Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1.Этиология и классификация аллергического ринита 12
1.2.Патогенез аллергического ринита 14
1.3. Гены предрасположенности к аллергическому риниту 16
1.3.1. Ген высокоафинного рецептора тучных клеток (FcsRIfi) 17
1.3.2. Ген ADAM33 (A disintegrin and metallopro tease domain 33)... 19
1.3.3. Гены цитокинов и их рецепторов (IL4, IL4Ra, IL13, IL18, IFNG, CCL11.CCL24.CCL26) 21
1.3.4. Гены ферментов биотрансформации ксенобиотиков (CYP1A1, CYP2D6, GSTTJ, GSTM1, MTHFR, CYP2C9, CYP2C19nNAT2) 32
Глава 2. Материалы и методы исследования 48
2.1 .Материалы исследования 48
2.2.Методы исследования 49
2.2.1. Выделение геномной ДНК 49
2.2.2. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК 50
2.2.3. Рестрикционный анализ 51
2.2.4. Метод электрофореза 54
2.2.5. Биочип для анализа полиморфных вариантов в генах системы биотрансформации 54
2.2.5.1. Мультиплексная полимеразная цепная реакция 55
2.2.5.2. Гибридизация, регистрация изображения и обработка полученных результатов 58
2.2.6. Выделение тотальной РНК 60
2.2.7. Синтез кДНК с помощью реакции обратной транскрипции... 63
2.2.8. Полимеразная цепная реакция в реальном времени 63
2.2.9. Статистическая обработка полученных результатов 65
Глава 3. Результаты и обсуждение 70
3.1.Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов цитокинов с аллергическим ринитом в Республике Башкортостан 70
3.1.1. Анализ ассоциации полиморфного варианта -590С> Т гена IL4 с аллергическим ринитом 70
3.1.2. Анализ ассоциации полиморфных вариантов Ile50Val (148 A>G) и Gln576Arg (1652 A>G) гена IL4Ra с аллергическим ринитом 74
3.1.3. Анализ ассоциации полиморфного варианта Argl30Gln (2044 G>A) гена 7X73 с аллергическим ринитом 80
3.1.4. Анализ ассоциации полиморфных вариантов 113 T>G и -133 C>G гена/US с аллергическим ринитом 84
3.1.5. Анализ ассоциации (СА)п повторов гена IFNG с аллергическим ринитом 93
3.1.6. Анализ ассоциации полиморфных вариантов ~384A>G и Ala23Thr (67G>A) гена ССЫ 1с аллергическим ринитом 102
3.2. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков с аллергическим ринитом в Республике Башкортостан 111
3.2.1. Анализ ассоциации полиморфных вариантов 4887С>А, 4889A>G и 6235Т>С гена CYP1A1 с аллергическим ринитом. 111
3.2.2. Анализ ассоциации полиморфных вариантов 430С>Т и 1075А>С гена CYP2C9 с аллергическим ринитом 118
3.2.3. Анализ ассоциации полиморфного варианта 681G>A гена CYP2C19 с аллергическим ринитом 122
3.2.4. Анализ ассоциации полиморфного варианта 1934G>A гена CYP2D6 с аллергическим ринитом 124
3.2.5. Анализ ассоциации делеционного полиморфизма гена GSTM1 с аллергическим ринитом
3.2.6. Анализ ассоциации делеционного полиморфизма гена GSTT1 с аллергическим ринитом 135
3.2.7. Анализ ассоциации полиморфных вариантов 481С>Т, 590G>A и 857G>A гена NAТ2 с аллергическим ринитом 138
3.2.8. Анализ ассоциации полиморфного варианта Ala222Val (677С> Т) гена MTHFR с аллергическим ринитом 147
3.3. Анализ ассоциации полиморфного варианта Glu237Gly {6960A>G) гена FcsRIp с аллергическим ринитом 153
3.4. Анализ межгенных взаимодействий в формировании наследственной предрасположенности к развитию аллергического ринита 156
3.5.Анализ экспрессии генов цитокинов в клетках слизистой оболочки носа и лейкоцитах периферической крови у больных АР и в контрольной группе 167
3.5.1. Анализ экспрессии гена 7X7 J в клетках слизистой оболочки носа и лейкоцитах периферической крови у больных АР и в контрольной группе 168
3.5.2. Анализ экспрессии гена ILJ8 в клетках слизистой оболочки носа и лейкоцитах периферической крови у больных АР и в контрольной группе 173
3.5.3. Анализ экспрессии гена CCL11 в клетках слизистой оболочки носа и лейкоцитах периферической крови у больных АР и в контрольной группе 179
Заключение 186
Выводы .> 191
Список литературы
- Гены предрасположенности к аллергическому риниту
- Биочип для анализа полиморфных вариантов в генах системы биотрансформации
- Анализ ассоциации полиморфного варианта -590С> Т гена IL4 с аллергическим ринитом
- Анализ ассоциации полиморфного варианта Glu237Gly {6960A>G) гена FcsRIp с аллергическим ринитом
Введение к работе
Актуальность проблемы
Аллергический ринит (АР) - это заболевание, характеризующееся IgE-опосредованным воспалением, развивающимся в результате попадания аллергенов на слизистую оболочку носа, и наличием следующих симптомов: заложенность носа, ринорея, чихание, зуд в полости носа, снижение обоняния [Van Cauwenberge Р.В. et al., 2001].
Распространенность аллергического ринита за прошедшее столетие выросла в десятки раз. В мире этим заболеванием страдают 10-30% населения всех возрастных групп, а в России, по данным Института иммунологии РАМН, распространенность АР в различных регионах среди взрослого населения колеблется от 12,7 до 24%, среди детского населения -от 15 до 28,7% [Ильина Н.И., 2000; Белозеров Е.С. и соавт., 2005; Salib R.J. et al., 2003]. Симптомы, развивающиеся при АР, не являются угрожающими для жизни, однако связаны с различными ограничениями в физических, психологических и социальных аспектах жизни, являются причиной существенного снижения качества жизни, нарушений сна и в тяжелых случаях создают трудности в обучении и профессиональной карьере больного [Лопатин А.С, 2003]. Важность данной проблемы обусловлена еще и тем, что АР тесно связан с такими весьма распространенными заболеваниями, как острый и хронический риносинусит, аллергический конъюнктивит, а также является одним из факторов риска развития бронхиальной астмы (БА). Известно, что 32-64% больных АР страдают БА, в то же время 75% больных БА имеют АР [Лусс Л.В., 2003; Белозеров Е.С. и соавт., 2005; Pawankar R., 2006].
В настоящее время признана точка зрения, согласно которой АР является многофакторным заболеванием. Наряду с факторами окружающей среды, большая роль в развитии данного заболевания отводится наследственной предрасположенности. На сегодняшний день известно
7 множество генов-кандидатов АР, белковые продукты которых участвуют в его патогенезе, при проведении полно-геномных скринингов выявлен ряд ДНК-локусов, сцепленных с заболеванием. Установлена ассоциация АР и характерного для данного заболевания высокого уровня общего сывороточного IgE с полиморфными локусами генов цитокинов, играющих важную роль в развитии аллергического воспаления - IL4, IL4Ra, ILJ3, ILJ8, ССЫ1, с геном высокоафинного рецептора тучных клеток FcsRIfl [Nataga Н. et al., 2001; Kruse S. et al., 2003; Shin H.D. et al., 2003; Loza M.J. et al., 2007; Apter A.J. et al., 2008; Huebner M. et al., 2008]. Показана важность изучения факторов предрасположенности к аллергии, реализующихся под воздействием окружающей среды на организм - генов, кодирующих ферменты биотрансформации ксенобиотиков [Вавилин В.А. и соавт., 2002; Carroll W., 2005]. Однако, результаты многочисленных исследований противоречивы, молекулярно-генетические основы формирования заболевания пока изучены недостаточно. Все это превращает АР в серьезную медико-социальную проблему и диктует необходимость исследования причин и механизмов развития данного заболевания для разработки адекватных лечебно-профилактических мероприятий, учитывающих этническую принадлежность и генетические особенности больных.
В РБ молекулярно-генетическое изучение АР ранее не проводилось и выявление полиморфных вариантов генов-кандидатов, наиболее значимых в развитии заболевания, представляет собой актуальную задачу, как для фундаментальной науки, так и практической медицины.
В связи с вышеизложенным были определены цели и задачи исследования.
Цель работы: анализ роли полиморфных вариантов генов цитокинов и генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в развитии аллергического ринита в Республике Башкортостан.
8 Задачи исследования:
Провести у детей, больных аллергическим ринитом, и в соответствующей контрольной группе из РБ:
Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов цитокинов: IL4 (-590С>Т), IL4Ra (IleSOVal, Gln576Arg), IL13 {ArgBOGln), IL18 (~133C>G, 1J3T>G), IFNG {{CA\ повторы) и CCL11 (~384A>G, Ala23Thr).
Анализ полиморфных локусов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков CYP1A1 (4887С>А, 4889A>G, 6235Т>С), CYP2C9 {430ОТ, 1075С>Т), CYP2C19 (681G>A), CYP2D6 (1934G>A), GSTM1 (делеция), GSTT1 (делеция), NAT2 (481С>Т, 590G>A, 857G>A), MTHFR {677 ОТ).
Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного варианта Glu237Gly гена высокоаффинного рецептора тучных клеток FcsRip.
Анализ ассоциаций исследованных полиморфных вариантов генов и возможных их сочетаний с риском развития аллергического ринита с учетом этнической принадлежности анализируемых групп, уровня общего сывороточного IgE, наличия отягощенной по атопическим заболеваниям наследственности.
5. Анализ роли межгенных взаимодействий полиморфных вариантов
генов цитокинов и генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков
в развитии аллергического ринита.
6. Анализ экспрессии генов IL13, IL18, ССЫ1 в клетках слизистой
оболочки носа и лейкоцитах периферической крови.
Научная новизна исследования.
Впервые собрана коллекция ДНК детей, больных АР, и соответствующей контрольной группы без атопических заболеваний, проживающих в РБ. Проведен анализ ассоциаций полиморфных локусов генов цитокинов, генов, кодирующих ферменты биотрансформации
9 ксенобиотиков, гена высокоафинного рецептора тучных клеток с АР. Установлены ключевые межгенные взаимодействия, детерминирующие риск развития АР. Впервые определен уровень экспрессии генов ILJ3, ILJ8, CCLJJ в клетках слизистой оболочки носа и лейкоцитах периферической крови у больных АР и индивидов контрольной группы из РБ. Показано, что полиморфные варианты генов IL4Ra, ILJ3, IL18, IFNG, ССЫ1, CYP1A1, CYP2D6, GSTM1, NAT2, MTHFR участвуют в формировании генетической структуры предрасположенности к аллергическому риниту в нашей республике.
Научно-практическая значимость работы.
Результаты работы вносят вклад в общее представление о генетических основах предрасположенности к АР. Впервые получены статистические оценки частот аллелей и генотипов исследуемых ДНК-локусов у больных АР и выявлены генетические маркеры предрасположенности к заболеванию у детей в РБ. Данные диссертационной работы могут послужить основой для последующих исследований по определению генетических факторов риска развития АР. Результаты исследования также могут быть использованы при чтении спецкурсов на факультетах биологии, в медицинских ВУЗах, на курсах повышения квалификации медицинских работников.
Положения, выносимые на защиту:
Маркеры повышенного риска развития аллергического ринита у индивидов татарской этнической принадлежности - аллель IL4Ra*50Val, генотип IL13*130Gln/Gln, маркеры пониженного риска -аллельIL4Ra*50Ile, генотипыIFNG* 13/13 и CYP1A1*1A/1A.
Ассоциация генотипов IL18*-133G/G и NAT2*5/6 с высоким уровнем общего IgE, генотипа GSTM1*+/+ - с умеренно-повышенным уровнем общего IgE, гаплотипа IL18*J J3T/-J33C гена IL18 - с низким уровнем общего IgE в сыворотке крови.
Маркеры повышенного риска развития аллергического ринита у индивидов с отягощенной по атопии наследственностью - генотипы
10 IL18*-133G/G и GSTM1*+/+, маркеры пониженного риска -генотипы GSTMl*0/0 и MTHFR*222Ala/Val.
Маркеры повышенного риска развития аллергического ринита у мальчиков - генотип CYP2D6*1934G/G и аллель CYP2D6*1934G, маркер пониженного риска - аллель CYP2D6*1934A. Маркер повышенного риска развития аллергического ринита у девочек -генотип CCL11*-384G/G.
Межгенное взаимодействие полиморфных вариантов генов цитокинов IL4Ra, IL13, IL18 в детерминации риска развития аллергического ринита. Сочетания полиморфных ДНК-локусов генов цитокинов -IL4, IL4Ra, 1Ы8 и CCL1, ассоциированные с высоким уровнем общего сывороточного IgE. Комбинации полиморфных вариантов генов цитокинов и генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков -IL4, IL4Ra, CCL11, NAT2 и CYP1A1, предрасполагающие к развитию аллергического ринита у индивидов с отягощенной по атопии наследственностью.
Повышение уровня экспрессии генов IL13, IL18 и CCL1J в клетках слизистой оболочки носа у больных с тяжелым течением аллергического ринита в период обострения заболевания.
Гены предрасположенности к аллергическому риниту
Высокоафинный рецептор к IgE, расположенный на тучных клетках, базофилах, моноцитах, клетках Лангерганса и играющий центральную роль в IgE-зависимом аллергическом ответе, имеет 4 цепи: а-цепь с двумя внеклеточными доменами, с помощью которых рецептор взаимодействует с доменами Сє2 и Сє2 IgE, р-цепь, 4 раза пронизывающую мембрану, и две у цепи, которые передают сигнал в клетку [Sandfor A.J. et al., 1993; Ярилин А.А., 1999]. Р-цепь, усиливающая сигнал у-цепи, является ключевой молекулой в развитии аллергических реакций [Sandfor A.J. et al., 1993].
Ген FceRJp, протяженностью 10 т.п.о., состоит из 7 экзонов [Kuster Н. et al., 1992], расположен в регионе llql3, для которого впервые была показана связь с атопией [Cookson W.O. et al., 1988]. Предполагается, что полиморфные варианты гена FceRIft могут влиять на развитие атопии посредством усиления высвобождения медиаторов воспаления тучными клетками или стимуляции экспрессии IL4 и СО40-лиганда [Hopkin J.M., 1996].
В 6 экзоне гена FceRIfi путем прямого секвенирования были обнаружены однонуклеотидные полиморфизмы, приводящие к замене аминокислот Ilel81Leu и Vall83Leu. Для аллеля FceRIp 181Leu показана достоверная ассоциация с высоким уровнем IgE и положительными аллергопробами к пыльце растений в выборке неродственных лиц из Англии [Shirakawa Т. et al., 1994]. В популяции Австралии было выявлено, что гаплотип FceRI(3 181Leu/ 183Leu является маркером повышенного риска развития атопии [Hill M.R. et al., 1995]. В 1996 году был открыт новый полиморфный вариант 6960A G, приводящий к замене Glu237Gly в 7 экзоне гена FceRIfi, по которому у австралийцев была обнаружена достоверная ассоциация с положительными аллергопробами к пыльце растений и антигенам клеща домашней пыли [Hill M.R. et al., 1996]. Позже данные о взаимосвязи замены Glu237Gly и атопии подтвердились: у японцев при АР аллель FcERI/3 237Gly достоверно ассоциирован с высоким уровнем специфического к аллергенам клеща домашней пыли IgE [Nataga Н. et al., 2001]. In vitro было установлено, что полиморфные варианты Ilel81Leu, Vall83Leu и Glu237Gly не влияют на экспрессию или функционирование гена FcsRIp [Dormadieu Е. et al., 2000; Furumoto Y. et al., 2000]. С целью разрешения данных противоречий Nishiyama и соавт. исследовали однонуклеотидные замены в некодирующем регионе данного гена, сцепленные с полиморфным локусом Glu237Gly. Авторы проанализировали корреляцию между уровнем экспрессии гена FceRI/3 и заменой Glu237Gly, которая сама по себе не влияет на уровень экспрессии, но тесно сцеплена с полиморфными вариантами -426Т С и -654С Т в промоторном регионе. Было выявлено, что гены, несущие аллели FceRJfi -426C и FceRI[3 -654T, имеют более высокую транскрипционную активность, чем гены, имеющие аллели FcRI/3 -426T и FceRip -654C. В данной работе также показано, что экспрессия гена FcsRIfi в базофилах значительно выше у индивидов, имеющих более редкий гетерозиготный по данным аллельным вариантам генотип, чем у гомозит [Nishiyama С. et al., 2004].
В 2005 году Miyahara и соавт. в опытах с трансгенными мышами доказали, что FceRI играет основную роль в развитии ранней фазы аллергического воспаления при АР и вносит также существенный вклад в развитие поздней фазы, тем самым подтверждая необходимость дальнейшего изучения гена, кодирующего данный белковый продукт [Miyahara S. et al., 2005].
Таким образом, описанные выше данные демонстрируют, что полиморфные варианты гена FcsRIfi, влияя на интенсивность высвобождения медиаторов воспаления в результате повышения реактивности рецептора, могут оказывать существенное влияние на развитие обеих стадий аллергической реакции при АР.
Биочип для анализа полиморфных вариантов в генах системы биотрансформации
Исследование однонуклеотидных замен и делеций в восьми генах ФБК: CYP1A1 (4887С А, 4889A G, 6235T Q, CYP2D6 (1934G A\ GSTT1 (делеция), GSTM1 (делеция), MTHFR (677C T), CYP2C9 (430OT, 1075A Q, CYP2C19 (681G A) и NAT2 {481C T, 590G A, 857G A) проводилось при помощи биочипа, созданного в лаборатории биологических микрочипов ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН. Олигонуклеотиды для иммобилизации на микрочипе были синтезированы на автоматическом синтезаторе 394
DNA/RNA Synthesizer (Applied Biosystems, США) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. На 3 -конце олигонуклеотидов находился спейсер со свободной аминогруппой, который вводили при синтезе с помощью З -Amino-Modifier С7 CPG 500 (Glen Research, США) [Глотов А.С. и др., 2005]. Схема биочипа представлена на рисунке 2.1.
Необходимые для анализа фрагменты ДНК нарабатывали посредством двухэтапной мультиплексной ПНР. Типы изученных полиморфных варинтов и последовательности олигонуклеотидных праймеров приведены в таблице 2.3. [Глотов А.С. и др., 2005]. С целью повышения эффективности мультиплексной ПЦР гены объединяли в группы, соответствующие блокам олигонуклеотидных проб на биочипе. В группу 1 (блок 1) вошли следующие гены: CYP1A1 (48870А, 4889A G, 6235Т С) и CYP2D6 {1934G A и DelA2637), в группу 2 (блок 2) - GSTM1 (делеция), GSTT1 (делеция), в группу 3 (блок 3) - NAT2 (481 ОТ, 590G A, 857G A) и MTHFR (6770Т), в группу 4 (блок 4) - CYP2C9 (430ОТ, 1075А С) и CYP2C19 (68Ю А).
На первой стадии мультиплексной ПЦР амплифицировали фрагменты генов, входящих в блоки 1, 3, 4; на второй стадии - в блоки 1-4. Реакционная смесь (25 мкл) на первом этапе ПЦР содержала 10 пкмоль каждого праймера, 67 мМ TrisHCl (рН 8.6), 166 мМ (NH4)2S04, 0.01% Тритон Х-100, 1,5 мМ MgCb, 0,2 мМ каждого из dNTP (Силекс, Россия) и 2,5 ед. акт. Taq-полимеразы (Силекс, Россия). Для амплификации использовали программируемый термоциклер фирмы «Biometra», Termocycler 1 (США). Реакцию проводили в следующем режиме: предварительная денатурация ДНК при 94С (5 мин), далее 40 циклов амплификации по следующей схеме: 94С, 30 сек., 60С, 30 сек., 72С, 1 мин.; далее 72С, 5 мин.
Продукт первого этапа ПЦР (2,5 мкл) использовали в качестве матрицы на втором этапе ПЦР, который проводили в реакционной смеси того же состава, но добавляли по 50 пкмоль флуоресцентно меченных праймеров и по 5 пкмоль немеченых праймеров, чтобы получить избыток флуоресцентно меченного одноцепочечного ПЦР-продукта. Реакцию проводили в следующем режиме: предварительная денатурация ДНК при 94С (5 мин), далее 40 циклов амплификации по следующей схеме: 94С, 30 сек.; 62С, 30 сек.; 72С, 1 мин.; далее 72С, 5 мин.
Для гибридизации на микрочипе использовали флуоресцентно меченые образцы, полученные на второй стадии мультиплексной ПЦР. Гибридизационная смесь общим объемом 40 мкл состояла из 10 мкл формамида (Serva, США), 10 мкл 20х SSPE (Promega, США) и 20 мкл амплификата (по 5 мкл образца из каждой мультиплексной реакции). Гибридизационную смесь полностью денатурировали при 95С (5 мин.), быстро охлаждали на льду (1 мин.), наносили на биочип и оставляли на ночь при 37С. Затем чип отмывали в lx SSPE в течение 10 мин. при комнатной температуре и высушивали. Флуоресцентный сигнал от ячеек микрочипа регистрировали с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного камерой ПЗС и программным обеспечением ImageWare (Биочип-ИМБ, Россия). Пример гибридизационной картины, анализируемой с Номенклатура аллелей генов CYP1A1, CYP2C9, NAT2
В гене CYP1A1 с помощью биочипа можно анализировать полиморфные участки 4887С А, 4889A G и 6235Т С, что позволило выявить мутантные аллели этого гена: CYP2C9 2A (CYPJAJ6235 C), CYP2C9 2B (CYP1A14889 G + CYP1A16235 C), CYP2C9 2C (CYP1A14889 G), CYP2C9 4 (CYP1A14887 A), и аллель дикого типа CYP2C9 1A {CYP1A14887 C + CYP1A14889 A + CYP1A16235 T) [Labuda D. et al., 1999; http://www.cypalleles.ki.se/cyplal.htm]. Использование микрочипов позволяет анализировать полиморфные участки 430С Т и 1075А С в гене CYP2C9 и выявлять два мутантных аллеля этого гена CYP2C9 2 {CYP2C9430 T) и CYP2C9 3 (CYP2C1075 Q, а также аллель дикого типа CYP2C9 ! (CYP2C9430 C + CYP2C1075 A) [Wen S.Y. et al., 2003; http://www.cypalleles.ki.se/cyp2c9.htm].
Анализ ассоциации полиморфного варианта -590С> Т гена IL4 с аллергическим ринитом
Исследование однонуклеотидных замен и делеций в восьми генах ФБК: CYP1A1 (4887С А, 4889A G, 6235T Q, CYP2D6 (1934G A\ GSTT1 (делеция), GSTM1 (делеция), MTHFR (677C T), CYP2C9 (430OT, 1075A Q, CYP2C19 (681G A) и NAT2 {481C T, 590G A, 857G A) проводилось при помощи биочипа, созданного в лаборатории биологических микрочипов ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН. Олигонуклеотиды для иммобилизации на микрочипе были синтезированы на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA Synthesizer (Applied Biosystems, США) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. На 3 -конце олигонуклеотидов находился спейсер со свободной аминогруппой, который вводили при синтезе с помощью З -Amino-Modifier С7 CPG 500 (Glen Research, США) [Глотов А.С. и др., 2005]. Схема биочипа представлена на рисунке 2.1.
Мультиплексная полимеразная цепная реакция
Необходимые для анализа фрагменты ДНК нарабатывали посредством двухэтапной мультиплексной ПНР. Типы изученных полиморфных варинтов и последовательности олигонуклеотидных праймеров приведены в таблице 2.3. [Глотов А.С. и др., 2005]. С целью повышения эффективности мультиплексной ПЦР гены объединяли в группы, соответствующие блокам олигонуклеотидных проб на биочипе. В группу 1 (блок 1) вошли следующие гены: CYP1A1 (48870А, 4889A G, 6235Т С) и CYP2D6 {1934G A и DelA2637), в группу 2 (блок 2) - GSTM1 (делеция), GSTT1 (делеция), в группу
На первой стадии мультиплексной ПЦР амплифицировали фрагменты генов, входящих в блоки 1, 3, 4; на второй стадии - в блоки 1-4. Реакционная смесь (25 мкл) на первом этапе ПЦР содержала 10 пкмоль каждого праймера, 67 мМ TrisHCl (рН 8.6), 166 мМ (NH4)2S04, 0.01% Тритон Х-100, 1,5 мМ MgCb, 0,2 мМ каждого из dNTP (Силекс, Россия) и 2,5 ед. акт. Taq-полимеразы (Силекс, Россия). Для амплификации использовали программируемый термоциклер фирмы «Biometra», Termocycler 1 (США). Реакцию проводили в следующем режиме: предварительная денатурация ДНК при 94С (5 мин), далее 40 циклов амплификации по следующей схеме: 94С, 30 сек., 60С, 30 сек., 72С, 1 мин.; далее 72С, 5 мин.
Продукт первого этапа ПЦР (2,5 мкл) использовали в качестве матрицы на втором этапе ПЦР, который проводили в реакционной смеси того же состава, но добавляли по 50 пкмоль флуоресцентно меченных праймеров и по 5 пкмоль немеченых праймеров, чтобы получить избыток флуоресцентно меченного одноцепочечного ПЦР-продукта. Реакцию проводили в следующем режиме: предварительная денатурация ДНК при 94С (5 мин), далее 40 циклов амплификации по следующей схеме: 94С, 30 сек.; 62С, 30 сек.; 72С, 1 мин.; далее 72С, 5 мин.
Для гибридизации на микрочипе использовали флуоресцентно меченые образцы, полученные на второй стадии мультиплексной ПЦР. Гибридизационная смесь общим объемом 40 мкл состояла из 10 мкл формамида (Serva, США), 10 мкл 20х SSPE (Promega, США) и 20 мкл амплификата (по 5 мкл образца из каждой мультиплексной реакции). Гибридизационную смесь полностью денатурировали при 95С (5 мин.), быстро охлаждали на льду (1 мин.), наносили на биочип и оставляли на ночь при 37С. Затем чип отмывали в lx SSPE в течение 10 мин. при комнатной температуре и высушивали.
Анализ ассоциации полиморфного варианта Glu237Gly {6960A>G) гена FcsRIp с аллергическим ринитом
Интерлейкин-4 индуцирует дифференцировку CD4 Т-лимфоцитов в ТЬ2-клетки (Т-хелперы второго типа) и подавляет развитие ТЫ (Т-хелперов первого типа), стимулирует пролиферацию и дифференцировку В-лимфоцитов, способствует продукции IgE В-лимфоцитами, поддерживает пролиферацию серозных тучных клеток. Благодаря этим свойствам, имеющим прямое отношение к развитию аллергических реакций, интерлейкин-4 играет ключевую роль в патогенезе АР [Белозеров Е.С. с соавт., 2005].
Нами проведен анализ однонуклеотидной замены -590С Т, локализованной в промоторной области гена IL4, у пациентов с АР и в контрольной группе из РБ (табл. 3.1.1). Ассоциация этого полиморфного варианта с атопией была показана в популяциях евреев, проживающих в США, англичан, проживающих на юге Великобритании, и японцев [Rosenwasser L.J. et al., 1995; Noguchi E. et al., 1998 ; Beghe B. et al., 2003], однако в ряде других исследований, проведенных в Великобритании и Австралии, а также позже в Италии, данная ассоциация не была выявлена [Walley A J. et al., 1996 ; Rigoli L. et al., 2004].
С целью выявления маркеров повышенного и пониженного риска формирования предрасположенности к АР в Республике Башкортостан, проведен анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного варианта -590С Т гена IL4 в объединенных выборках больных АР и контрольной группы, в результате которого не выявлено статистически значимых различий между сравниваемыми группами (р 0,05). В обеих группах преобладающим по частоте оказался аллель IL4 -590C, встречающийся в 67,34% случаев у больных и в 69,27% случаев в контроле. По данным литературы, в европеоидных популяциях также чаще встречается аллель IL4 -590C (70-82%), тогда как в азиатских и афро-американских популяциях выше частота аллеля IL4 -590T(54-83%) [Noguchi Е. et al., 1998; Beghe В. et al., 2003; He J-Q. et al., 2003].
Учитывая неоднородность населения Республики Башкортостан в этническом отношении, в исследуемые выборки были включены индивиды наиболее многочисленных этнических групп Башкортостана: русских, татар и башкир. Основную часть больных АР составили индивиды русской и татарской этнической принадлежности, в связи с чем, с целью выявления маркеров повышенного и пониженного риска развития АР в данных этнических группах, было проведено сравнение распределения частот аллелей и генотипов полиморфных ДНК-локусов как между контрольными группами русских и татар, так и между выборками больных АР и индивидов контрольных групп соответствующей этнической принадлежности. Таблица 3.1.1. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта -590ОТ гена IL4 в выборках больных аллергическим ринитом и индивидов контрольной группы различной этнической принадлежности
Генотип,аллель Больные (в целом) Контроль (в целом) Русские с АР Русские контроль Татары с АР Татары контроль N - объем выборки; р, - частота аллеля (генотипа); sp - ошибка р,; CI % Примечание к табл. (здесь и далее): п, - численности групп; доверительный интервал При сравнении распределения частот аллелей и генотипов полиморфного варианта -590С Т гена IL4 между контрольными группами русских и татар обнаружено, что у первых с большей частотой встречался генотип IL4 -590C/C (52,27% и 40,0%, соответственно), тогда как у вторых -генотип IL4 -590T/T (12,31% и 3,41%, соответственно), однако различия оказались статистически незначимыми (% =2,26, р=0,133 и % =3,2, р=0,07). У лиц русской этнической принадлежности по сравнению с татарами в группе контроля была выше частота аллеля IL4 —590C и ниже частота аллеля IL4 -590Т - 1А,ЛЪ% и 25,57%,соответственно, тогда как у индивидов татарской этнической принадлежности частоты аллелей распределились следующим образом: 63,85% и 36,15% х2=3,98, р=0,046. Распределение частот аллелей и генотипов данного локуса между больными АР русской и татарской этнической принадлежности статистически значимо не различалось (р 0,05). Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного варианта -590С Т гена IL4 у больных АР и контроля соответствующей этнической принадлежности не выявил статистически достоверных различий ни у русских, ни у татар (р 0,05). В выборке больных АР русской этнической принадлежности частота гомозиготного по редкому аллелю генотипа IL4 — 590Т/Т была выше - 10,66%, чем в соответствующей контрольной группе — 3,41% (различия оказались статистически незначимыми: % =2,85, р=0,09). У татар же, напротив, генотип IL4 -590T/T встречался чаще в контрольной группе - 12,31%, чем у больных - 7,04% (различия также не достигли уровня статистической значимости -х2-0,56, р=0,452).
С целью выявления тендерных различий в распределении частот аллелей и генотипов описываемого полиморфного локуса и определения маркеров повышенного и пониженного риска формирования развития АР у мальчиков и у девочек, сравнивали выборки контрольных групп мальчиков и девочек, а также больных АР с контрольной группой согласно их половой принадлежности. В таблице 1 (приложение, табл.1) представлено распределение частот аллелей и генотипов замены -590С Т у пациентов с АР и индивидов контрольной группы в зависимости от половой принадлежности. Тендерных различий в исследованных группах больных и контроля выявлено не было, также как и при сравнении групп больных АР с контрольными индивидами соответствующего пола (р 0,05).
Для выявления аллелей и генотипов, ассоциированных с повышенным уровнем общего IgE в сыворотке крови, с отягощенной по атопии наследственностью сравнивали соответствующие группы больных АР с выборкой индивидов контрольной группы без атопических заболеваний, имеющих уровень общего сывороточного IgE в пределах нормы. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного локуса -590С Т гена IL4 между этими группами больных АР и выборкой контроля оказалось схожим (р 0,05) (приложение, табл.2.). Таким образом, в результате проведенного анализа не было выявлено ассоциации полиморфного варианта -590С Т гена IL4 с АР в РБ.
