+, так и при уменьшении выходящего калиевого тока, что обычно бывает при блокаде К+-каналов. С целью выявления возможной роли К+-каналов в реализации эффекта цикло-3 форт на гладкие мышцы воротной вены была проведена серия опытов с тетраэтиламмонием (п=7) и гиперкалиевым (п=9) раствором.
С этой целью в следующей серии экспериментов мы использовали тетраэтиламмоний (ТЭА), являющийся блокатором калиевых каналов мембраны практически всех возбудимых клеток (Белова Л.П. и др., 2005; Inoue R. et al., 1986; ICN, 1999; 2002; Horiuchi Т. et al., 2002; Engel A.G. et al., 2003).
ТЭА в концентрации 2 и 10 ммоль/л вызывал повышение тонуса гладких мышц подкожной вены. Цикло-3 форт на фоне ТЭА увеличивал напряжение сосудистой стенки, но в меньшей степени (11+1,6%) по сравнению с амплитудой ответов в физиологическом растворе (рис. 3.1.4). В свою очередь ТЭА на фоне развившейся контрактильной реакции гладких мышц подкожной вены на цикло-3 форт также вызывал меньшие по амплитуде сократительные ответы ГМК (12±1,9%) по сравнению с таковыми в физиологическом растворе.
При анализе данных, полученных в этой серии опытов, могло сложиться впечатление, что цикло-3 форт совместно с тетраэтиламмонием максимально активизировали сократительный аппарат ГМК подкожной вены, и дальнейшее увеличение амплитуды сокращения было невозможно. С целью проверки этого предположения в омывающем растворе повышали концентрацию К+ до 60 ммоль/л. При действии гиперкалиевого раствора развивалось длительное контрактурное сокращение с амплитудой превышающей 200% от исходного уровня тонуса (рис. 3.1.4).
Литературные данные свидетельствуют о важной роли эндотелия в регуляции тонуса и реакций ГМК сосудистой стенки на механические факторы и некоторые, физиологически активные вещества (Murad F., 1997; Lopez R.M. et al., 2004; Tanaka Y. et al., 2004). В ряде сосудов выявлена базальная и вызванная продукция оксида азота, в других важную роль в регуляции тонуса ГМК играет простациклин и эндотелины (Jackson, W.F. et al., 1993; Santos M.R. et al., 2006; Zhang G.X. et al., 2007).
С целью изучения возможного вклада эндотелиальных клеток в формирование реакции гладких мышц сегментов подкожной вены на цикло-3 форт была проведена серия экспериментов с деэндотелизацией сосудов. Было установлено, что в одинаковых экспериментальных условиях деэндотелизированные сегменты подкожной вены имеют достоверно более высокий уровень тонуса по сравнению с интактными.
При введении в омывающий раствор цикло-3 форт (п=7) эти препараты отвечали констрикторной реакцией меньшей величины (не более 15+3,6%) по сравнению с интактными сегментами (рис. 3.1.5).
Результаты исследования воротной вены крысы
При исследовании сегментов воротной вены было показано, что венорутон оказывает выраженное влияние на все параметры сократительной деятельности ГМК. Было установлено, что венорутон в концентрации 60 мг/л (п=15) существенно увеличивал тонус ГМК (на 140±12,4%), при этом снижалась амплитуда фазных сокращений (на 49+5,7%) и наблюдалось повышение их частоты (на 32±4,1%). Указанные цифры соответствуют максимуму эффекта. Действие венорутона начинало проявляться уже на 35-45 секундах после добавления препарата и достигало максимума на 60-90 секундах.
При изучении влияния троксевазина (п=17) на сократительную активность изолированных сегментов воротной вены было установлено, что данный препарат в концентрации 40 мг/л воздействия существенно увеличивал тонус ГМІС На максимуме эффекта, троксевазина: регистрировалось выраженное повышение уровня тонического напряжения (на 102+12,4%), увеличение амплитуды (на 128±5,7%) и частоты фазных сокращений (на 36±4,1%). Обобщенные данные, полученные при изучении действия венорутона и троксевазина на сократительную функцию ГМК воротной вены крысы, представлены на рис 3.2.6.
При удалении венорутона и троксевазина из омывающего раствора параметры сократительной деятельности воротной вены медленно восстанавливались, время восстановления при отмене троксевазина тонус миоцитов подкожной вены составляло 20 минут, а при удалении из раствора венорутона - 35 минут.
На воротной вене крысы также была проведена серия экспериментов с деполяризацией мембраны ГМК (п=11). В ответ на повышение концентрации КС1 тонус препаратов существенно повышался, возрастала частота и уменьшалась амплитуда фазных сокращений. Вснорутон и троксевазин в вышеуказанных концентрациях добавлялся в омывающий раствор на фоне развития максимальной реакции ГМК сосуда на КС1. Прирост тонуса, изменения амплитуды и частоты фазных сокращений сосудистых сегментов в этом случае были значительно меньшими по сравнению с реакцией в растворе Кребса. Данные, полученные на 10 минуте действия венорутона и троксевазина на фоне повышенной концентрации К представлены на рис 3.2.7.
В следующей серии опытов на воротной вене в раствор, омывающий сегмент вены, вначале вводился верапамил в концентрации 10" моль/л. При действии верапамила наблюдались достоверные изменения тонуса и частоты фазных сокращений,и выраженные изменения амплитуды. На третьей минуте в раствор добавляли в одной группе опытов венорутон (п=14), в другой троксевазин (п=11). Констрикторная реакция гладких мышц воротной вены на венорутон и троксевазин на фоне верапамила хотя и была слабее, по сравнению с ответами на эти препараты в растворе Кребса, тем не менее, она былш достаточно выраженной. И тоническое напряжение препарата и частота фазных сокращений возрастали в значительной степени (для венорутона на 94,3+8,1% и 29±8,2% соответственно, для троксевазина на 81±6,9% и 31+2,8% соответственно) (рис. 3.2.8).
В последующем были проведены группы экспериментов по изучению возможной роли эндотелия в реализации сократительных реакций гладких мышц воротной вены на венорутон (п=9) и троксевазин (п=10). Было установлено, что деэндотелизированные препараты воротной вены реагировали на эти венотоники значительно слабее по сравнению с интактными.
С целью уточнения механизма действия венорутона (п=5) и троксевазина (п=6) на гладкие мышцы воротной вены использовали L-NAME 10"4 моль/л. Реакция сосудистых сегментов на оба венотоника на фоне блокады синтеза оксида азота статистически не отличалась от ранее зарегистрированных ответов интактных сегментов воротной вены в физиологическом растворе.
По аналогии с экспериментами на подкожной вене быка, мы провели группу экспериментов по оценке роли простагландинов в реализации эффектов венорутона (п=8) и троксевазина (п=9) на гладкие мышцы воротной вены. Применение индометацина практически не изменяло величины констрикторных реакций миоцитов на венорутон и троксевазин. На фоне действия индометацина в концентрации 10"5 моль/л в раствор вводили венорутон или троксевазин. На 10 минуте действия обоих препаратов регистрировали параметры сократительной деятельности ГМК вен. Анализ показал отсутствие статистически значимых различий параметров сократительной активности миоцитов при действии венорутона и троксевазина в физиологическом растворе и на фоне действия индометацина.
Следующим кандидатом на роль посредника в реализации эффектов венорутона (п=4) и троксевазина (п=4) на гладкие мышцы воротной вены был эндотелии. С целью исключения или минимизации эффектов эндотелина на ГМК воротной вены в раствор вводили антагонист эндотелии А рецепторов. BQ-123. Добавление в раствор BQ-123 приводило к незначительным изменениям тонуса и частоты и амплитуды фазных сокращений ГМК воротной вены. При последующем добавлении в раствор венорутона или троксевазина на фоне действия антагонист эндотелии А рецепторов регистрировался достаточно выраженный ответ гладких мышц вены. Но прирост тонуса и изменения частоты и амплитуды фазных сокращений в этом случае были значительно менее выраженными по сравнению с их изменениями в физиологическом растворе (рис. 3.2.9). Для венорутона прирост тонуса составил 65+4,6%, изменение частоты на 12+1,1% и амплитуды фазных сокращений на 22±1,9%по сравнению с контрольными в растворе Кребса. Для троксевазина прирост тонуса составил 51+5,6%, изменение частоты на 14+1,2% и амплитуды фазных сокращений на 58±4,5% по сравнению с контрольными в растворе Кребса.
Для оценки возможной стимуляции венорутоном и троксевазином а-адренорецепторов на мембране ГМК или высвобождения медиатора из нервных окончаний в стенке подкожной вены мы использовали блокатор а-адренорецепторов- фентоламин (ICN, 10 б моль/л). В воротной вене на фоне действия фентоламина в ответ на введение венорутона (п=7) и троксевазина (п=8) прирост тонуса был практически таким же, что и в физиологическом растворе, разница была статистически недостоверной. Частота фазных сокращений в этих опытах изменялась практически так же, как и в физиологическом растворе. Влияние венорутона на амплитуду фазных сокращений ГМК воротной вены было похожим на его эффект в физиологическом растворе. Троксевазин же на фоне фентоламина приводил к значительно меньшему увеличению амплитуды фазных сокращений. Прирост амплитуды составил в этих опытах 47±6,1% (в физиологическом растворе этот прирост составлял около 130%, р 0.05).
Обсуждение результатов исследований механизмов действия гепарина, фрагмина, фраксипарина на ГМК сосудов
Прежде, чем перейти к обсуждению результатов исследования, изложенных в данной главе, необходимо отметить, что, несмотря на многократные упоминания в литературе, рекомендациях и инструкциях по применению (Справочник Видаль, 2002; Гепарин: инструкция по применению. Белмедпрепараты, 2002; Фрагмин (Dalteparin sodium). Производитель - Vetter Pharma-Fertigung GmbH - Инструкция по применению) о способности вышеуказанных антикоагулянтов расширять кровеносные сосуды и снимать спазм артериол, мы не смогли найти в литературе сведений об изученном или возможном механизме действия этих веществ на гладкие мышцы сосудов.
Анализ результатов, полученных в нашем исследовании действия гепарина, фрагмина и фраксипарина на сократительную функцию миоцитов подкожной вены быка, позволяет сделать заключение о том, что интактные подкожные вены, не обладающие спонтанной фазной, активностью, в физиологических условиях реагируют на антикоагулянты снижением тонического напряжения. Действие всех трех антикоагулянтов в терапевтических концентрациях сводится к дилатации, не превышающей 15% от исходного уровня тонуса. Степень их дилатации незначительно возрастала при повышении концентрации антикоагулянтов в 2 раза. На, основании этих данных следует полагать, что терапевтические концентрации гепарина, фрагмина и фраксипарина практически полностью активируют существующие механизмы дилатации в подкожной вене здоровых животных и человека. По-видимому, это является универсальным свойством для крупных вен различных животных и человека. Ранее в подобных экспериментальных условиях было показано, что подкожные вены голени и бедра человека, не имеющие морфологических патологических изменений, не обладают спонтанной активностью и слабо реагируют на ряд вазоактивных веществ (Орлов Р.С. и др., 1977). Небольшие по величине сократительные ответы на группу констрикторов были получены и при исследовании подкожных вен кролика и крысы (Bevan J.A. et al., 1974; Parkinson A. et al., 1995).
Результаты экспериментов с повышением концентрации К в растворе Кребса и последующим введением в раствор гепарина, фрагмина или фраксипарина показали, что в случае деполяризации мембраны (а это происходит всегда при повышении концентрации К+ во внеклеточной жидкости (Bergdahl A. et al., 1995; Ushio-Fukai М. et al., 2000) и соответствующей активации контрактильного аппарата миоцитов подкожной вены за счет входа экстраклеточного Са2+ через открывшиеся потенциал-зависимые Са +-каналы, гепарин и низкомолекулярные антикоагулянты способны существенно снижать уровень тонического напряжения сосуда.
На основании результатов (п=15), полученных при добавлении гепаринов в физиологический раствор, содержащий 10 мМ/л тетраэтиламмония — отсутствие реакции сосудов на гепарин и другие антикоагулянты на протяжении 15 минут, мы пришли к заключению об участии в процессе расслабления, вызванного гепаринами, К -каналов мембраны.
Известно, что ТЭА не является специфическим блокатором определенного типа К+-каналов, он блокирует в той или иной степени различные типы К -каналов возбудимых мембран (Белова-Л.ГЕ и др., 2005; Inoue R. et al., 1986; ICN, 1999; 2002; Horiuchi Т. et al., 2002; Engel A.G. et al., 2003).
В связи с этим, мы в следующей серии экспериментов применили глибенкламид, являющийся специфическим блокатором АТФ-чувствительных К+- каналов мембраны клеток (E.Hamada et al., 1990; Cyrys S. et al., 1994; Huang Y. et al., 1998). Поскольку гепарин, введенный в раствор, содержащий глибенкламид, не приводил к выраженным изменениям тонуса ГМК сосудов, есть основания полагать, что дилататорный эффект гепаринов в подкожных венах реализуется через АТФ-чувствительные К -каналы мембраны миоцитов, а именно - посредством открытия АТФ-чувствительных К+-каналов.
После получения результатов, свидетельствующих о том, что дилататорный эффект гепаринов реализуется посредством открытия АТФ-чувствительных К+-каналов мембраны миоцитов подкожной вены, предстояло ответить на вопрос: влияние гепаринов на АТФ-чувствительные К -каналы является прямым или опосредованным? Действуют ли они непосредственно, по аналогии с пинацидилом и никорандилом, или запускают какую-то существующую регуляторную систему, активация которой приводит к открыванию АТФ-чувствительных К+-каналов.
С учетом большой молекулярной массы гепарина (около 16000 дальтон), фрагмина (около 5000 дальтон) и фраксипарина (от 4 до 5 тысяч дальтон) следует считать маловероятным предположение о прямом влиянии этих веществ на АТФ-чувствительные К+- каналы мембраны гладких мышц именно по причине их высокой молекулярной массы (молекулярная масса классического блокатора К+- каналов - ТЭА всего лишь 131 дальтон, молекулярная масса глибенкламида - блокатора АТФ-чувствительных К+-каналов - 593 дальтона). Логично было предположить участие в процессе урежения ритма фазных сокращений интактных сосудов и возрастания их амплитуды при- действии антикоагулянтов дилататоров; синтезируемых в эндотелиальных клетках: оксида азота или простациклина (или обоих).
Известно, что во многих сосудах АТФ-чувствительные К+- каналы мембраны ГМК открываются при выделении эндотелиоцитами оксида азота, что в итоге приводит к дилатации сосудов (Лобов Г.И., Кубышкина Н.А., 2001; Fukao et al. 1999; Firth Т.A. et al, 2000; Morales S. et al., 2004).
Этот процесс происходит в следующей последовательности: стимуляция эндотелиоцитов (механическая или биологически активными веществами) — продукция эндотелиоцитами оксида азота — стимуляция оксидом азота растворимой гуанилатциклазы в цитоплазме миоцитов — повышение концентрации циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) — активация цГМФ-зависимой протеинкиназы — открытие АТФ-чувствительных К -каналов — усиленный выход К из клетки — гиперполяризация мембраны — закрытие медленных Са -каналов — уменьшение входа в миоциты экстраклеточного Са —» расслабление ГМК — дилатация сосуда (Fukao М. et al., 1999; Han G. et al., 1999; Jackson W.F. et al., 1993; Mistry D.K., Garland C.J. 1998; Nara M. et al., 2000).
Поскольку участие АТФ-чувствительных К -каналов мембраны в расслаблении ГМК подкожной вены при действии гепарина было доказано в опытах с глибенкламидом, следующими задачами в соответствии с вышеуказанной последовательностью событий было: а) доказать участие эндотелия в этом процессе, 2) ингибировать синтез оксида азота, 3) ингибировать растворимую гуанилатциклазу.
Для доказательства или отрицания участия оксида азота в реализации расслабления ГМК подкожной вены при действии гепаринов мы использовали L-NAME (Lopez R.M. et al., 2004; Santos M.R. et al.,2006; Zhang G.X. et al., 2007). Этот ингибитор синтазы уменьшает дилататорный эффект ацетилхолина на ГМК хвостовой артерии крысы на 90% за счет снижения концентрации оксида азота (Lopez R.M. et al., 2004). Результаты наших экспериментов (п=9) показали, что при добавлении в раствор L-NAME перед введением в раствор антикоагулянтов, реакции со стороны ГМК при-действии нативного гепарина или низкомолекулярных гепаринов на миоциты подкожной вены были статистически недостоверными. Таким образом, следует считать доказанным, что расслабление ГМК подкожной вены быка при действии антикоагулянтов является эндотелий-зависимым и реализуется в основном за счет увеличения скорости синтеза эндотелиоцитами N0.
