Введение к работе
Актуальность проблемы. Множественная миелома (ММ) — одна из наиболее часто встречающихся и хорошо изученных злокачественных неоплазий, характеризующаяся клональнои экспансией малигнизированных плазматических клеток, продуцирующих аномальные иммуноглобулины или их фрагменты (Bergsagel P.L., 2003; Anderson К.С., 2011). Однако, несмотря на достигнутые в последние годы успехи в изучении патогенеза ММ и разработке новых схем терапии, это заболевание до сих пор остается некурабельным.
Развитие ММ является следствием сочетанного действия генетических изменений в плазматических клетках, нарушения адекватного функционирования костно-мозгового микроокружения и потери иммунного контроля над заболеванием (Бесмельцев С.С., Абдулкадыров К.М., 2004; San Miguel J.F. et al, 2005).
Чрезвычайная гетерогенность MM, разнообразие ее клинических проявлений, вариабельность течения заболевания во многом обусловлены индивидуальными особенностями клеток опухолевого клона и их взаимодействием с защитными системами организма больного, в том числе участвующими в метаболизме ксенобиотиков, репарации ДНК, регуляции клеточного цикла и процессов апоптоза, иммунном ответе (Vangsted A et al., 2011). Вследствие этого актуальным является поиск дополнительных факторов, которые позволили бы прогнозировать особенности течения ММ в зависимости от индивидуальных особенностей опухолевого клона и организма-«хозяина», разрабатывать дифференцированные подходы к терапии (Fonseca R, et al., 2004; Brown E.E. et al., 2007).
В последнее время значительное внимание уделяется изучению факторов прогноза, связанных с индивидуальными генетически детерминированными особенностями иммунной системы, которые могут определять эффективность предотвращения трансформации нормальных клеток в опухолевые, а также своевременной элиминации измененных клеток (Abazis-Stamboulieh D. et al., 2007; Birmann B.M. et al., 2009).
HLA-система играет ключевую роль в развитии иммунного ответа, в том числе и противоопухолевой защиты, обеспечивая презентацию чужеродного антигена — важнейшего процесса в развитии иммунного ответа. Молекулы HLA I класса представляют пептиды цитотоксическим Т-лимфоцитам (CTL), что приводит к прямому лизису клеток-мишеней, а молекулы HLA II класса — Т-хелперам, стимулируя клеточный, либо гуморальный иммунитет в зависимости от преобладания Т-хелперов 1 или 2 типа. Эффективность презентации пептида антигенами HLA может различаться, формируя, таким образом, индивидуальные особенности иммунного ответа.
Естественные киллеры (NK), наряду с CTL, являются важнейшими эффекторными клетками, осуществляющими цитолиз опухолевых клеток, в том
числе и миеломных. Известно, что активность естественных киллеров отрицательно коррелирует с опухолевой массой при ММ, при этом эффективность NK-клеточного цитолиза зависит от уровня экспрессии антигенов HLA I класса на опухолевых клетках (Osterborg A. et al., 1990; Wieten L. et al., 2011). Также показано, что один из современных противоопухолевых препаратов — бортезомиб снижает экспрессию молекул HLA I класса на миеломных клетках (Lundqvist A. et al., 2010).
В середине 90-х годов XX века было установлено, что классические HLA-антигены I класса участвуют в регуляции функциональной активности NK-лимфоцитов, взаимодействуя с иммуноглобулинподобными рецепторами киллерных клеток (KIR) (Dohring С. et al., 1996; Carrington М., Norman P., 2003). К настоящему времени идентифицировано 15 KIR-генов, которые кодируют ингибирующие (iKIR) и активирующие (aKIR) рецепторы. iKIR имеют длинный цитоплазматический участок (L), a aKIR — короткий (S). Число KIR-генов у индивидуума может варьировать от 5 до 15. В зависимости от количества и типа генов выделяют две группы гаплотипов: А и В. А-гаплотип имеет постоянный состав и содержит только один активирующий ген (KIR2DS4), пять ингибирующих (KIR2DL1/3, 3DL1/2/3) и KIR2DL4, который обладает как активирующими, так и ингибирующими свойствами (Shilling H.G. et al., 2002). В-гаплотипы вариабельны по количеству генов и характеризуются присутствием более чем одного активирующего KIR-гена (Uhrberg М. et al., 2002). KIR-рецепторы осуществляют свою функцию, взаимодействуя с лигандами — антигенами HLA I класса. Двухдоменные (2D) рецепторы взаимодействуют с антигенами HLA локуса С (Colonna М. et al., 1992), а трехдоменные (3D) — локусов А и В (Gumperz J.E. et al., 1995).
Для KIR-генов, также как и для HLA-системы, характерен высокий уровень полиморфизма. Поскольку функциональная активность естественных киллеров регулируется балансом активирующих и ингибирующих сигналов, генетически детерминированное преобладание того или иного сигнала определяет развитие NK-клеточного ответа и обуславливает предрасположенность и/или устойчивость к различным заболеваниям (Vilches С, Parham Р., 2002). В настоящее время активно изучается роль KIR-системы в патогенезе, прогнозе и терапии онкогематологических заболеваний (Verheyden S., 2008; Shahsavar F. et al., 2010).
Учитывая вышеизложенное, оценка индивидуальных генетически детерминированных особенностей противоопухолевого иммунитета у больных ММ и их роли в развитии заболевания на основе изучения комплекса генов, ответственных за процессы тонкой регуляции как врожденного, так и адаптивного иммунного ответа, представляется актуальной.
Целью настоящего исследования явилось определение значимости полиморфизма KIR-генов в сочетании с генами их HLA-лигандов и генов HLA I и II классов в патогенезе, клинических особенностях множественной миеломы и прогнозировании эффективности терапии.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Изучить распределение генов, кодирующих KIR-рецепторы и их лиганды, в восточно-славянской популяции Северо-Западного региона Российской Федерации.
-
Установить роль KIR-генов в сочетании с генами их лигандов в развитии ММ и оценить их влияние на клинические особенности заболевания.
-
Изучить ассоциативные связи HLA-генов I и II класса с риском возникновения и клиническими особенностями ММ.
-
Исследовать влияние генетически детерминированных особенностей регуляции цитолитической активности естественных киллеров на эффективность лечения больных ММ при использовании бортезомибсодержащих режимов терапии.
Научная новизна исследования.
Впервые получены новые научные данные о распределении генов иммуноглобулинподобных рецепторов киллерных клеток и их лигандов в восточно-славянской популяции Северо-Запада России. Установлено, что данная группа сходна с другими европейскими популяциями по частоте встречаемости генов, кодирующих KIR-рецепторы, однако отличается по распределению лигандов для них, что приводит к различиям в частоте функционально значимых пар лиганд-рецептор.
Впервые показано, что KIR-генотип больного относится к числу факторов, влияющих на возникновение, клинические особенности и эффективность терапии ММ. Генетически детерминированная сниженная активность NK-лимфоцитов является фактором риска развития ММ, особенно в возрасте старше 65 лет. Выявлены KIR-гены и функционально значимые сочетания KIR/HLA, ассоциированные с иммунохимическнм вариантом ММ и возрастом начала заболевания.
Проведено молекулярно-генетическое типирование пяти локусов системы HLA: А, В, С, DRB1 и DQB у больных ММ. Получены новые научные данные о наличии ассоциативных связей HLA-специфичностей с возрастом начала заболевания, иммунохимическнм вариантом ММ. Показано, что HLA-DRB1*15, определяющая слабый тип иммунного ответа, является фактором риска развития заболевания у лиц пожилого возраста, тогда как HLA-DRB1*04, связанная с сильным типом иммунного ответа, — в молодом возрасте.
Выявлены ассоциативные связи KIR-генов, KIR-генотипов и сочетаний KIR/HLA с эффективностью терапии. Впервые показано, что наличие
АА-генотипа и преобладание ингибирующих KIR-генов ассоциировано с достижением объективного ответа и является фактором прогноза высокой эффективности терапии бортезомибом.
Практическая значимость. Данные о распределении KIR-генов и их лигандов в популяции Северо-Запада России могут быть использованы как база данных для региональных, федеральных и международных антропологических исследований, в качестве группы сравнения для исследований по проблеме «KIR и болезни», а также для выбора предпочтительных доноров с целью улучшения терапевтического эффекта трансплантации ГСК.
На основании данных исследования доказана целесообразность типирования KIR-генов и их лигандов при ММ, результаты которого могут быть использованы в клинической практике в качестве дополнительных диагностических и прогностических критериев.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Распределение KIR-генов у восточных славян Северо-Запада России имеет основные черты сходства с другими европеоидными популяциями, отличаясь по частоте встречаемости отдельных активирующих генов, и наиболее выраженные отличия от монголоидов и австралоидов. Обследованная группа отличается от других популяций европеоидов по частотам встречаемости генов лигандов для KIR-рецепторов, что приводит к различиям в частоте функционально значимых пар двухдоменных рецепторов с их лигандами, предрасполагающим к большей активности естественных киллеров.
-
Полиморфизм KIR-системы, играющей ведущую роль в регуляции цитолитической активности естественных киллеров, является одним из факторов, определяющих предрасположенность к развитию ММ. Выраженное подавление активности естественных киллеров, связанное с гомозиготностью по функциональному сочетанию KIR2DL1 со своим HLA-лигандом группы С2, является фактором риска развития ММ. Наличие функционального рецептора KIR2DL2/3 (KIR2DL2/3+/HLA-C1+), для которого характерно меньшее подавление активности NK-лимфоцитов, обладает протективным эффектом.
-
Выявлены особенности полиморфизма KIR- и HLA-систем в зависимости от иммунохимических вариантов ММ: развитие миеломы Бенс-Джонса ассоциировано с генетически обусловленной повышенной активностью естественных киллеров и наличием HLA-DRB1*04, тогда как HLA В*27 и HLA-DRB1 *15 ассоциированы с миеломой А.
-
Развитие заболевания в пожилом возрасте ассоциировано с генетически детерминированной сниженной активностью NK-лимфоцитов и присутствием в генотипе HLA-DRB1*15, определяющей слабый тип иммунного ответа. Развитие ММ в возрасте до 50 лет характеризуется преобладанием активирующего воздействия на функциональную активность
естественных киллеров и наличием HLA-DRB1*04, связанной с высоким уровнем иммунного ответа. 5. Генетически детерминированные особенности регуляции цитолитической активности естественных киллеров оказывают влияние на эффективность лечения бортезомибом: объективный ответ ассоциирован с преобладанием ингибирующих KIR-рецепторов, что, вероятно, связано со снижением экспрессии HLA-молекул на миеломных клетках под действием этого препарата, которое способствует активации NK-опосредованного контактного цитолиза. Это позволяет использовать определение KIR-генотипа для прогнозирования эффективности лечения бортезомибом.
Апробация и внедрение результатов исследования. Основные положения диссертационной работы представлены на рабочем совещании «Актуальные вопросы тканевого типирования и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток» (СПб, 2010), 7-ой Международной летней школе по иммуногенетике (Греция, 2010), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Современные проблемы гематологии и трансфузиологии» (СПб, 2011), Международном рабочем совещании по KIR-системе (Швеция, 2011), 5-ом Международном симпозиуме по трансплантации гемопоэтических стволовых клеток памяти P.M. Горбачевой (СПб, 2011).
В работу лаборатории иммуногематологии РосНИИГТ внедрен метод молекулярно-генетического типирования генов, кодирующих KIR-рецепторы и их лиганды, с помощью полимеразной цепной реакции с сиквенс-специфическими праймерами.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 3 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 181 странице машинописного текста и состоит из введения, 7 глав собственных исследований, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 323 источника. Диссертация иллюстрирована 48 рисунками и 67 таблицами.
Личный вклад автора. Автором лично выполнено молекулярно-генетическое типирование KIR-генов и генов их лигандов, генов HLA I (локусов А, В и С) и II (локусов DRB1 и DQB1) классов методом полимеразной цепной реакции с сиквенс-специфическими праймерами (PCR-SSP), включая выделение ДНК, проведение амплификации и разделение продуктов в агарозном геле, у всех обследованных больных ММ и доноров. Проведен клинико-лабораторный анализ, статистическая обработка, анализ полученных данных и обобщение результатов исследования.
