Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Полиморфизм генов ферментов монооксигеназной системы и антиоксидантной защиты у больных хроническими заболеваниями дыхательной системы в Республике Башкортостан Ахмадишина Лейсан Зинуровна

Полиморфизм генов ферментов монооксигеназной системы и антиоксидантной защиты у больных хроническими заболеваниями дыхательной системы в Республике Башкортостан
<
Полиморфизм генов ферментов монооксигеназной системы и антиоксидантной защиты у больных хроническими заболеваниями дыхательной системы в Республике Башкортостан Полиморфизм генов ферментов монооксигеназной системы и антиоксидантной защиты у больных хроническими заболеваниями дыхательной системы в Республике Башкортостан Полиморфизм генов ферментов монооксигеназной системы и антиоксидантной защиты у больных хроническими заболеваниями дыхательной системы в Республике Башкортостан Полиморфизм генов ферментов монооксигеназной системы и антиоксидантной защиты у больных хроническими заболеваниями дыхательной системы в Республике Башкортостан Полиморфизм генов ферментов монооксигеназной системы и антиоксидантной защиты у больных хроническими заболеваниями дыхательной системы в Республике Башкортостан Полиморфизм генов ферментов монооксигеназной системы и антиоксидантной защиты у больных хроническими заболеваниями дыхательной системы в Республике Башкортостан Полиморфизм генов ферментов монооксигеназной системы и антиоксидантной защиты у больных хроническими заболеваниями дыхательной системы в Республике Башкортостан Полиморфизм генов ферментов монооксигеназной системы и антиоксидантной защиты у больных хроническими заболеваниями дыхательной системы в Республике Башкортостан Полиморфизм генов ферментов монооксигеназной системы и антиоксидантной защиты у больных хроническими заболеваниями дыхательной системы в Республике Башкортостан Полиморфизм генов ферментов монооксигеназной системы и антиоксидантной защиты у больных хроническими заболеваниями дыхательной системы в Республике Башкортостан Полиморфизм генов ферментов монооксигеназной системы и антиоксидантной защиты у больных хроническими заболеваниями дыхательной системы в Республике Башкортостан Полиморфизм генов ферментов монооксигеназной системы и антиоксидантной защиты у больных хроническими заболеваниями дыхательной системы в Республике Башкортостан
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Ахмадишина Лейсан Зинуровна. Полиморфизм генов ферментов монооксигеназной системы и антиоксидантной защиты у больных хроническими заболеваниями дыхательной системы в Республике Башкортостан : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.15.- Уфа, 2007.- 202 с.: ил. РГБ ОД, 61 07-3/624

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 8

1.1. Хронические заболевания оріанов дыхания - общая характеристика и эпидемиология 8

1.2. Факторы риска развития хронических заболеваний органов дыхания ... 11

1.3. Патогенез хронического обструктивної о бронхита 18

1.4. Генетические факторы формирования хронических заболеваний органов дыхания 21

ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 44

2.1. Объект исследования 44

2.2. Молекулярно-генетические методы исследования 49

2.2.1. Выделение ДНК 49

2.2.2. Проведение полимеразной цепной реакции синтеза ДНК и рестрикционного анализа 51

2.2.3. Проведение электрофореза и визуализация результатов 58

2.2.4. Статистический анализ 58

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 61

3.1 Анализ частот полиморфных вариантов генов ферментов монооксшеназной системы и антиоксидантной защиты в этнических группахРесиубликиБашкортостан 61

3.2 Анализ ассоциации генов ферментов монооксигеназной системы и антиоксидантной защиты с развитием профессионального хронического бронхита 83

3.3. Анализ ассоциации генов ферментов монооксигеназной системы и антиоксидантной защиты с развитием хронической обструктивной болезнилегких 120

3.4. Сравнительный анализ генетических факторов риска развития профессионального хронического бронхита и хронической

обструктивной болезни лёгких 161

Заключение 164

Выводы 169

Список литературы

Введение к работе

Актуальность проблемы

Хронические заболевания органов дыхания являются серьёзной проблемой современной медицины, что обусловлено широким распространением данной патологии, высокими показателями инвалидности и смертности населения. Многочисленные эпидемиологаческие исследования указывают на то, что рост заболеваемости болезнями дыхательной системы преимущественно характерен для населения крупных городов и территорий с неблагоприятной экологаческой обстановкой [Чучалин Л., 2003; Гичев Ю.П.,2002], что объясняется антропогенным загрязнением окружающей среды и популярності ыо курения.

По данным «Белой Книги Пульмонологии», в структуре болезней органов дыхания первое место занимает хроническая обструктивная болезнь лепшх на долю которой приходится свыше 55% среди других легочных заболеваний в Российской Федерации [Чучалин А., 2003]. Это хроническое, прогрессирующее, многофакгорное заболевание дыхательной системы, вызванное обструкцией периферических дыхательных путей (хроническим бронхигом) и деструкцией легочной паренхимы (эмфиземой) [GOLD Workshop Report, 2003; Celli B.R.et MacNeeW.,2004].

Традиционно основными факторами риска развития хронической обструктивной болезни леїтсих считается курение, а также и воздействие производственной пыли и токсических веществ. Хронический обструктивный бронхит формируется примерно у 4-25% лиц, работающих во вредных и неблагоприятных производственных условиях [Лещенко И.В. и соавт., 2004]. В связи с этим, особую значимость представляет изучение профессионального хронического бронхита.

Несмотря на огромное внимание, уделяемое хроническому обструктивному бронхиту, меры эффективной профилактики данной патологии разработаны недостаточно, что затрудняет прогнозирование индивщгуальной предрасположенности, тяжести течения и исхода заболевания. Поэтому поиск

5 информативных генетических маркеров, конгролирующих ключевые звенья патогенеза хронического обструктивного бронхита, несомненно, является одной из актуальных и перспективных задач медицинской генетики.

Исследования последних лет показывают, что ключевую роль в паюгенезе многих заболеваний легких играет свободнорадикальное окисление. Леїкие наиболее уязвимы в отношении оксидативного повреждения, так как непосредственно подвергаются действию кислорода, а гакже оксидантов, содержащихся в загрязненном воздухе. На ткань легких прямо воздействуют оксиданты, образующиеся при курении. При этом большое значение имеет образование активных форм кислорода в результате дисбаланса в системе оксиданты-антиоксиданты. Дисбаланс может быть обусловлен нарушением равновесия между монооксигеназной системой и системой антиоксидантной защиты организма. Это является пусковым механизмом повреждения бронхов и развигая хронического обструктивного бронхита.

В этой связи, несомненно, что изучение генов, кошролирующих акгивность ферментов микросомальной монооксигеназной системы и антиоксидантной защиты является важной задачей при исследовании механизмов биотрансформации химических веществ и выявлении предрасположенносш к заболеваниям дыхательной системы, вызванных действием сигаретного дыма и ряда производственных факторов.

В связи с вышеизложенным цель исследования заключалась в поиске молекулярно-генетических маркеров развития хронической патологии органов дыхания, вызванной воздействием производственных факюров и сигаретного дыма, на основе изучения полиморфизма генов ферментов микросомальной монооксигеназной системы и антиоксидантной защиты.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи; 1. Изучить полиморфизмы генов ферменюв микросомальной монооксигеназной системы (CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2FJ, ЕРНХ1) и ангиоксидангой защиты {CAT, NQOl, GSTTI, GSTM1, GSTP1, GPX1) в этнических группах населения Республики Башкортостан.

  1. Провести анализ ассоциации полиморфных вариаіпов генов ферментов микросомальной монооксигеназной системы CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2EI, ЕРНХ1) и антиоксидантной защиты (CAT, NQOl, GSTT1, GSTMI, GSTP1, GPXI) с развитием профессионального хронического бронхита.

  2. Провесш анализ ассоциации полиморфных вариантов генов ферментов микросомальной монооксигеназной системы CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2E1, ЕРНХ1) и антиоксидантной защиты (CAT, NQOl, GSTT1, GSTMI, GSTPI, GPXI) с развитием хронической обструктивной болезни легких.

  3. Дать сравнительную оценку генетических фаююров риска развития профессионального хронического бронхита, вызванного воздействием производственной среды, и хронической обструктивной болезни легких, вызванной курением.

Научная новизна

Впервые в трёх этнических группах жителей Республики Башкортостан (русские, татары, башкиры) проведен сравнительный анализ полиморфизмов генов CYP1A1, CYPIA2, CYP2A6, CYP2EI, ЕРНХ1, CAT, NQOl, GSTT1, GSTPI, GPXI.

Впервые изучена взаимосвязь геногипов и гашютипов генов, кодирующих ферменты микросомальной монооксигеназной системы и антиоксидантоой защиты с развитием профессионального бронхи га.

Впервые дана оценка роли полиморфизмов генов CYP1A2, CYP2A6, CAT, NQOl в развитии предрасположенности к хронической обструктивной болезни легких.

Показано, чю полиморфные варианты генов CYP1A2, САТ1 вносят вклад

в формирование генетической структуры подверженности к хроническому

обструктивному бронхиту, вызванного воздействием, как факторов

производственной среды, так и сигаретного дыма.

Научно-практическая значимость

На основании полученных результатов показана целесообразность определения полиморфных вариантов генов CYP1A2, CYP2A6, ЕРНХ1, CAT,

7 GSTPI, NQOl с целью профилактики развития бронхита в группах риска (рабочие вредных производств, злостные курильщики).

Материалы работы могут быть использованы в учебном процессе на биологаческих и медицинских факультетах ВУЗов, а также на курсах последипломного образования врачей.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Выявлены существенные межэтнические различия по распределению частот аллелей и гаплотипов полиморфных маркеров генов CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, GSTM1, GPX1.

  2. Генетическими маркерами развития профессионального хронического бронхита являются полиморфные варианты генов CYP1A1 и CYP1A2. Фактором риска для развития профессионального хронического бронхита в этнической группе башкир являются полиморфные варианты гена CYP1A1, в группе русских - гена ЕРНХ1, в этнической группе татар - гена САТ.

  3. Генетическими маркерами риска развития хронической обструкгивной болезни легких у жителей Республики Башкортостан являюгся полиморфные варианты генов CYP1A2, ЕРНХ1, GSTPI, CAT, в этической группе татар -CYP1A2, CYP2A6, ЕРНХ1, GSTPI, CAT; в этнической группе русских - EPHXI, GSTPl,CATnNQ01.

  4. Показано, что полиморфные вариангы гена кагалазы (CAT) вносят вклад в формирование структуры подверженности к развитию хронического обструктивного бронхита, вызванного воздействием как факторов производственной среды, так и сигаретного дыма.

Факторы риска развития хронических заболеваний органов дыхания

Важным шагом на пути развития стратегии профилактики и терапии любой болезни, в том числе и хронических заболеваний органов дыхания является определение факторов риска заболевания.

В результате эпидемиологических исследований все факторы риска хронических заболеваний органов дыхания были разделены на внешние и внутренние. К внешним факторам относят курение іабака, профессиональную вредность (аэроирританты, пыль, химикаты), атомосферные поллютанты, частые инфекции респираторною тракта, а также социально-экономический статус пациента.

К главным внутренним факторам относят генетическую предрасположенность, а также особенности развишя легких [GOLD Workshop Report, 2003]. Разделение на внешние и внутренние факчоры отражает современное понимание этиологии хронических заболеваний органов дыхания как результата взаимодействия между собой этих факторов. Таким образом, хронический бронхит является классическим примером многофакторного заболевания, в реализации которою, наряду с внешнесредовыми факторами, существенную роль играет генетическая компонента.

В связи с важностью влияния экзогенных факторов среды на развитие заболеваний органов дыхания особую значимость представляет изучение профессионального хронического бронхита. В официальном посіановлении 2002 г. Американского Торакального Общества указано, что 15% всех случаев бронхитов вызвано воздействием профессиональных факторов среды [Christian! D.C., 2005; Trupin L.,2005]. Бронхит профессионального і-енеза может быть вызван длительным воздействием пыли неорганического и смешанного происхождения: угольная, кремнийсодержащая пыль, многие виды растительной пыли, кадмиевый дым. Появляется больше данных о том, что высокофиброгенная кремнийсодержащая пыль вызывает не только силикоз, но и ХОБЛ [Calvert G.M. et al, 2003]. Поскольку на рабочем месте присутствует, как правило, целый комплекс вредных веществ, оценка роли какою-то специфического агента, вызвавшего развитие бронхита, крайне затруднительна.

Наиболее часто профессиональный хронический бронхит развивается у шахтеров, металлургов, шлифовщиков и полировщиков металлических изделий, электросварщиков, строителей, работников целлюлозно-бумажной и текстильной промышленности, сельского хозяйства, где воздействие пылевых факторов наиболее агрессивно [Лещенко И.В. и соавт.,2004; Hnizdo Е. et al,2002; Mastrangelo G. et al,2003]. Длительная экспозиция сварочного аэрозоля и металлической стружки увеличивает риск развития хронического бронхита в 4.78 раз [Fidan F. et al., 2005]. Так анализ многолетнего наблюдения за состоянием здоровья английских и американских шахтёров выявил ежегодное снижение объёма форсированного выдоха в 1 секунду (ОФВ1) на 8 мл/год и 7 мл/год, соответственно [Barmes J.R., 2005], у норвежских подземных строителей ежегодное снижение ОФВ1 составило 17 мл/год по сравнению с наземными- 0.5 мл/год [Ulvestad В. Et al., 2000]. Исследование, проводившиеся в Швеции с 1971 по 1999 юд, и охватившее 317 625 строителей, подвергавшихся воздействию неорганической пыли, показало увеличение смертности от бронхита: относительный риск (RR) составил 1.12 [Bergdahl I.A. et al,2004].

Хронический обструктивный бронхит формируется примерно у 4,5-24,6% лиц, работающих во вредных и неблагоприятных производственных условиях [Лещенко И.В. и соавт., 2004]. Некоторыми исследователями предпринимаются попытки оценить общепопуляционный, гак называемый «профессиональный эффект ХОБЛ», принимая во внимание статус курения, пол, возраст, социоэкономическое положение. Для курильщиков эта величина составила 19.2%, для некурящих -31% [Meldrum М. et al.,2005].

На развитие болезни и стадии патологического процесса оказывают прямое влияние стаж работы, характер пыли и ее концентрация в зоне дыхания [Blanc P.D. et al.,2004]. Предельно допустимая концентрация для малотоксичной пыли составляет 4-6 мг/м3.

Производственная пыль является одним из неблагоприятных факторов, влияющих на здоровье человека. В различных отраслях промышленности и сельском хозяйстве многие производственные процессы связаны с образованием пыли. Это горнорудная, угледобывающая промышленность, металлургические, металлообрабатывающие и машиностроительные предприятия, производства строительных материалов, электросварочные работы, текстильные предприятия, обработка сельскохозяйственных продуктов - зерна, хлопка, льна и др.

Пылевые бронхиты возникают при вдыхании преимущественно умеренно агрессивных смешанных пылей. Возможны случаи развития этого заболевания у лиц, имеющих контакт с различными, в том числе так называемыми фиброгенными видами пылей. Важность изучения этиологической роли производственной пыли в развитии хронического бронхита определяется, прежде всего, тем, что эта форма представляет собой наиболее распространенное и прогностически серьезное заболевание в структуре разнообразных болезней легких.

В развитии и прогрессировании хронического пылевого бронхита в ХОБЛ имеет значение сочетание ряда факторов и, прежде всего, курения, неблагоприятных метеорологических условий, инфекции. Строго контролируемые эпидемиологические исследования с несомненностью подтверждают возможную этиологическую роль пыли в развитии бронхита, а затем и ХОБЛ.

Генетические факторы формирования хронических заболеваний органов дыхания

В XX веке были сделаны грандиозные открытия генетических и молекулярных основ развития моногенных наследственных заболеваний человека. Однако, генетическая природа многофакторных заболеваний до сих пор остается не раскрытой. Чтобы приблизиться к расшифровке механизмов, лежащих в основе их формирования научное сообщество предпринимает попытки понять биохимические и патогенетические пути их развития, с тем, чтобы очертить круг потенциальных і енов-кандидатов. Классическими примерами подобного рода патологий со сложным наследованием являются сахарный диабет, эссенциальная гипертензия, бронхиальная астма [Киселев Л.Л., 2005].

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) также относится к группе многофакторных заболеваний, обусловленных взаимодействием факторов внешней среды и генетической предрасположенности [Joos L. et al, 2002; Barnes P., 2004]. Исследования семейных случаев ХОБЛ и близнецовый метод позволили показать, что в манифестации заболевания важную роль играет комплексное взаимодействие генетических и виешнесредовых факторов [Joos L., 2004; Silverman Е.К., 2006]. Одним из первых фенотипических маркеров раннего развития эмфиземы и ХОБЛ тяжелої о течения был арантитрипсин (оіі-ААТ). Были найдены ассоциации предрасположенности к ХОБЛ и профессиональным пылевым бронхитам, силикозу, астбестозу с некоторыми изоформами гаптоглобина, холинэстеразы, супероксиддисмутазы, церулоплазмина [Спицын В.А., 1990; Мхеидзе М.О., 1994; Кузьмина Л., 2001; Пай Г.В., 2003]. Кроме того, была широко изучена связь ХОБЛ с различными системами антигенов групп крови.

Дефицит альфа 1- антитрипсина, обусловленный несколькими мутациями в гене PI (protease inhibitor), до сих пор считается единственным хорошо изученным генетическим фактором риска раннего ХОБЛ, однако мутации в этом гене настолько редки, что являются причиной только 2% развития ХОБЛ. Во второй половине 20 века широкое распространение получила концепция нарушения баланса в системе протеолиза-антипротеолиза как одна из причин развития эмфиземы легких.

С развитием методов молекулярной генетики, открытием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и организацией проектов «Геном человека» и GOLD, исследования генетической предрасположенности к ХОБЛ становятся более осмысленными и основываются на анализе полиморфизма и экспрессии генов ферментов, изучение которых наиболее целесообразно, исходя из знания о патогенезе заболевания.

Исходя из патогенеза ХОБЛ, в качестве первых генов-кандидатов развития заболевания выступили гены, кодирующие ферменты протеолитических ферментов и их ингибиторы. Основными ферментами системы ингибиторов протеаз являются а і-антитрипсин, аі-антихимотрипсин, а2-макроглобулин и тканевые ингибиторы матриксных металл опротеаз.

Так как, особая роль в патогенезе бронхита принадлежит хроническому воспалению. Дисбаланс прогиво- и провоспалшельных цитокинов в пользу последних может приводить к нарушению адекватної о течения воспалительного ответа и распространению воспаления с местного на системный уровень [Ройт А., 2000; Громова А.Ю., Симбирцев А.С., 2005; Vet al, 2005]. На сегодняшний день выявлены ассоциации полиморфных вариантов генов цитокинов с развитием ХОБЛ [Huang et al. 1997; Fishman D. et al, 1998; Warzocha K. et al, 1998; Grove J. et al, 2000; Chen W.C. et al, 2001; Chung K.F., 2001; Hull J .et al, 2001; Joos L. et al, 2001; Karjalainen J. et al., 2002; Kucukaycan M et al, 2002; Barnes P.J. et al, 2003; Ferrarotti I. et al, 2003; Hu R.C. et al, 2003; Seifart C. et al, 2005; Clpriano С et al, 2005; Broekhuizen R. et al, 2005; Данилко K.B. с соавт., 2007].

Важную роль в защите легких от токсичных продуктов, содержащихся в табачном дыме, атмосфере крупных промышленных городов и воздухе вредных производств, играют ферменты системы биотрансформации ксенобиотиков [Baranov V.S. et al ,1996; Baranova H. et al, 1997] и антиоксидантной защиты [Autrup 11., 2000]. Способность обезвреживать чужеродные вещества в нетоксичные метаболиты может считаться первой линией защиты организма в процессах их элиминации.

Исследования последних лет показывают, что свободнорадикальное окисление иірает ключевую роль в патогенезе многих заболеваний лепшх. Легкие наиболее уязвимы в огношении оксидативної о повреждения, так как непосредственно подвергаются действию кислорода, а также оксидантов, содержащихся в загрязненном воздухе. На ткань легких прямо воздействуют оксиданты, образующиеся при курении. В организме значительные количества свободных радикалов продуцируют фагоцитирующие клетки при взаимодействии с возбудителями инфекции, иммунными комплексами или пылевыми частицами. Большое значение имеет образование активных форм кислорода в ходе реакций активации в микросомальной монооксигеназной системе.

Проведение полимеразной цепной реакции синтеза ДНК и рестрикционного анализа

Материалом для молекулярно-генетического анализа служили образцы ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической венозной крови. Кровь набирали в пробирки со стандартным консервантом (1 мл глюгицира) в соотношении 4:1. До выделения образцы крови хранили при температуре +4С не более месяца. Для выделения ДНК использовался стандартный метод фенольно-хлороформной экстракции с небольшими модификациями (микрометод) [Mathew С, 1984]. К 4-8 мл крови добавляли 40 мл холодного лизирующего буфера, содержащеі о 320 мМ сахарозы, 1 % тритона X 100, 5мМ MgCb, 10 мМ трис-НС1 рП 7,6. Ядра осаждали двойным центрифугированием при 4С и 4000 g (сначала в течение 20 минут, а затем в течение 10 минут после слива супернатанта и повтороного добавления 10 мл лизирующего буфера). Полученный осадок ресуспензировали в 400 мкл буфера Soline EDTA (25 мМ EDTA, NaCl 5М рП=8,0), добавляли 40 мкл 10% SDS и 30-40 мкл протеиназы К («Promega») до конечной концентрации 10 мг/мл. После перемешивания на шейкере, инкубировали при 37С в течение 10-12 часов.

Очистка ДНК от белков производилась с помощью эктракции лизата забуференным фенолом (200 мкл меркаптоэтанола на 50 мл фенола-Трис-НС1, рН=7,8), смесью фенол-хлороформа (1:1) и хлороформом (2 мл изоамилового спирта на 48 мл хлороформа). При этом фенол активно денатурирует белки, смесь фенол-хлороформа полностью ингибирует РНК-зную активность, в результате последней экстракции хлороформом из препарата ДНК удаляют остатки фенола. Экстракцию производили, смешивая лизат и растворитель до образования эмульсии. Разделение фаз проводили центрифугированием при 10000-12000 g в течение 8-Ю мин. Осаждение ДНК производилось добавлением двух объемов охлажденного 96% этанола. Осажденную ДРІК дважды промывали 70% этанолом для очистки от солей, заіем удаляли этанол из пробирки и подсушенный при комнатной температуре осадок ДНК растворяли в денонсированной воде. Раствор ДНК хранили при -20С.

Анализ полиморфных локусов генов цитохромов Р450: CYP1A1 (Т3801С, A2455G), (С-164A, T-2464delT), CYP2A6 (протяженная делеция 8-го экзона), CYP2E1 (С-1053Т) (номенклатура аллелей приведена согласно www.imm.ki.se/CYPalIeles/ Human Cytochrome Р-450 (CYP) genes: a web page for the nomenclature of alleles); эпоксидгидролазы EPHX1(7337C и A415G); глутатион S-трансферазы: GSTMI (протяженная делеция), GS ITl (протяженная делеция), GSTP1 (IIel05Val и Alal 14Val); NADPH хинон оксидоредуктазы NQOl (Prol87Ser); каталазы CAT1 (C-262T и C1167T); глутатионпероксидазы 1, GPX1 (Prol97Leu) проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) на термоциклере в автоматическом режиме с использованием локусспецифических олигоиуклеотидных праймеров. Перечень исследованных локусов, последовательности специфических олигоиуклеотидных праймеров, а также номенклатура аллелей представлены в табл. 2.4. Во всех случаях реакционная ПЦР - смесь содержала следующие обязательные компоненты: 1,25 мкл 1 х ПЦР-буфера (60 мМ Tris-HCl рН 8.5), 1,5 mM MgCl2, 25 тМ KCI, 10 тМ 2-меркаптоэтанол, 0.1% тритон Х-100), 200 мМ каждого dNTP, по 1 мкл соответствующих праймеров, примерно 100 иг геномной ДНК, 1 ед Taq-полимеразы («Сибэнзим») и необходимое количество деионизированной воды до объема 12.5 мкл. В случае необходимости для некоторых локусов с целью оптимизации в состав ПЦР-смеси вводились вспомогательные реагенты. Например, для локусов генов CYPlAl(Msp I), GSTT1 добавляли бычий сывороточный альбумин (10Х), для САТЦС-262Т) использовали 25 mM MgCb, а для улучшения выхода продукта реакции гена ЕРИХ1 в смесь вводили и 25 тМ MgCl2, и диметил сульфоксид.

Режим амплификации включал: предварительную денатурацию (94С, 5-7 мин), 28-32 цикла амплификации: денатурация - 94С, 40 сек; отжиг- tC, 40 сек; синтез - 72С, 1 мин; завершающий синтез (72С, 7-Ю мин). В табл. 2.4 приведены последовательности праймеров, конкретные величины температуры отжига для каждого из исследованных локусов.

Анализ генов GSTM1 и GSTT1 был выполнен в стандартных условиях по ранее описанной методике [Baranova Н. et al., 1997; Their R.,et al,1999]. При отсутствии делеции формировались фрагменты размером 271 пн и 480 пн соответственно, при наличии делеции фрагмент отсутствовал. В качестве внутреннего контроля дополнительно амплифицировали фрагмент 7 экзона гена CYP1A1.

Полиморфизм локусов генов CYP1A1,CYP1A2, CYP2A6, CYP2E1, ЕРИХ1, GSTP1, NQOl, CAT, GPX1 исследовали методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).

После амплификации ПЦР-продукт подвергся гидролизу соответствующей эндонуклеазой рестрикции (табл. 2.4). Для этого 5 мкл амплификата смешивали с 5 ед фермента в соответствующем буфере, смесь инкубировали при определенной температуре, согласно инструкциям производителей («Сибэнзим», «Fermentas», «Promega») на протяжении 12 часов.

Анализ миссенс-мутаций Тугі 131 lis и Hisl39Arg гена EPIIX1 проводился по Smith С A., Harrison DJ. (1997). Амплификация и ПДРФ-анализ каждого полиморфного локуса проводилась независимо друг от друга в стандартных условиях. По результатам исследования двух мутаций определяли фенотип, согласно классификации, предложенной Smith С.А. et Harrison D.J. в 1997г. (табл. 2.3).

Анализ ассоциации генов ферментов монооксигеназной системы и антиоксидантной защиты с развитием профессионального хронического бронхита

Данные по распределению частот генотипов и аллелей полиморфного локуса A2455G гена CYP1AI в группах больных бронхитом и здоровых индивидов представлены в табл. 3.13.

Сравнение общей выборки больных профессиональным бронхитом и здоровых рабочих по распределению частот генотипов и аллелей полиморфизма A2455G гена CYP1A1 показало отсутствие статистически значимых различий между группами (х =5.21, df=2, р=0.07 для генотипов и Х2=1.82, df=l, р=0.18 для аллелей) (табл. 3.13), хотя в группе здоровых рабочих наблюдалось двукратное увеличение частоты генотипа 1А 2С гена CYP1A1 по сравнению с больными профессиональным бронхитом (18.40% и 9.29%, соответственно).

Поскольку ранее было показано, что частоты полиморфных вариантов генов цитохрома Р450 различаются в зависимости от этнической принадлежности, анализ проводили с учётом этнической принадлежности исследуемых групп.

При сравнении групп больных и здоровых индивидов, русских по этнической принадлежности, различий в распределении частот генотипов и аллелей полиморфного локуса A2455G гена CYP1A1 не выявлено (/=1.90, df=l, р=0.17 и %2 =1.79, df=l, р=0.18 соответственно). Различий не было обнаружено также и для татар(х =0.70, df=2, р=0.71 для генотипов; х =0.03, df=l, р=0.88 для аллелей), и башкир(х =0.03, df=l, р=0.86 для генотпов; Х2=0.99, df=l, р=0.32 для аллели) (табл. 3.13).

Данные по распределению частот генотипов и аллелей полиморфизма Т3801С гена CYP1A1 в группах больных профессиональным хроническим бронхитом и здоровых рабочих представлены в табл. 3.14.

Анализ распределения частот генотипов и аллелей полиморфного локуса Т3801С гена CYP1A1 не выявил статистически значимых различий между общей выборкой больных хроническим бронхитом и здоровыми рабочими (х=2.41, df=2, р=0.30 и х =0.59, df=l, р=0.44 для генотипов и аллелей, соответственно).

Сравнение группы больных и здоровых индивидов с учетом их этнической принадлежности различий не выявило.

В табл. 3.15 представлены данные по анализу гаплотипов гена CYP1A1 в группах больных с профессиональным бронхитом и здоровых рабочих. В целом, общая выборка больных профессиональным хроническим бронхитом статистически достоверно отличалась по распределению частот гаплотипов гена CYP1A1 от группы здоровых рабочих (% =14.90, df=3, р=0.002). Данные различия были обусловлены высокой частотой гаплотипа CYP1A1 2C в группе здоровых рабочих (6.29%), в то время как в группе больных он встречался с частотой 0.88%. Гаплотип CYP1А1 1 А является наиболее частым в обеих группах, однако его частота была достоверно выше в группе больных (85.40% против 76.49%, в группе здоровых рабочих, соответственно; х2=5-93 р=0.0155, pcor=0.0465; OR=1.80, 95%С1 1.11-2.91). Анализ частот гаплотипов с учетом этнической принадлежности больных, выявил ассоциацию гаплотипа CYP1A1 1A с риском развития профессионального бронхита у башкир (х2=5.94, р=0.0155 рсог=0.0465; OR=3.27, 95%С1 1.23-9.02). В этнических группах татар и русских частоты гаплотипов статистически достоверно не различались между больными и здоровыми рабочими (х=5.47, df=3, р=0.19 и х =5.17, df=3, р=0.21, соответственно).

В группах больных професииональным хроническим бронхитом и здоровых рабочих изучен полиморфизм С-163А гена CYP1A2 (табл. 3.16).

При сравнении общей выборки больных хроническим бронхитом и здоровых рабочих достоверных различий в распределении частот генотипов и аллелей не обнаружено (х2=0.59, df=2, р=0.74 и х2=0-30, df=l, р=0.58, соответственно).

Анализ ассоциации локуса С-163А гена CYP1A2 с развитием профессионального бронхита с учетом этнической принадлежности обследованных показал отсутствие достоверных различий.

При сравнении групп больных и здоровых рабочих, татар по этнической принадлежности, было обнаружено увеличение частоты генотипа IF IF более чем в два раза в группе здоровых рабочих (14.71%), тогда как в группе больных частота его составила 5.56%. В тоже время, в группе больных профессиональным бронхитом была увеличена до 48.15%) частота гетерозиготного генотипа 1 A IF по сравнению с таковой в группе здоровых рабочих (32.35%). Однако, статистически достоверных различий в характере распределения частот генотипов и аллелей полиморфизма С-163А гена CYP1A2 выявлено не было (х2=2.77, df=2, р= 0.25 и х2=0.40, df=l, р=0.53), что вероятно, обусловлено недостаточным объемом выборки (табл. 3.16).

В этнической группе башкир выявлено повышение до 50.0% частоты гетерозиготного генотипа 1A 1F в группе здоровых рабочих, тогда как частота данного генотипа среди больных профессиональным бронхитом составляла только 34.78%. В целом, распределение частот генотипов и аллелей изучаемого полиморфизма было сходным в двух группах (% =1.49, df=2, р= 0.48 и х2=0.14, df=l, р=0.71, соответственно).

Похожие диссертации на Полиморфизм генов ферментов монооксигеназной системы и антиоксидантной защиты у больных хроническими заболеваниями дыхательной системы в Республике Башкортостан