Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Молекулярно-генетическое исследование гена лейцинбогатой киназы 2 (lrrk2) у лиц с болезнью паркинсона Иванова Ольга Николаевна

Молекулярно-генетическое исследование гена лейцинбогатой киназы 2 (lrrk2) у лиц с болезнью паркинсона
<
Молекулярно-генетическое исследование гена лейцинбогатой киназы 2 (lrrk2) у лиц с болезнью паркинсона Молекулярно-генетическое исследование гена лейцинбогатой киназы 2 (lrrk2) у лиц с болезнью паркинсона Молекулярно-генетическое исследование гена лейцинбогатой киназы 2 (lrrk2) у лиц с болезнью паркинсона Молекулярно-генетическое исследование гена лейцинбогатой киназы 2 (lrrk2) у лиц с болезнью паркинсона Молекулярно-генетическое исследование гена лейцинбогатой киназы 2 (lrrk2) у лиц с болезнью паркинсона
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Иванова Ольга Николаевна. Молекулярно-генетическое исследование гена лейцинбогатой киназы 2 (lrrk2) у лиц с болезнью паркинсона : диссертация ... кандидата медицинских наук : 03.00.15 / Иванова Ольга Николаевна; [Место защиты: ГУ "Медико-генетический научный центр РАМН"].- Москва, 2008.- 89 с.: ил.

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 13

1.1. Клинические аспекты БП 13

1.1.1. Клиническая характеристика БП 13

1.1.2. Патогенез БП 15

1.2. Генетические аспекты БП 21

1.1.3. Наследственность в этиологии БП 21

1.2.2. Генетические факторы риска развития мультифакториальных форм БП 22

1.2.3. Локусы ответственные за развитие моногенных форм БП 24

1.2.4. Ген лейцинбогатой киназы 2 {LRRK2, дардарин) 27

1.2.5. Нейрогистологическая картина мозга пациентов БП

с мутациями в гене LRRK2 30

1.2.6. Функции дардарина и влияние мутаций в TQHeLRRK2 на активность белка 31

1.2.7. Гипотетические молекулярные механизмы гибели дофаминергических нейронов при БП 33

1.3. Диагностика и лечение БП 36

Глава 2. Материалы и методы 41

2.1. Характеристика обследованных групп 41

2.2. Выделение ДНК из периферической крови человека 43

2.3. Идентификация мажорных мутаций в гене LRRK2 методом ПНР и рестрикционного анализа

2.3.1. Идентификация мутации G2019S 44

2.3.2. Идентификация мутаций R1441C/G/H 46

2.3.3. Идентификация мутаций I2020T, 12012Т

2.4. Секвенирование экзонов гена LRRK2 49

2.5. Идентификация мутации V1613A гена LRRK2 52

2.6. Статистический анализ 54

Глава 3. Результаты и обсуждение 55

3.1. Сопоставление клинического течения заболевания у пациентов с БП в зависимости от выбранных параметров 55

3.1.1. Наличие семейного анамнеза 55

3.1.2. Возраст начала заболевания 57

3.1.3. Пол 58

3.1.4. Наличие семейного анамнеза и возраста начала заболевания 59

3.2 Поиск мутаций в гене LRRK2 у больных БП с семейной формой заболевания 63

3.2.1. Семьи с БП, обусловленной мутацией G2019S 65

3.2.2. Семья с мутацией V1613A 67

3.3.Особенности течения БП у лиц с семейной формой заболевания, обусловленной мутациями в гене LRRK2 69

3.3.1. Мутация G2019S 69

3.3.2. Мутация V1613A

3.4. Поиск мутаций в гене LRRK2 у больных БП со спорадической формой заболевания 78

3.5. Клиническое течение БП у лиц со спорадической формой заболевания, обусловленной мутацией в гене LRRK2 81

3.6. Сопоставление клинического течения БП у лиц с мутацией в гене LRRK2 и у лиц с БП отличной этиологии 83

Выводы 86

Практические рекомендации 88

Список литературы

Введение к работе

Актуальность проблемы.

Болезнь Паркинсона (БП) – одно из наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний среднего и пожилого возраста, впервые была описана Джеймсом Паркинсоном в 1817 году как дрожательный паралич. БП является хронической неуклонно прогрессирующей болезнью, которая встречается во всех популяциях мира. Частота встречаемости данного заболевания среди лиц старше 65 лет составляет 1-3% (Mata I.F. et al., 2005; Zhu X. et al., 2006). Основным в клинике БП является следующий симптомокомплекс: повышенный тонус скелетной мускулатуры по экстрапирамидному типу, пониженная двигательная активность (брадикинезия), низкочастотный тремор покоя конечностей и других частей тела, постуральная неустойчивость. Диагноз БП может быть поставлен только при наличии не менее двух из указанных симптомов. Однако, клинический диагноз, даже при развернутой картине заболевания не всегда находит нейрогистопатологическое подтверждение (Bennet D.A. et al., 1996; Bower J.H. et al., 2002).

Морфологическая картина при БП включает прогрессирующую гибель дофаминергических нейронов компактной части черной субстанции (ЧС), что приводит к резкому снижению концентрации дофамина в полосатом теле, а также наличие внутриклеточных эозинофильных включений в сохраненных нейронах, получивших названия телец Леви.

Необходимо также отметить, что симптомокомплекс БП проявляется при гибели 80% дофаминергических нейронов ЧС мозга человека. Процесс нейродегенерации начинается задолго до дебюта заболевания, а когда оно становиться явным, патогенетическая терапия может быть уже не эффективной. В арсенале медицины существует метод диагностики, который позволяет поставить диагноз БП до появления клинических симптомов - позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ). ПЭТ позволяет прижизненно изучать структурно-функциональное состояние церебральных нейротрансмиттерных структур. Широкое применение данного метода в клинической практике ограничено, так как ПЭТ относиться к дорогостоящим методам и в ряде случаев является не точным (Savitt J.M. et al., 2006). Таким образом, поиск маркеров БП, позволяющих проводить раннюю диагностику заболевания, а также при необходимости дифференциальную диагностику БП с другими неврологическими заболеваниями со сходными клиническими проявлениями - остается крайне актуальным.

Достижения молекулярной генетики последних лет позволили по-новому взглянуть на проблемы этиопатогенеза, нозологической принадлежности и диагностики БП. Хотя в большинстве случаев БП носит мультифакториальный характер, около 15% больных БП имеют семейную форму БП, когда заболевание имело место у нескольких родственников из одного или разных поколений (Gasser T., 2007). Описаны семьи, где наследование заболевания происходит как по аутосомно-рецессивному, так и по аутосомно-доминантному типу.

За последние 11 лет описано одиннадцать генетических локусов, ответственных за развитие моногенных форм БП (Dawson T.M., 2007). В шести случаях удалось идентифицировать конкретные гены и провести детекцию мутаций у больных. Мутации в генах паркина (PARK2), PTEN-индуцированной киназы 1(PINK1) и DJ-1 выявлены при аутосомно-рецессивной форме БП, и мутации в генах альфа-синуклеина (SNCA), убиквитин-С-концевой гидролазы L1 (UCH-L1), лейцинбогатой киназы 2 (LRRK2) при аутосомно-доминантной форме заболевания (Gasser T., 2007). ДНК-анализ в семьях с известной молекулярной природой БП может использоваться для доклинической диагностики данного заболевания, что позволит проводить у пациентов активное профилактическое лечение, своевременно начать адекватную симптоматическую терапию.

По существующим данным наиболее частым молекулярным дефектом, ответственным за развитие наследственной формы БП, являются мутации в гене лейцинбогатой киназы 2 (LRRK2, локус PARK8), кодирующем белок, названный дардарином (Gasser T., 2007). Исследование мутаций гена LRRK2 и их изучение стало возможным после картирования хромосомного локуса PARK8 в 2002 году (Funayama M. et al., 2002). В 2004 году впервые обнаружена сегрегация мутаций в гене LRRK2 c БП в семьях (Paisan-Ruis C. et al., 2004; Zimpritch A. et al., 2004). В настоящее время у больных с аутосомно-доминантной формой БП, выявлен ряд аминокислотных замен в кодирующей области гена. В гене имеются мажорные мутации (G2019S, R1441C/G, Y1699C, I2020T), обнаруживаемые у больных БП в различных популяциях (Giasson B.I., Van Deerlin V.M., 2008). Наиболее распространенной из всех описанных в гене LRRK2 мутаций среди больных БП является мутация G2019S, которая встречается в европейских популяциях в 5-7% случаев семейной БП, но также была обнаружена в 0.6-1.6% спорадических случаев (Di Fonso A. et al., 2005; Gilks W. et al., 2005). В некоторых изолированных популяциях, например, среди арабов северной Африки и евреев-ашкенази, частота данной мутации среди семейных форм БП достигает 30-40% (Lesage S. et al., 2005; Ozelius L.J. et al., 2006). В то же время мутация G2019S не обнаружена в некоторых азиатских популяциях ( et al., 2005; et al., 2006). Остальные мутации оказались менее распространенными, однако в ряде случаев их частота показывала сильные межпопуляционные различия. Так, неожиданно высокая частота мутации R1441G (16.4% и 4% среди семейных и спорадических форм БП, соответственно) была обнаружена среди популяции басков в Испании ( J. et al., 2006).

Кодирующая область гена LRRK2 содержит 51 экзон (2527 аминокислот). Несмотря на большую протяженность гена, в ряде популяций был определен полный спектр мутаций среди больных БП (Mata I.F. et al., 2005; Di Fonzo A. et al., 2006; Paisan-Ruiz C. et al., 2008). Определение популяционной специфичности мутаций является необходимым условием для проведения молекулярной диагностики заболевания и внедрения методов ДНК-диагностики в клиническую практику. Разработка молекулярных методов диагностики БП остается особенно актуальной в силу отсутствия широкодоступных диагностических маркеров, позволяющих осуществлять диагностику заболевания на ранних стадиях БП. До настоящего времени в России спектр мутаций в гене LRRK2 среди больных БП остается неизвестным.

Изложенные выше данные явились основанием для проведения настоящего исследования.

Цель исследования.

Выявление мутаций в гене лейцинбогатой киназы 2 (LRRK2) у лиц с БП и сопоставление клинического течения заболевания у больных БП, имеющих мутации в гене LRRK2, и пациентов с БП отличной этиологии.

Задачи исследования.

  1. Сопоставление клинического течения БП в зависимости от пола пациентов, возраста начала заболевания и наличия у них семейного анамнеза.

  2. Разработка молекулярно-генетических методов идентификации мажорных мутаций (G2019S, R1441C/G/H, I2020T, I2012T) в гене LRRK2 и их скрининг в группе пациентов с БП и в контрольной группе.

  3. Поиск мутаций в кодирующей области гена LRRK2 у пациентов с семейной формой БП.

  4. Разработка методов идентификации выявленных мутации на основе метода ПЦР с последующим рестрикционным анализом и их скрининг в группе пациентов со спорадической формой БП и в контрольной группе.

  5. Молекулярно-генетическое и неврологическое обследование семей пробандов с выявленными мутациями в гене LRRK2, а также сопоставление клинического течения БП, обусловленной известным молекулярным дефектом в гене LRRK2 и БП отличной этиологии.

Научная новизна.

Впервые в России проведено определение спектра мутаций в гене LRRK2 у больных с БП. У больных с семейной формой БП выявлены мутации G2019S и V1613A. Мутация V1613A в гене LRRK2 описана впервые в мире. У больных со спорадической формой БП впервые в России выявлены мутации G2019S и R1441С. Впервые в России проведено сопоставление течения заболевания у больных с выявленными мутациями в гене LRRK2 с больными БП отличной этиологии. Впервые в мире среди больных с БП, обусловленной мутацией G2019S, отмечено преобладание побочных эффектов от терапии Л-ДОФА-содержащими препаратами. Разработаны простые методы идентификации мутаций (G2019S, R1441C/G/H, I2020T, I2012T, V1613A) в гене LRRK2 на основе ПЦР и рестрикционного анализа.

Практическая значимость работы.

В данной работе охарактеризован спектр мутаций в гене LRRK2 среди больных БП Северо-Западного региона России. Разработанные нами методы экспресс-тестирования мутаций в гене LRRK2 могут быть использованы в клинической практике при выявлении наследственных форм БП, обусловленных мутациями в гене LRRK2. Это позволит проводить ДНК-диагностику членов семей больных БП, обусловленной мутациями в этом гене, и осуществлять постановку на учет к невропатологу носителей мутаций до начала проявления клинических симптомов заболевания. Такой подход может способствовать повышению эффективности лечения БП.

Основные положения, выносимые на защиту.

  1. В клинической картине БП выявлено преобладание определенных симптомов заболевания у пациентов в зависимости от пола, возраста начала заболевания и наличия семейного анамнеза.

  2. Среди больных семейной формой БП Санкт-Петербурга выявлено пять семей, в которых развитие БП обусловлено ранее описанной мутацией G2019S в гене LRRK2. В трех случаях из пяти клиническое течение БП в этих семьях не отличалось от классической БП.

  3. Впервые обнаружена новая мутация V1613A, приводящая к развитию семейной формы БП с преобладающим тремором.

  4. У больных со спорадической формой БП выявлены ранее известные мутации в гене LRRK2: G2019S и R1441С.

  5. В группе больных с БП, обусловленной мутациями в гене LRRK2, наблюдается повышенная частота побочных эффектов при применении Л-ДОФА-содержащих препаратов.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации.

Неврологический осмотр пациентов с БП и забор венозной крови выполнены автором лично. Разработка методов ПЦР и рестрикционного анализа, скрининг мутаций в группе пациентов с БП и в контрольной группе проведены автором лично. Автор провел статистический анализ всех полученных данных и сформулировал выводы. Описание собственных исследований, анализ и обсуждение результатов выполнены автором самостоятельно.

Апробация работы.

Предложенные к защите результаты были доложены на II международном молодежном медицинском конгрессе “Санкт-Петербургские научные чтения”, Санкт-Петербург, СПбГМУ им.акад.И.П.Павлова (2007), научно-практической конференции молодых ученых “Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины”, СПбМАПО (2007), конференции “Фундаментальные науки-медицине”, РАН, Москва (2006), 11 международной пущинской школе-конференции молодых ученых “Биология наука ХХI века”, Москва (2007), I национальном конгрессе (с международным участием) по болезни Паркинсона и расстройствам движения, Москва (2008).

Публикации.

Результаты диссертационной работы отражены в 11 печатных работах соискателя, в том числе опубликовано 5 статей, 3 в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата медицинских наук.

Внедрение результатов работы в клиническую практику.

Методы ДНК-диагностики, разработанные на основе ПЦР с последующим рестрикционным анализом, внедрены в работе СПбГМУ имени акад. И.П. Павлова для диагностики семейных форм БП, обусловленной мутациями в гене LRRK2.

Структура и объем диссертации.

Клиническая характеристика БП

Диагностика БП затруднена, особенно в случаях ее атипичного течения. Окончательный клинический диагноз может быть поставлен на основе данных аутопсии. Нейрогистопатологическое исследование ткани ЧС мозга позволяет оценить не только наличие процессов нейродегенерации, а также выявить присутствие в нейронах эозинофильных цитоплазматических включений, так называемых телец Леви (рис. 1). Однако, данные цитоплазматические включения характерны не только для БП. Они также обнаруживаются при болезни Альцгеймера, хорее Гентингтона и других нейродегенеративных заболеваний головного мозга (Лосано, Калиа, 2005). Тельца Леви являются цитоплазматическими агрегатами, содержащими множество различных белков, из которых альфа-синуклеин является основным. В настоящее время активно дискуссируется значимость обнаружения телец Леви для постановки диагноза БП, поскольку тельца Леви отсутствуют при некоторых наследственных формах БП. До сих пор, не известно являются ли эти включения причиной деструктивных изменений или же всё-таки выполняют защитные функции, удерживая аномальные, токсичные для нейрона белки от распространения по всей клетке (Лосано, Калиа, 2005).

Открытие молекулярной природы редких моногенных форм БП внесло значительный вклад в современные представления об этиологии данного заболевания и о механизмах нейродегенерации. В настоящее время описано одиннадцать генетических локусов, ответственных за развитие Л-ДОФА чувствительного паркинсонизма (таблица 1). В шести случаях удалось идентифицировать конкретные гены и провести детекцию мутаций у больных. Причины развития большинства спорадических форм БП остаются неясными. Предполагается, что они носят мультифакториальный характер, то есть в основе их развития лежит взаимодействие наследственных факторов с факторами окружающей среды. Для объяснения причин развития БП предложен ряд гипотез, включающих гипотезы нарушения механизмов внутреннего дыхания митохондрий, оксидативного стресса, нарушения обмена железа, длительного контакта с нейротоксинами. Эти гипотезы не являются взаимоисключающими и несколько механизмов одновременно могут участвовать в формировании риска заболевания.

Для БП характерно снижение активности митохондриального комплекса I в дофаминергических нигростриальных нейронах и не обнаружено в других отделах мозга. Дефект комплекса I вызывает ослабление дыхания нейрональных митохондрий и снижение продукции АТФ, что приводит к уменьшению энергетического потенциала и усилению накопления кислородных форм свободных радикалов (Крыжановский и др., 2002; Dawson et al., 2003). В качестве возможных причин респираторной недостаточности митохондрий рассматриваются как генетические, так и экзогенные факторы.

Дофаминергическая природа нигральных нейронов при недостаточности активности естественных антиоксидантных систем создает предпосылки для развития окислительного стресса. Это связано с образованием токсических продуктов в процессе метаболизма дофамина. При недостаточности внутринейрональной системы защиты происходит интенсивная продукция перекиси водорода и ее превращение в высокотоксичные гидроксильные радикалы, что обуславливает развитие окислительного стресса (Крыжановский и др., 2002).

После открытия нейротоксического действия митохондриального яда 1 метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП), вызывающего селективную гибель дофаминергических нейронов ЧС, широкое распространение получила гипотеза действия экзогенных нейротоксинов. Отмечая структурное сходство МФГҐ и НАД4" ионов, можно предположить, что МФГҐ ингибирует НАД-связанные ферменты митохондриальной цепи окислительного фосфорилирования. Было показано, что МФГҐ ингибирует активность комплекса I цепи окислительного фосфорилирования, что может приводить к дисфункции митохондрий и увеличению количества супероксидных радикалов (Dawson et al., 2003).

Кроме того, интенсивно проводится поиск средовых факторов риска развития БП. К числу последних относятся гербициды и пестициды (гербицид паракват, ротенон); контакт с некоторыми тяжелыми металлами (марганец) и переходными металлами (железо, медь) (Крыжановский и др., 2002; Левин, Докадина, 2005).

В последнее время в литературе увеличивается число данных, указывающих на то, что центральным звеном патогенеза БП является накопление агрегатов альфа-синуклеина (этот белок кодируется геном SNCA) в цитоплазме дофаминергических нейронах ЧС, хотя остается неизвестным какая именно форма альфа-синуклеина (протофибриллы или агрегаты) является нейротоксичной (рис. 2) (Singleton, 2005).

Альфа-синуклеин является белком пресинаптических нервных терминал ей, размером 144 аминокислот (Лосано, Калиа, 2005). Альфа-синуклеин широко представлен в различных нейронах мозга человека. Необходимо подчеркнуть, что в настоящее время моногенные формы БП, обусловленные мутациями в гене SNCA, остаются крайне редкими (Лосано, Калиа, 2005). Несмотря на низкую частоту мутационных повреждений гена SNCA при моногенных формах БП, альфа-синуклеин, по-видимому, играет существенную роль в патогенезе заболевания. Так, альфа-синуклеин является одним из основных компонентов телец Леви не только у пациентов с семейными, но и со спорадическими формами БП.

Идентификация мажорных мутаций в гене LRRK2 методом ПНР и рестрикционного анализа

Отбор лиц с БП осуществлялся в городе Санкт-Петербурге на базе консультативно-диагностического центра Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И.П.Павлова. Критериями отбора служило сочетание хотя бы двух фенотипических проявлений, характерных для БП: гипокинезия, ригидность скелетной мускулатуры, тремор покоя и постуральная нестабильность. Пациенты проходили регулярный неврологический осмотр, а также лабораторно-инструментальную диагностику: электроэнцефалограмму, эхоэнцефалоскопию, ультразвуковую доплерографию сосудов головного мозга; часть из них магнитно-резонансную томографию головного мозга. При треморной форме БП у пациента исключали патологию щитовидной железы с помощью ультразвукового исследования щитовидной железы и определения уровня тиреойдных гормонов в крови. Эти исследования использовались для подтверждения диагноза БП. На базе Санкт-Петербургского НИИ мозга человека РАН у больных с треморной формой БП проводилась компьютерная тензотреморография (д.б.н., СП. Романов) верхних конечностей с последующим анализом спектра частот.

В результате клинико-неврологического обследования были отобраны 274 пробандов и 4 родственника с БП. В данную группу вошли 163 женщины и 115 мужчин. Среди обследуемых больных БП 31 человек имели акинетико-ригидную форму БП, 63- ригидно-треморную форму БП, 89- акинетико-ригидно-треморную форму БП, 88- треморную форму БП, 7- акинетико-треморную форму БП. Средний возраст обследуемых больных 63,5±10,2 года. Средний возраст начала заболевания 5 5,2± 12,5 лет. Среди обследованных 88 (31,6%) пациентов имели БП с ранним началом (до 50 лет). В обследованной группе лиц с БП 89 пациентов имели отягощенный наследственный анамнез по БП с аутосомно-доминантным характером наследования (из них 85 пробанда и 4 родственника) и 189 пациентов -спорадическую форму. Характер наследования определялся при проведении клинико-генеалогического исследования. Клиническая характеристика групп представлена в таблице 2.

Ригидно-треморная форма БП 9 (10,1%) 54 (28,6%) Контрольная группа состояла из 161 индивидуумов старше 85 лет, состоящих на учёте в Санкт-Петербургском Городском Гериатрическом Центре. Все члены контрольной группы проходили обследование у невролога с целью исключения диагноза БП и других нейродегенеративных заболеваний. Данная выборка является спорадической и принадлежит к тому же географическому региону, что и включенная в анализ группа лиц с БП.

Во всех обследованных группах был осуществлен забор крови для последующего молекулярно-генетического анализа. Данная работа одобрена этическим комитетом СПбГМУ им.акад.И.П.Павлова, протокол №79 от 20 февраля 2007 года.

У лиц исследуемой группы был осуществлен забор крови из локтевой вены в объеме 10-15 мл в стерильные пластиковые пробирки, содержащие 100 мкл 0,5 М ЭДТА (рН 8.0) в качестве антикоагулянта. Собранная таким образом кровь замораживалась и хранилась при температуре -20С.

Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции (Маниатис и др., 1984). Лизис клеток проводили по методу Канкеля (Lahiri et al., 1992): к 500 мл крови добавляли 500 мкл раствора для лизиса эритроцитов (29 mM Tris-HCl рН 7.4, 10 тМ NaCl, 3 тМ MgCl2, 5% сахароза, 1% тритон XI00), инкубировали в течение 5 мин., осторожно перемешивая, затем центрифугировали 10 мин. при +9С, 4000 об/мин. Супернатант сливали и ресуспендировали осадок лейкоцитов в растворе для лизиса мембран (29 mM Tris-HCl рН 7.4, 10 тМ NaCl, 1 тМ MgCl2, 0.25 М сахароза). Смесь центрифугировали при тех же условиях, супернатант сливали. К осадку добавляли 300 мкл раствора для протеиназы К (0.01 М Tris-HCl, 0.01 М NaCl, 0.01 М ЭДТА рН 8/0), 30 мкл 30% SDS и протеиназу К до конечной концентрации 100 мкг/мл. Смесь инкубировали в течение 2-3 часов при +50С для протеолиза. Получившийся в результате гомогенный раствор последовательно обрабатывали 300 мкл фенола, 300 мкл смеси фенол-хлороформ в соотношении 1/1, 300 мкл хлороформа. После каждой экстракции в течение 10 мин при аккуратном перемешивании смесь центрифугировали 10 мин. при +20С 4000 об/мин и отбирали водную фазу. По окончании экстракции к водной фазе добавляли 1/10 объема З М ацетата натрия и 2 объема 96% этанола. Осадок дважды промывали 70% этанолом и, высушив в термостате, растворяли в 100 мкл стерильной воды. Выход ДНК в результате такой очистки составлял 40-50 мкг ДНК из 500 мкл цельной крови.

В процессе выделения ДНК были использованы реактивы фирмы «Вектон», Санкт-Петербург, Россия и «Serva», Германия.

Для поиска мутаций G2019S в экзоне 41 гена LRRK2 был разработан метод ПЦР с введением сайта рестрикции для эндонуклеазы BsuRI в амплифицируемый фрагмент и последующего рестрикционного анализа ПЦР-продуктов с использованием данной эндонуклеазы. Для амплификации соответствующего фрагмента гена LRRK2 были подобраны следующие праймеры (GenBank AY792511):

FOR 5 - tatataccgagacctgaaacccca -3 , (5970-5993) REV 5 - cccattctacagcagtactgagcaaGg -3 , (6057-6083) Подчеркнутое G заменяет Т для создания сайта рестрикции для эндонуклеазы BsuRI в аллелях дикого типа. Транзиция G6055A, соответствующая аминокислотной замене G2019S, приводит к исчезновению сайта рестрикции для эндонуклеазы BsuRI (рис. 6).

Поиск мутаций в гене LRRK2 у больных БП с семейной формой заболевания

Течение БП у лиц с семейной формой заболевания, обусловленного мутацией G2019S в гене LRRK2, представлено в таблице 10. Данные генетические изменения были обнаружены в пяти семьях. Семья 1 (PD1). Больной X. (PD1 II-1) страдал акинетико-ригидной формой БП. Заболевание началось в 67 лет, и первым клиническим симптомом заболевания была легкая брадикинезия. У пациента не было направленной антипаркинсонической терапии, периодически принимал ноотропные препараты. Заболевание прогрессировало медленно, усиливалась гипокинезия и общая астения, добавились постуральные нарушения. Пациент умер в возрасте 84 лет от острой сердечной недостаточности. Известно, что наследственный анамнез отягощен, но более точных сведений получить не удалось. В последующем поколении БП проявилась четко только у сына. Умер больной в 2007 году, причина летального исхода - острый панкреатит.

Его сын, больной Ж. (PD1 III-1), 51 года, также страдает БП. Заболевание началось в 35 лет. Первым клиническим проявлением заболевания (как и у отца) была брадикинезия, к которой в течение нескольких лет добавилось легкое повышение мышечного тонуса по экстрапирамидному типу в обеих нижних конечностях. В течение последующих лет, несмотря на направленную терапию, заболевание прогрессировало: появилась все усиливающаяся гипомимия, олиго-брадикинезия, ригидность скелетной мускулатуры охватила все конечности и мышцы туловища, появилось типичное дрожание верхних конечностей. В последние годы все проявления болезни усилились, появился симптом «зубчатого колеса» в луче-запястных и локтевых суставах, а также положительный назо-лабиальный рефлекс. Пациент длительно принимал холинолитические препараты и Л-ДОФА-содержащие препараты; в настоящее время суточная доза доведена до 1250 мг в день. На фоне приема Л-ДОФА у пациента уменьшаются ригидность скелетной мускулатуры и олиго-брадикинезия, побочных эффектов в виде дистонии или гиперкинезов нет. Но, вероятно, из-за длительного непрерывного приема Л-ДОФА, пять лет назад у пациента появились психические изменения, основным элементом которых является астения и депрессивный синдром. Пациенту регулярно оказывалась помощь в условиях психиатрического стационара. Был проведен неврологический осмотр дочери и внука больного (неврологической патологии нет) и молекулярно-генетическое тестирование мутации С20198-мутации не выявлено. Родословная данной семьи представлена на рис. 14.

Семья 2 (PD2). Больной К. (PD2 Ш-2), 70 лет, длительно находился под наблюдением в консультативно-диагностическом центре Санкт-Петербургского Университета имени акад. И.П.Павлова. Из наследственного анамнеза известно, что у бабушки пациента по материнской линии дрожание рук (по описанию - паркинсонического типа) возникло в старости в возрасте около 70 лет; у тети пациента (сестры матери) в возрасте 60 лет появилось дрожание головы. Точных сведений о характере и течении их экстрапирамидной патологии нет, но есть основания считать, что дрожательный синдром был его единственным проявлением. Пациент К. считает себя больным с 50 лет, когда без видимых причин появилось дрожание левой руки, вначале слабо выраженное и непостоянное. Впервые осмотрен нами на пятом году заболевания. В неврологическом статусе на момент осмотра: типичный тремор покоя левых конечностей, усиливающийся при пробах, легкая брадикинезия, постуральная нестабильность; патологических пирамидных знаков и рефлексов оральной группы мышц не выявлено. В последующие годы заболевание прогрессировало, появились повышение мышечного тонуса по экстрапирамидному типу в левых конечностях, появилась дисфония, сгорбленность; брадикинезия и тремор усилились, но правая половина тела в патологический процесс осталась не вовлеченной. Пирамидных и мозжечковых знаков, признаков психической нестабильности нет. Пациент длительно принимает Л-ДОФА-содержащие препараты в сочетании с холинолитическими препаратами. На фоне комплексной фармакотерапии брадикинезия почти полностью исчезла, уменьшился патологический мышечный тонус в левых конечностях. Четкого эффекта «включения -выключения» у Л-ДОФА-содержащих препаратов не наблюдается. Существенного влияния на тремор не получено. Больной активен, себя обслуживает полностью. Побочных явлений при приеме Л-ДОФА-содержащих препаратов (суточная доза 750 мг/сут.) нет. Проведено молекулярно-генетическое тестирование мутации G2019S у детей больного К. Была обнаружена мутация в гетерозиготном состоянии у его сына (40 лет); у дочери (32 лет) мутации не оказалось. При неврологическом обследовании - данных за неврологическую патологию у них нет. Родословная семьи представлена на рис. 14.

Клиническое течение БП у лиц со спорадической формой заболевания, обусловленной мутацией в гене LRRK2

Клиническое течение БП у лиц со спорадической формой заболевания, обусловленной мутацией в гене LRRK2 представлено в таблице 11.

У больного 3., 75 лет, была выявлена мутация R1441C. Дебют заболевания в 61 год с тремора в правой руке. На момент осмотра у больного имеется паркинсонический тремор и ригидность скелетной мускулатуры обеих верхних конечностей, данные симптомы более выраженные с правой стороны. Л-ДОФА-содержащие препараты не принимал.

У больной Г., 60 лет, была выявлена мутация G2019S. Дебют заболевания в 47 лет. Первые клинические проявления в виде неуверенных движений в левой ноге и нарушение походки. Через 3 года появилась скованность в левой руке и дрожание левых конечностей. Через 10 лет с момента начала заболевания аналогичные проявления появились в правой руке. На момент осмотра у больной: гипокинезия, паркинсонический тремор конечностей, более выраженный в левых конечностях, ригидность скелетной мускулатуры, более выраженная в левых конечностях, постуральная нестабильность. На фоне длительного приема больших доз (1,4 грамма Л-ДОФА в сутки) Л-ДОФА-содержащих препаратов появились дискинезии в виде размашистого гиперкинеза головы и конечностей.

Мутации в гене LRRK2 встречаются как при семейной форме БП, так и в спорадических случаях. Из литературных источников известно, что клиническое течение заболевания (в случае моногенных форм БП) у носителей мутации с семейной формой БП не отличается от течения БП в спорадических случаях (Gasser, 2007). В данном исследовании течение заболевания у больного со спорадической формой БП, обусловленной мутацией G2019S в гене LRRK2, не отличалось от выше описанных семейных случаев.

Haugarvoll К. с соавторами сопоставил течение заболевания у 33 человек с БП, обусловленной мутацией R1441C, и у больных со спорадической формой БП (Haugarvoll et al., 2008). Клиническое течение БП, обусловленной мутацией R1441C было идентично течению заболевания у лиц с мутацией G2019S и неотличимо от идиопатической БП. Средний возраст начала заболевания составляет около 60 лет (Gosal et al., 2007; Haugarvoll et al., 2008; Nuytemans et al., 2008).

В нашем исследовании клиническая картина заболевания у лиц со спорадической формой БП, имеющих мутации R1441C и G2019S, так же не имеет существенных различий и соответствует течению идиопатической БП. Таблица 11.

Примечания - те же, что и в таблице 10. 3.6. Сопоставление клинического течения БП у лиц с мутацией в гене LRRK2 и у лиц с БП отличной этиологии

Все пациенты БП, с длительностью заболевания пять лет и более, были разделены на 2 группы в зависимости от наличия мутаций в гене LRRK2: на пациентов имеющих мутацию в гене LRRK2 (10 человек), пациентов с БП отличной этиологии (150 человек). Сравнительный анализ данных групп представлен в таблице 12.

Сопоставление клинического течения БП у лиц с мутацией в гене LRRK2 и у лиц с БП отличной этиологии. Клинические характеристики пациентов БП Больные с мутацией в гене LRRK2 (10 человек) Больные БП отличной этиологии (150 человек) Р

При сопоставлении по выше описанным критериям течения заболевания и ответа на терапию Л-ДОФА-содержащими препаратами у пациентов с мутациями в гене LRRK2 и больных отличной этиологии стало очевидно следующее: достоверных различий по полу, формам заболевания, среднему возрасту пациентов, среднему возрасту манифестации симптомов БП, наличию положительного эффекта при приеме Л-ДОФА-содержащих препаратов не выявлено.

В то же время единственным отличием оказалось: у лиц с мутациями в гене LRRK2 показана повышенная частота побочных эффектов при приеме Л-ДОФА-содержащих препаратов. В настоящем исследовании все больные находились под длительным наблюдением, лечение БП у большинства больных было комплексным, лечение Л-ДОФА-содержащими препаратами начиналось с небольших доз. В литературных источниках указывается, что в 50-80 % случаев появляются побочные эффекты при приеме выше указанных препаратов в течение пяти и более лет (Крыжановский и др., 2002). Опыт показывает, что возникновению побочных явлений при Л-ДОФА терапии зависит не только от дозы препарата, но и от режима их приема и, не в последнюю очередь от времени их введения и от того на какой стадии заболевания они были введены. Кроме того мы старались как можно дольше лечить пациентов минимальной эффективной дозой Л-ДОФА-содержащих препаратов. В данном исследовании большинство больных являются амбулаторными пациентами (пациенты с 4 и 5 стадией заболевания по классификации M.Hoehn и M.Yahr не входили в исследование). Этим тоже можно объяснить низкую частоту побочных эффектов от терапии Л-ДОФА в общей группе больных (7/160; 4,3%). В рамках настоящего исследования не представилось возможным учесть длительность приема препаратов Л-ДОФА, а также доз у всех пациентов. Однако у четырех из шести больных БП, обусловленной мутацией G2019S, выявлены побочные эффекты от Л-ДОФА-содержащих препаратов, что достоверно выше, чем в группе больных БП отличной этиологии (р=0,002). Таким образом, несмотря на незначительное количество больных с мутацией в гене LRRK2, можно сделать вывод о повышенной частоте побочных эффектов при приеме Л-ДОФА-содержащих препаратов у больных БП, обусловленной мутацией G2019S.

Похожие диссертации на Молекулярно-генетическое исследование гена лейцинбогатой киназы 2 (lrrk2) у лиц с болезнью паркинсона