Введение к работе
Актуальность проблемы. Гены, обеспечивающие сохранение, передачу и реализацию наследственной информации характеризуются широким спектром плейотропных эффектов. Именно такие гены обеспечивают системный контроль генетических процессов в клетке и относятся к эволюционно древним, проявляя удивительный консерватизм. Достижения геномики делают особенно актуальным изучение структуры и функции подобных генов, используя преимущества модельных объектов.
Гены семейства nxf описанные у большинства эукариот от дрожжей до человека, вовлечены в контроль экспорта различных мРНК из ядра в цитоплазму (Herold et al., 2003). У D.melanogaster ортологом генов nxfl является ген sbr (Herold et al., 2000; Третьякова и др, 2001; Wilkie et al., 2001), поэтому ген sbr получил еще одно название - Dm nxfl. Универсальной функцией гена Dm nxfl и его ортологов у человека (Hs nxfl) и мыши (Mm nxfl) является транспорт мРНК из ядра в цитоплазму (Kang and Cullen, 1999; Herold et al., 2003; Sasaki et al., 2005).
Исходя из универсальной функции, продукты генов nxfl относят к транспортным рецепторам, состоящим, по крайней мере, из двух частей. Первая -рецепторная - определяет взаимодействие с РНК (взаимодействие может быть специфичным - это узнавание последовательности СТЕ (constitutive transport element), и не специфичным - через адапторные молекулы) (Hautbergue et al., 2008). Вторая - транспортная - обеспечивает взаимодействие с нуклеопоринами -белками ядерных поровых комплексов с тем, чтобы переместить комплекс, содержащий мРНК, из ядра в цитоплазму (Braun et al., 2001, 2002). Затем, как правило, фактор NXF1 покидает транспортируемый комплекс и возвращается обратно в ядро (Palacios, 2002). Важно отметить, что не все мРНК приступают к трансляции сразу после выхода из ядра в цитоплазму. С существованием долгоживущих и временно не транслируемых мРНК связывают возникновение семейства генов nxf и появление генов-паралогов, контролирующих судьбу мРНК в цитоплазме (Jim et al., 2001; Tretyakova et al., 2005; Lai et al., 2006; Takano et al., 2007; Katahira et al., 2008). Специализация факторов NXF как рецепторов мРНК может проявляться не только в существовании семейства генов nxf но и в том, что генам nxf соответствует, как правило, несколько продуктов.
Исследования на мутантах показали, что под контролем гена Dm nxfl (sbr) находятся два фундаментальных клеточных процесса: реакция клетки на действие теплового стрессора (Евгеньев, Левин, 1980; Евгеньев, Денисенко, 1990) и расхождение хромосом в процессе клеточных делений (Мамон и др., 1990; Никитина и др., 2003; Кьергаард, Мамон, 2007; Golubkova et al., 2006; 2009).
Существование сложных межаллельных взаимодействий и доминантных аллеле-специфичных признаков позволило высказать предположение о том, что гену Dm nxfl, помимо известной универсальной функции - обеспечения ядерно-цитоплазматического транспорта мРНК, свойственны и специализированные функции, одна из которых - контроль расхождения хромосом в клеточных делениях. Основой широкого спектра плейотропных эффектов может быть полиморфизм продуктов гена, обеспечивающий их специализацию.
С усложнением организации живых систем часто возникают потребности в специализации универсальных функций. Эволюция генов в основном идет по пути объединения и возникновения новых комбинаций элементарных функций (Long et al., 2003). Объединение элементарных функций при формировании гена порождает ситуацию, при которой отдельные мутации могут нарушать конкретную элементарную функцию, не затрагивая остальные (Dudley et al., 2005; van de Peppel, Holstege, 2005). В этом случае плейотропные эффекты гена отражают его полифункциональность и могут проявляться как аллеле-специфичные.
Настоящая работа направлена на определение путей формирования специализированных функций гена Dm nxfl у D.melanogaster, нарушение которых приводит к плейотропным эффектам. Вследствие эволюционной консервативности семейства генов nxf выявленные с использованием модельного объекта закономерности имеют общебиологическое значение.
Цель работы заключается в определении молекулярных механизмов плейотропного действия эволюционно консервативного гена Dm nxfl (sbr) D.melanogaster, вовлеченного в контроль важнейших клеточных процессов: реакции клетки на действие стрессора, ядерно-цитоплазматического транспорта мРНК и расхождения хромосом в клеточных делениях.
Задачи:
-
Определить плейотропные эффекты гена Dm nxfl (sbr) D.melanogaster и исследовать их механизмы.
-
Оценить характер взаимоотношений между нарушением реакции клетки на действие стрессора и хромосомной нестабильностью.
-
Исследовать механизмы хромосомной нестабильности у мутантов по гену Dm nxfl (sbr) D.melanogaster, отвечающему за экспорт различных мРНК из ядра в цитоплазму.
Научная новизна. Впервые показано, что мутации эволюционно консервативного гена Dm nxfl (sbr) у Drosophila melanogaster нарушают расхождение хромосом в клеточных делениях и вызывают характерные изменения веретена первого деления мейоза у самок. Данные эффекты можно рассматривать как проявление специализированной функции исследуемого гена наряду с другими аллеле-специфичными эффектами.
Выявлен полиморфизм мРНК Dm nxfl. Большинство специфичных транскриптов гена Dm nxfl D.melanogaster выявлено впервые.
Использование полученных нами антител к С-терминальному фрагменту белка Dm NXF1 позволило методом Вестерн-блот анализа впервые идентифицировать специфичный для семенников короткий белковый продукт гена Dm nxfl наряду с универсальной его формой. Существование полиморфизма продуктов гена Dm nxfl свидетельствует о возможных путях специализации факторов NXF в пределах данного семейства белков.
Секвенированы участки ДНК, соответствующие рецессивным летальным аллелям гена sbr (Dm nxfl), и показана роль нарушений С-терминальной
половины белка Dm NXF1 в определении плейотропных доминантных эффектов этих аллелей.
Теоретическое и практическое значение работы.
Эволюционная консервативность структуры и функции белков семейства NXF делает результаты исследований важными для понимания роли данных белков не только у D.melanogaster, но и у других организмов, включая человека. Доминантные проявления мутантных аллелей гена Dm nxfl (нарушение расхождения хромосом в клеточных делениях, мужская стерильность и нарушение сексуального поведения) позволяют рассматривать гены семейства nxf в качестве генов-кандидатов при определении генетических основ соответствующих наследственных патологий у человека.
Интерес к генам, вовлеченным в контроль расхождения хромосом в клеточных делениях, определяется, прежде всего, тем, что с нарушением числа хромосом связано подавляющее большинство раковых заболеваний у человека (Hartwell, Kastan, 1994; Lengauer et al., 1998; Cahill et al, 1999; Sen, 2000; Nowak et al., 2002; Atkin, 2003). И если раньше полагали, что анеуплоидия является следствием злокачественного перерождения клетки, то в настоящий момент появляется все больше данных, свидетельствующих о том, что анеуплоидия может быть причиной рака (Marx, 2001; Atkin, 2003; Копнин, 2007).
Выявление механизмов плейотропного действия генов, основанных на аллеле-специфичных проявлениях, позволяет определять структурно-функциональные элементы гена, что важно при создании рекомбинантных генетических конструкций в генной инженерии и разработке методов молекулярной диагностики наследственных патологий человека.
Основные положения, выносимые на защиту:
Жизненно важный эволюционно консервативный ген small bristles (sbr) D.melanogaster, относящийся к семейству генов nxf (Nuclear eXport Factor), отвечает не только за транспорт большинства типов мРНК из ядра в цитоплазму, но и вовлечен в регуляцию расхождения хромосом в клеточных делениях. Продукт гена sbr (Dm nxfl) участвует в формировании аппарата деления клетки, влияя на поведение хромосом в мейозе и эмбриональных митозах. Полученные нами результаты позволяют отнести sbr к уже известным генам, выполняющим в клетке двойственную функцию: не только ядерно-цитоплазматический транспорт мРНК, но и транспорт хромосом к полюсам деления клетки. Появление в эволюции транспортных систем, выполняющих такую двойственную функцию, связано с возникновением ядерной оболочки и обособлением ядра в виде самостоятельного клеточного компартмента. Названные транспортные системы в процессе функционирования в клеточном цикле сменяют друг друга, используя общие структурно-функциональные модули.
Полиморфизм транскриптов и белковых продуктов, описанный для гена Dm nxfl, отражает характер эволюционной дивергенции и специализации транспортных рецепторов, принадлежащих семейству NXF и обеспечивающих перемещение в клетке различных мРНК.
На основе полученных данных сформулирована гипотеза о том, что продукты гена Dm nxfl кроме универсальной функции - обеспечение ядерно-
цитоплазматического транспорта большинства мРНК из ядра в цитоплазму -выполняет и специализированные цитоплазматические функции, по-видимому, связанные с транспортом, сохранением в нетранслируемом состоянии особых мРНК или их деградацией. Присутствие подобных мРНК, относящихся к классу долгоживущих или локализованных, является характерной особенностью половых, эмбриональных нервных и стволовых клеток, а также необходимо при формировании аппарата деления клетки.
Данное предположение основывается на плейотропных эффектах мутантых аллелей гена Dm nxfl, таких как повышенная частота анеуплоидных потомков, аномалии веретена первого деления мейоза у самок, нарушение эмбриональных митозов, женская и мужская стерильность, нарушение памяти, временная атаксия.
Выполняя специализированные функции, фактор Dm NXF1 может входить в состав или участвовать в формировании макромолекулярных комплексов РНП, представляющих собой эволюционно древний способ хранения, передачи и реализации наследственной информации, не утративший своего значения в стволовых, нервных, генеративных и эмбриональных клетках.
Апробация работы: Материалы диссертации были представлены на следующих отечественных и международных конференциях и симпозиумах: Всесоюзном симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Гродно, 1990); Всесоюзном совещании «Генетика развития растений и животных» (Ташкент, 1990); Всесоюзной конференции по генетике и цитологии мейоза (Новосибирск, 1990); Всесоюзной конференции по генетике насекомых (Москва, 1991); Международной конференции "Гипоксия в медицине" (Москва, 1996); Международной конференции «Molecular chaperones and the heat shock response», Cold Spring Harbor Lab., (Нью Йорк, 1996); 37-й, 38-й, 39-й, 40-й, 41-й, 42-й, 43-й, 44-й, 45-й. 46-й Ежегодных конференциях по исследованиям на дрозофиле (Сан Диего, 1996; Чикаго, 1997; Вашингтон, 1998; Белевью, 1999; Питтсбург, 2000; Вашингтон, 2001; Сан Диего, 2002; Чикаго, 2003; 2004; Сан-Диего, 2005); 26-м Ежегодном совещании EEMS (Рим,1996); 15-й Европейской исследовательской конференции (Варна, Болгария, 1997); Съездах ВОГиС (Санкт-Петербург, 2000; Москва, 2004; Москва, 2009); 17-й Европейской дрозофилиной конференции (Эдинбург, 2001); Международной конференция «Генетика в России и мире» (Москва,2006); 20-м Международном конгрессе по генетике (Берлин, 2008); Международном научно-методическом семинаре «Современные методы микроскопии в исследовании живых систем» (Санкт-Петербург, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 56 печатных работ, из них 25 статей в реферируемых отечественных и зарубежных журналах, рекомендованных перечнем ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключения и выводов, а также списка цитированной литературы, насчитывающего 640 источников. Работа изложена на 310 страницах машинописного текста, включая приложение, иллюстрирована 52 рисунками и 14 таблицами.
