Введение к работе
Актуальность темы. Создание генетически модифицированной птицы рассматривается в качестве одной из перспективных технологий синтеза рекомбинатных белков [Mizmrai S. et al, 2001; Harvey A. et al, 2002; Mozdziak P.E. et al, 2003; Kamihira M. et al, 2005; Kawabe Y. et al, 2006; Сураева H.M., 2008]. К важным преимуществам данной технологии производства рекомбинатных протеинов по сравнению с созданием животных-биореакторов следует отнести короткий генерационный интервал сельскохозяйственной птицы, позволяющий получать стадо продуцентов уже через полгода после получения родоначальников (для сравнения, получение стада продуцентов крупных сельскохозяйственных животных - коров, коз, свиней - требует до 3-5 лет), высокую белоксинтезирующую способность птицы, а также отсутствие патогенной микрофлоры в белке яйца. Вышеназванные преимущества обуславливают относительно невысокую стоимость получаемых рекомбинантных протеинов: затраты на производство 1 грамма рекомбинантного белка составляют около 10-25 центов, в то время как при использовании для этих целей молочной железы трансгенных животных стоимость возрастает до 100 долларов [Das R. С, 2001].
Традиционный метод получения трансгенных животных -микроинъекция ДНК в пронуклеус зиготы - является малоэффективным для получения трансгенной птицы. Это связано, прежде всего, с особенностями ее воспроизводства и развития, а именно с трудностями точного определения времени овуляции, большим количеством желтка в яйцеклетке, сильным уплотнением цитоплазмы в районе пронуклеусов. Все это требует поиска и разработки альтернативных методов переноса ДНК, одним из которых является использование векторов на основе рекомбинантных ретровирусов.
Цель и задачи исследований. Исходя из вышеизложенного, целью диссертационной работы являлось изучение факторов, влияющих на результативность генетической трансформации эмбриональных клеток кур с использованием ретровирусных векторов.
Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:
-
Изучить компетентность эмбриональных клеток кур к рекомбинантным ретровирусным векторам in vitro.
-
Определить факторы, влияющие на результативность введения рекомбинантных ретровирусов в эмбриональные клетки кур (способ и период введения, концентрация и тип используемого препарата).
-
Изучить результативность генетической трансформации модифицированными ретровирусами эмбрионов кур in vivo.
-
Оценить влияние генно-инженерных манипуляций на развитие эмбрионов кур.
-
Провести анализ интеграции и экспрессии рекомбинантной ДНК в органах и тканях трансгенных кур.
Научная новизна. Впервые исследованы механизмы доставки рекомбинантной ДНК в эмбриональные клетки кур посредством использования ретровирусных векторов, изучено влияние проводимых генно-инженерных манипуляций на эмбриогенез кур. Выявлены факторы, влияющие на эффективность генетической модификации эмбрионов кур in vivo. Дана характеристика паттернов интеграции и экспрессии рекомбинантных генов (lacZ, инсулин и гормон роста) в различных органах и тканях полученной трансгенной птицы.
Практическая значимость. Усовершенствован метод получения трансгенных кур, основанный на использовании ретровирусных векторов. Предложен усовершенствованный способ введения ретровирусных векторов в эмбрионы кур in vivo. Оптимизированы отдельные этапы технологической цепочки создания трансгенной птицы, позволяющей получать трансгенных кур с интеграцией и экспрессией генов инсулина и гормона роста в ряде внутренних органов: печени, кишечнике, яйцеводе и репродуктивных органах, а также в мышечной ткани.
Основные положения, выносимые на защиту
Опосредованный ретровирусами перенос генов как результативный способ генетической трансформации эмбриональных клеток кур in vitro и in vivo.
Способ подготовки, состав инъекционного препарата, стадии введения ретровирусных векторов в эмбрионы кур in vivo как факторы, влияющие на результативность получения трансгенной птицы.
Характер интеграции и экспрессии рекомбинантной ДНК в органах и тканях трансгенных кур.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2006, 2008гг.; «Актуальные проблемы биологии в животноводстве», Боровск, 2006 г.
Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы, в том числе в центральных научных журналах, рекомендованных ВАК - 1.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 109 страницах, содержит 9 таблиц, 24 рисунка, 9 графиков, 1 схему. Библиографический список содержит 110 источников, в том числе 90 на иностранных языках.
