Введение к работе
Ревматоидный артрит - наиболее распространенное ревматическое заболевание, около 2% взрослого населения в мире страдают данной патологией (Gabriel S Е , 2001) Исследования отечественных и зарубежных авторов показывают, что больные ревматоидным артритом находятся в группе риска по развитию атеросклероза (Wolfe F , 2003, Насонов Е Л , 2003; Аничков Д А, 2004) Следует отметить, что атеросклеротическое поражение сосудов является важной определяющей заболеваемости и преждевременной летальности при ревматоидном артрите, однако механизмы развития сердечно-сосудистых осложнений при данной патологии требуют уточнения Поэтому изучение связи между активностью иммунного воспаления, составляющей основу патогенеза ревматоидного артрита, и атеросклерозом имеет важное значение для расшифровки механизмов акселерированного развития и прогрессирования кардиоваскуляр-ных осложнений при данной патологии В исследованиях последних лет обсуждается роль эндотелиальной дисфункции как наиболее раннего этапа атероге-неза Поэтому перспективным представляется изучение показателей иммунного статуса у больных ревматоидным артритом и их взаимосвязи с параметрами функционального состояния эндотелия сосудистого русла В этой связи актуальной является оценка вазопротективных эффектов метотрексата - одного из основных препаратов базисной противовоспалительной терапии ревматоидного артрита (Chan Е S L , 2002) Известно, что статины занимают одно из центральных мест в лечении больных с сердечно-сосудистой патологией В ряде работ (Takemoto М, 2001, Case С.С, 2002, Насонов Е Л, 2003) показано их свойство оказывать противовоспалительное и эндотелиопротективное действие Поэтому изучение эффективности комбинированного применения метотрексата и стати-нов (аториса) для профилактики и лечения сердечно-сосудистых осложнений у больных ревматоидным артритом является актуальным направлением исследований, ориентированным на оптимизацию терапии больных ревматоидным артритом. Полученные данные позволят разработать дифференциальные подходы к терапии данных осложнений Все выше сказанное определило цель и задачи исследования.
Цель работы: изучение эффективности корригирующего влияния на иммунные нарушения и эндотелиальную дисфункцию базисного противовоспалительного препарата (метотрексата) и статинов (аториса) при ревматоидном артрите.
Задачи исследования
1 Охарактеризовать функциональное состояние эндотелия сосудистого
русла у больных ревматоидным артритом в зависимости от длительности тече
ния
-
Определить содержание цитокинов провоспалительного (ИЛ-1/3, ФНОа, ИЛ-6, ИЛ-2, ИНФ-7) и противовоспалительного (ИЛ-4, ИЛ-10, ТФР-Д) действия в сыворотке крови больных с различной степенью эндотелиальной дисфункции и длительностью ревматоидного артрита
-
Исследовать концентрацию неоптерина в сыворотке крови больных ревматоидным артритом при различной степени эндотелиальной дисфункции и длительности заболевания
-
Изучить эффективность коррекции метотрексатом иммунных нарушений и эндотелиальной дисфункции у больных ревматоидным артритом различной длительности
-
Провести оценку эффективности влияния комплексной терапии метот-рексат + аторис на показатели цитокинового статуса и эндотелиальной функции у больных ревматоидным артритом
Основные положения, выносимые на защиту
-
У больных ревматоидным артритом имеет место эндотелиальная дисфункция сосудистого русла, коррелирующая с уровнем провоспалительной ци-токинемии, содержанием неоптерина крови.
-
Фактором, влияющим на выраженность иммунных нарушений и тяжесть эндотелиальной дисфункции у больных ревматоидным артритом, наряду с длительностью заболевания, является дислипидемия
-
Базисная терапия метотрексатом обладает корригирующим действием на нарушения цитокинового статуса и эндотелиалытую дисфункцию, более выраженным при раннем ревматоидном артрите
-
Применение у больных ревматоидным артритом с III-IV степенью эндотелиальной дисфункции и дислипидемией наряду с метотрексатом аториса сопровождается потенциированием противовоспалительной и вазопротективнои активности терапии
-
Использование аториса на фоне базисной терапии метотрексатом у больных ранним ревматоидным артритом с нормальным уровнем липидного спектра крови не оказывает достоверного влияния на цитокиновый статус и эн-дотелиальную дисфункцию
Научная новизна У больных ревматоидным артритом определены нарушения цитокинового статуса, характеризующиеся увеличением содержания в сыворотке крови цитокинов провоспалительного (ИЛ-1/3, ФНОа, ИЛ-6, ИЛ-2, ИНФ-7) и противовос-
палительного (ИЛ-10, ТФР-/30 действия, снижением концентрации ИЛ-4, нарастающие параллельно с длительностью течения заболевания
Впервые выявлено увеличение в сыворотке крови больных ревматоидным артритом концентрации эндотелина-1, циркулирующих десквамированных эн-дотелиоцитов, нарушение эндотелийзависимой вазодилатации Установлено, что данные изменения коррелируют с сывороточным уровнем провоспалитель-ных (ШЫ(3, ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-2, ИНФ-7) и противовоспалительных (ИЛ-4, ИЛ-10, ТФР-Д) цитокинов, концентрацией неоптерина крови
Определено, что наиболее выраженные нарушения цитокинового статуса и эндотелиальной функции имеют место у больных ревматоидным артритом с дислипидемией.
Проведенная оценка влияния базисной терапии метотрексатом на показатели иммунного статуса и эндотелиальную дисфункцию у больных ревматоидным артритом показала наличие, наряду с противовоспалительной активностью, вазопротективного действия препарата, наиболее выраженного при раннем ревматоидном артрите
Установлено, что использование в комплексном лечении больных ревматоидным артритом с дислипидемией, наряду с метотрексатом, ингибитора ГМГ-КоА-редуктазЫ - аториса сопровождается потенцированием корригирующего влияния терапии на иммунные нарушения и эндотелиальную дисфункцию При отсутствии изменений липидного спектра крови при ревматоидном артрите, віслючєниє в терапию аториса не приводит к достоверной динамике изучаемых показателей иммунного статуса и эндотелиальной функции сосудистого русла
Практическая значимость
Проведенные исследования установили прогрессирование нарушений цитокинового статуса и эндотелиальной функции параллельно с длительностью течения ревматоидного артрита.
Результаты оценки противовоспалительной и вазопротективной активности метотрексата показали наличие прямой зависимости между противовоспалительными и вазопротективньши эффектами препарата
Выявлено, что назначение больным ревматоидным артритом с дислипидемией наряду с препаратами базисной терапии (метотрексатом) аториса, сопровождается потенцированием противовоспалительной и вазопротективной активности терапии Установлено, что у больных ревматоидным артритом длительностью менее 1,5 лет имеет место наибольшая эффективность корригирующего влияния терапии на цитокиновый статус и эндотелиальную дисфункцию
Полученные результаты позволили обосновать дифференцированные подходы к терапии больных ревматоидным артритом
Апробация работы
Основные положения диссертации обсуждены на Российской иммунологической конференции с Международным участием (Москва, 2006), III Российском национальном конгрессе аллергологов и иммунологов (Москва, 2006), VIII Всероссийском научно-образовательном форуме «Кардиолргия 2006» (Москва, 2006), Международной юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России (Курск, 2006), VI съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Москва, 2006 г ), Региональной научно-практической конференции, посвященной 20-летию факультета последипломного образования КГМУ 24 марта 2006 года (Курск, 2006), Юбилейной межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых, посвященной 70-летию КГМУ (Курск, 2006), Всероссийском конгрессе кардиологов (Томск, 2006 г,), 69-72 итоговых научных сессиях КГМУ (Курск, 2005-2007 гг), итоговых межвузовских научных конференциях студентов и молодых ученых (Курск, 2006-2007), Всероссийской конференции молодых ученых, организованной Воронежской государствейной медицинской академией им НН Бурденко и Курским государственным медицинским университетом (Воронеж, 2007), VI Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологаи» (Морква, 2007), XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007), III электронной межвузовской научной конференции «Эндотелиальная дисфункция и сердечно-сосудистая патология» (Курск, 2007), IV Международном форуме молодых ученых на лучшую научную работу (Москва, 2007), межкафедральной научно-практической конференции кафедр внутренних болезней № 1, 2, внутренних болезней ФПО, клиничеркой аллергологии и иммунологии, пропедевтики внутренних болезней, нервных болезней, общей врачебной практики Курского государственного медицинского университета Внедрение полученных результатов
Результаты проведенных исследований внедрены и используются в работе кардиологических и ревматологических отделений Областной клинической больницы г Курска, МУЗ ГБСМП г Курска, МУЗ ГКБ № 1 г Курска, используются в лечебной, научной работе и педагогическом процессе на кафедрах внутренних болезней № 1,2, внутренних болезней ФПО, клинической аллергологии и иммунологии Курского государственного медицинского университета. Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 152 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, глав собственных исследований, заключения, выводов
и практических рекомендаций Библиографический указатель включает 201 литературный источник, в том числе 89 отечественных и 112 зарубежных Работа иллюстрирована 24 таблицами и 16 рисунками
Публикации
Основное содержание работы опубликовано в 13 научных работах СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования. В исследование включено 78 больных ревматоидным артритом (РА) И-Ш ст, II ст. активности Диагноз РА устанавливался в соответствии с критериями Американской Коллегии Ревматологов (1987 года) Критериями включения пациентов в исследование явились наличие PA Н-Ш ст, II ст активности, отсутствие сопутствующей сердечнососудистой патологии, наличие показаний и отсутствие противопоказаний к применению базисных противовоспалительных препаратов (БПВП), больные, не получавшие БПВП в течение предшествующих 2 месяцев, пациенты, получавшие лечение по схеме мегготрексат, аторис в индивидуально подобранных дозировках
Клиническая характеристика больных представлена в таблице 1
Группа контроля включала 20 здоровых доноров -12 женщин и 8 мужчин, средний возраст которых составил 56,2±2,5 года
Таблица 1
Клиническая характеристика больных ревматоидным артритом
Критерии исключения пациентов из исследования. ИМ, стенокардия и наличие указаний на них в анамнезе, АГ более II степени, I и III степень активности РА, РА с системными проявлениями, больные, получавшие лечение глюко-кортикостероидами, ХСН более II ФК по классификации Нью-Йоркской ассоциации кардиологов (NYHA), воспалительные процессы любой локализации, сахарный диабет, хроническая почечная недостаточность
Критериями рандомизации служили, возраст обследуемых больных; длительность течения РА, наличие или отсутствие дислипидемии, тяжесть нарушения вазорегулирующей активности эндотелия сосудистого русла, установленная по уровню дилатации плечевой артерии в манжеточной пробе
Основная группа больных была разделена на пациентов с нормальным ли-пидным спектром крови (38 чел) и больных с дислипидемией (40 чел), при этом каждая из этих двух групп подразделялась на равные подгруппы в зависимости от терапии получавших лечение метотрексатом и комбинацию препаратов - метотрексат + аторис Все больные получали комплексную терапию с учетом тяжести РА, включающую гиполипидемическую диету, прием метот-рексата в дозе 25 ± 5 мг/нед, нестероидных противовоспалительных средств (НПВС), аториса 20 ± 5 мг/сутки
Оценка иммунного статуса, состояния функции эндотелия и липидного спектра крови проводилась дважды- при поступлении в стационар и после 6 месяцев терапии.
Методы лабораторных исследований. Содержание в сыворотке крови ФНО-а, ИЛ-lft ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10, ИФН-7, ТФР-ft определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест-систем Pro-con (НПО «Протеиновый контур», Россия) согласно инструкциям к тест-системам Неоптерин в крови определяли методом иммуноферментного анализа (BRANMS, Германия). Оценка липиднрго спектра крови включала определение общего холестерина (ОХС), холестерина липопротеидов низкой плотности (ХСЛПНП), холестерина липопротеидов высокой плотности (ХСЛПВП) и триглицеридов (ТГ) с помощью реактивов фирмы «Ольвекс Диагностикум» (Санкт-Петербург, Россия) ХСЛПНП и холестерин липопротеидов очень низкой плотности (ХСЛПОНП) определяли на основании расчетных формул ("Биохимические основы патогенеза атеросклероза", 1980) Содержание холестерина в липопротеидах различной плотности выражалось в ммоль/л Индекс атерогенности (ИА) рассчитывался по формуле
ОХ-ХСЛПВП
ИА =
ХСЛПВП Оценку содержания малонового диальдегида (МДА) в плазме производили при помощи реактивов для определения ТБК-активных продуктов (фирма
«Агат-Мед», г Москва, Россия) спектрофотометрическим методом и выражали в мкмоль/л. Содержание диеновых конъюгатов <ДК) определяли путем их предварительной экстракции смесью гептан изопропанолом (1 1) с последующим измерением оптической плотности при 233 нм на спектрофотометре СФ 26 и выражали в мкмоль/л
Характеристика эндотелиальной функции включала определение количества десквамированных (циркулирующих) эндотелиальных клеток (ЦЭК) и содержания эндотелина-1 (ЭТ-1) в крови обследованных
Количество десквамированных эндотелиоцитов в крови определяли по методу J. Hladovec (1978). Метод основан на изоляции клеток эндотелия вместе с тромбоцитами с последующим осаждением тромбоцитов с помощью аденозин-дифосфата (АДФ) Кровь из локтевой вены брали в количестве 5 мл, в качестве стабилизатора добавляли 3,8% лимоннокислый натрий в соотношении 1 9 Для получения богатой тромбоцитами плазмы сразу после взятия кровь центрифугировали 10 мин при 200g Затем 1 мл плазмы смешивали с 0,2 мл натриевой соли аденозиндифосфата (АДФ-Na) в концентрации I мг/мл. Полученную смесь механически перемешивали в течение 10 мин аккуратным встряхиванием пробирок, после чего вновь центрифугировали в прежнем режиме для удаления агрегатов тромбоцитов. Свободный от тромбоцитов супернатант переносили в другую емкость и центрифугировали при '200g в течение 15 мин для осаждения эндотелиальных клеток. Затем надосадочную плазму аккуратно удаляли, а полученный осадок суспензировали в 0,1 мл 0,9% раствора NaCI и перемешивали стеклянной палочкой Готовой суспензией заполняли камеру Горяева Количество клеток эндотелия подсчитывали в 2 сетках камеры методом фазовоконтра-стной микроскопии
Определение уровня ЭТ-1 в образцах проводили с помощью оригинального набора для радиоиммунного анализа фирмы Amersham (США).
Примечание, исследования иммунного статуса выполнялись в ЦНИЛ ФГУП Курская биофабрика фирма «БИОК», за что выражаем искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории.
Методика определения эндотелийзависимой вазодилатации плечевой артерии. Для оценки эндотелийзависимой вазодилатации (ЭЗВД) плечевой артерии использовали методику О В Ивановой с соавторами (1998) Для оценки изменения диаметра плечевой артерии использовали линейный датчик 7,5 МГц ультразвукового аппарата "Vingmed CMP 800" (США). Плечевую артерию ло-цировали в продольном сечении на 2-15 см выше локтевого сгиба, изображение синхронизировали с зубцом R ЭКГ. Определяли следующие параметры Диаметр плечевой артерии d (см), исходный - do, при компрессии - db при реактивной гиперемии - І2> при приеме нитроглицерина - d3 Скорость кровотока в плечевой артерии V (см/сек), исходную - V0, при реактивной гиперемии — V2
Производили расчет следующих показателей Степень изменения диаметра плечевой артерии Ad (%) при компрессии - Adoi^do-dO-lOO/do, при реактивной гиперемии - Ad огК^о-йг) 100/do, при приеме нитроглицерина - Ad оз=(<5о-4з) 100/do Степень изменения скорости кровотока в плечевой артерии AV (%). при реактивной гиперемии - AVo2=(Vo-V2) 100/V0
Методы статистического анализа. Статистическая обработка цифровых данных произведена с применением стандартного пакета прикладных программ Microsoft Excel и Statisnca 5.0 for Windows Статистический анализ количественных переменных основывался на различии средних арифметических совокупностей Использовался t-критерий Стьюдента, Манна-Уитни, Ньюмена-Кейса и Уилкоксона Для выявления значимой корреляционной связи между показателями использовались коэффициенты ранговой корреляции Спирмена и Пирсона
