Содержание к диссертации
страницы
Введение 3
Глава I.Обзор литературы 8
Актуальность проблемы инсектной аллергии 8
Характеристика различных членистоногих, вызывающих аллергические заболевания 10
A. Не жалящие и не кусающие насекомые 17
Б. Не жалящие кусающие насекомые 20
B. Кровососущие насекомые 21
Концепция «паналлергии» 24
3. Симптоматика аллергических заболеваний, вызванных различными
членистоногими 25
4. Принципы и методы аллергологической диагностики
инсектной аллергии 27
5. Заключение 31
Глава П. Материалы и методы 33
2.1. Технология получения препаратов аллергенов из синантропных
членистоногих 33
2.2.Определение безвредности и токсичности препаратов инсектных
ал ергенов З 3
2.3.Определение содержания белка в препаратах инсектных аллергенов 34
2.4.Электрофорез в полиакриламидном геле с додецил-сульфатом натрия
(PAGE-SDS) 35
Модель активной системной анафилаксии 37
Иммунодот 37
2.7.Метод непрямой дегрануляции тучных леток 38
Иммуноферментный анализ 39
Метод торможения ИФА 40
Характеристика обследуемых больных 40
Методы статистической обработки результатов 41
Глава III. Результаты исследований 42
3.1.Получение препаратов аллергенов из синантропных членистоногих 42
3.2. Определение безвредности и токсичности препаратов
инсектных аллергенов 45
3.3. Изучение физико-химических свойств полученных препаратов
инсектных аллергенов 46
3.4.Изучение специфической активности препаратов
инсектных аллергенов 50
Глава IV. Обсуждение результатов 64
Выводы 79
Список литературы 80
Введение к работе
По данным многочисленных исследований распространенность аллергических заболеваний во всем мире постоянно увеличивается. В экологически неблагоприятных регионах заболеваемость аллергией может достигать 50-60% (Ильина Н.И., 1996; Гущин И.С., 2006). В связи с этим и отечественные и зарубежные исследователи полагают, что такие заболевания, как бронхиальная астма, аллергический ринит, атопический дерматит приобретают эпидемический характер (Ring J., 1991; Хаитов P.M. с соавт., 1995; Barret К., 2000; Thomas N., 2001; Мачарадзе Д.Ш. с соавт., 2005).
Многие аллергические заболевания начинают формироваться в детском возрасте. Недооценка симптомов аллергических заболеваний и поздняя диагностика в раннем возрасте приводит к прогрессированию болезни, утяжелению его течения, ухудшению прогноза и ранней инвалидизации детей. В ряде случаев формирование аллергических заболеваний происходит в условиях внутрижилищной среды. Учитывая, что дети большую часть времени проводят в условиях внутренней среды жилых и общественных зданий, появилась необходимость изучения факторов, оказывающих негативное влияние на их здоровье.
Этиологическая роль внутрижилищных аллергенов в возникновении аллергических болезней очень велика [4,5,10,120,121,126]. Наибольшую роль в этом играет домашняя пыль, которая является многофакторной по составу. Источниками аллергенов в составе домашней пыли могут быть и частицы членистоногих и продукты их жизнедеятельности. Контакт людей с синантропными членистоногими возможен на предприятиях сельскохозяйственного профиля, в жилищах, детских дошкольных и школьных учреждениях, лечебно-профилактических учреждениях, офисах, предприятиях общественного питания, транспорте. Синантропные виды членистоногих широко распространены в окружающей среде человека, являясь не только показателем санитарного неблагополучия жилья и
переносчиками возбудителей инфекций, но и продуцентами аллергенов [32,147,149,150]. Причиной возникновения аллергических реакций наиболее часто являются синантропные виды тараканов, муравьи, мухи, моль. Членистоногие могут вызывать разнообразные по тяжести и клиническим проявлениям патологические реакции — от легкого раздражения кожи до анафилактического шока с летальным исходом. Повышенная чувствительность к внутрижилищным аллергенам приводит к развитию бронхиальной астмы, тогда как сенсибилизация к сезонным аэроаллергенам связана с развитием аллергического ринита.
Проявления аллергии к синантропным членистоногим могут носить полисимптоматический характер, иметь длительный латентный период и круглогодичное течение в отличие от сезонной аллергии к членистоногим, которые обитают в открытой природе [7]. Полисимптоматический характер инсектной аллергии привносит значительные трудности в диагностику данной группы заболеваний. Подтвердить диагноз инсектной аллергии помогают специфические методы обследования, при которых используются водно-солевые экстракты аллергенов членистоногих. Возникнув один раз, инсектная аллергия, как правило, с возрастом не исчезает, а больные нуждаются в специфической терапии препаратами инсектных аллергенов [13,29,46].
В настоящее время зарубежными компаниями созданы диагностические и лечебные препараты аллергенов рыжего, черного, американского тараканов, моли, оконных муравьев, существуют тест-системы для определения специфических IgE-AT к аллергенам жуков-кожеедов, личинок хирономид. Проведение аллергообследования в нашей стране ограничено из-за отсутствия диагностических аллергенов синанатропных членистоногих. В отечественной аллергологической практике разрешен к применению только препарат аллергена комара вида Aedes aegypti.
Последние данные о значимости аллергенов синантропных членистоногих в развитии аллергических заболеваний и отсутствие отечественных лечебно-диагностических препаратов инсектных аллергенов определили цели и задачи настоящего исследования.
Цель работы: приготовить диагностические аллергены из синантропных членистоногих и исследовать их физико-химические и иммунобиологические свойства.
В соответствии с поставленной целью необходимо решить следующие задачи:
1. Разработать технологию приготовления препаратов аллергенов из 11
членистоногих:
не жалящих и не кусающих:
-таракан рыжий {Blattella germanica)
-таракан черный (Blatta orientalis)
-таракан американский {Periplaneta americana) -таракан пепельный (мраморный) (Nauphoeta cinered) -моль платяная {Tinea pelionella) -паук домовый (Tegenaria derhami) -кожеед (Attagenus Smirnovi Zhari);
кусающих:
-муха комнатная {Musca domestica)
-муравей рыжий домовый (Monomorium pharaonis);
кровососущих:
-клоп постельный (Cimex lectularis) -комар обыкновенный (Culex pipiens).
2. Изучить физико-химические свойства полученных препаратов
инсектных аллергенов.
3. Оценить аллергенные и иммуногенные свойства приготовленных
инсектных препаратов.
4. Оценить частоту сенсибилизации больных с аллергическими заболеваниями к инсектным аллергенам.
Научная новизна:
Впервые в нашей стране разработан способ получения отечественных диагностических препаратов аллергенов из одиннадцати следующих членистоногих: таракан рыжий {Blattella germanica), таракан черный {Blatta orientalis), таракан американский {Periplaneta americana), таракан пепельный (мраморный) (Nauphoeta cinered), муха комнатная {Musca domestica), моль платяная {Tinea pelionella), клоп постельный {Cimex lectularis), муравей рыжий домовый {Monomorium pharaonis), паук домовый {Tegenaria derhami), кожеед {Attagenus Smirnovi Zhan), комар обыкновенный {Culex pipiens), что отражено в заявке на изобретение «Способ получения диагностического аллергена» (№ 2007139159/15).
Проведена оценка физико-химических свойств новых препаратов аллергенов. Инсектные аллергены гетерогенны по белковому составу, включают высокомолекулярные и низкомолекулярные компоненты. Выявлено, что все приготовленные препараты аллергенов из синантропных членистоногих имеют общий белковый компонент с молекулярной массой 20-30 кДа, что может свидетельствовать в пользу теории паналлергии.
Все полученные экстракты аллергенов членистоногих обладают специфической активностью.
Одиннадцать приготовленных аллергенов из синантропных членистоногих позволяют создать панель диагностических препаратов для выявления инсектной аллергии.
Практическая значимость:
- Применение отдельных аллергенов и целой панели препаратов
аллергенов из одиннадцати членистоногих позволит повысить качество
диагностики и лечения аллергических заболеваний, расширит возможности иммуноферментного анализа в диагностике инсектной аллергии.
- Предложены санитарно-гигиенические мероприятия по борьбе с
синантропными членистоногими, вызывающими аллергические реакции у
людей, что отражено в методических рекомендациях для врачей
«Диагностика и профилактика аллергических заболеваний, обусловленных
сенсибилизацией к синантропным членистоногим».
Основные положения, выносимые на защиту:
Отработана технология получения отечественных препаратов инсектных аллергенов, обеспечивающая сохранение физико-химических свойств, стабильности и безопасности препаратов в течение двух лет.
Приготовленные препараты инсектных аллергенов обладают высокой специфической активностью, которая установлена в реакциях in vitro (НДТК, ИФА, реакция торможения ИФА, иммунодот) и in vivo (тест анафилаксии).
Повышенные уровни IgE-AT к различным аллергенам членистоногих у больных бронхиальной астмой с бытовой сенсибилизацией свидетельствуют о диагностической значимости разработанных препаратов аллергенов из одиннадцати членистоногих.
Обзор литературы 1. Актуальность проблемы инсектной аллергии
Проблема аллергии за последние десятилетия превратилась в глобальную медико-социальную проблему современности. Рост аллергических заболеваний объясняется такими факторами как загрязнение окружающей среды отходами промышленного производства, увеличение экспозиции и спектра аллергенов, неблагоприятные социальные условия, изменение качества питания [12,18]. Население городов, особенно дети, большую часть суток проводят внутри помещений и подвергаются более тесному и длительному контакту с различными факторами внутрижилищнои среды, в том числе и синантропными членистоногими, обитающими в жилище человека [42,49,58,80,111]. Приоритетность роли внутрижилищнои среды в развитии аллергологическои патологии к членистоногим отмечается в работах многих отечественных и зарубежных авторов. Приводятся примеры наблюдений «семейных» случаев аллергических реакций, вызванных воздействием синантропных членистоногих; при этом симптомы поражения выявлялись у нескольких членов семьи, не связанных между собой генетическим родством [94,100].
Аллергические реакции, вызываемые насекомыми или продуктами их жизнедеятельности, называют инсектной аллергией (лат. Insectum -насекомое) [15]. Инсектная аллергия в структуре аллергопатологии составляет 0,5 - 3,5 % [33].
Аллергенами служат составные части яда или слюны, волоски или чешуйки, белки тела насекомого [5,8,10,46,88,135]. Защитные выделения (секреты) насекомых представляют собой сложные антигенные смеси. В их состав входят карбоксиловые кислоты, спирты, альдегиды, лактоны, кетоны, фенолы, эстеразы, оказывающие мутогенное и канцерогенное
действие; биологически активные вещества — стероиды, протеазы, гистамин, серотонин, либераторы гистамина и др. [7,36]
Аллергены, продуцируемые членистоногими, обладают высокой активностью и устойчивостью и способны в течение длительного времени персистировать в условиях внутрижилищнои среды. Так, например, период естественного полураспада аллергена Dermatophagoides farinae Der fl клеща домашней пыли составляет около 10 лет [135], а аллергены тараканов (даже в отсутствии этих насекомых) способны оставаться активными в жилищах в течение, по крайней мере, 5 лет [85]. Доказано, что длительная экспозиция незначительных концентраций бытовых и инсектных аллергенов приводит к развитию аллергических заболеваний у лиц с генетической предрасположенностью к атопии [112]. Рядом авторов показано, что примерно 30% больных аллергическими заболеваниями имеют положительные реакции к аллергенам 1-5 насекомых. Поэтому одной из задач профилактики и лечения аллергии является элиминация причинных аллергенов из непосредственного окружения больного [58,88,111].
Комплекс санитарно-гигиенических профилактических мероприятий должен включать два звена:
борьба с синантропными членистоногими;
диагностика и профилактика аллергических заболеваний населения путем разрушения аллергенов синантропных членистоногих.
Это достигается путем соблюдения чистоты в помещениях, поддержания оптимальных параметров микроклимата, использования эффективных фильтров для очистки воздуха в жилых помещениях, проведения адекватных дезинсекционных мероприятий [22].
2.Характеристика различных насекомых, вызывающих аллергические заболевания
Группа насекомых, обитающих в жилище человека и вызывающих аллергические заболевания, входит в класс Insecta и относится к типу членистоногих [7,8]. К членистоногим (тип Arthropoda) также относятся классы паукообразных (Arachnida), ракообразных {Crustacea), многоножек (Myriapoda), хелицеровых (Chelicerata), включая клещей.
Среди всех групп беспозвочных животных тип членистоногих отличается наибольшей распространенностью, разнообразием форм, мест обитания, огромным числом видов. Членистоногие населяют все экологические ниши и отличаются размерами от микроскопических клещей до гигантских крабов.
Насекомые - наиболее многочисленный класс членистоногих. Их численность приближается к 3 миллионам и намного превышает число видов всех остальных типов животных и растений вместе взятых, включая микроорганизмы [10,14,104]. Распространение насекомых в природе варьирует в зависимости от географических, климатических и культурных условий. Увеличению численности насекомых в биоценозе способствуют факторы окружающей среды: температура, влажность, сила ветра и др. [6,30,109]. Есть чёткая связь между плотностью насекомых и развитием сенсибилизации к ним у астматиков [13,88].
Контакт с насекомыми может привести к развитию токсических, псевдоаллергических и аллергических реакций [13,37].
Характер аллергической реакции зависит от вида членистоногого, стадии его развития [51,91,129,130,131], источника аллергенного материала (частицы тела, фекалии, слюна, секрет, другие метаболиты), путей введения аллергена в организм человека, от длительности и массивности воздействия аллергена и индивидуальной иммунной реактивности организма человека [36,70,99].
Известны следующие пути введения аллергена в организм человека:
парентеральный - аллергенные компоненты насекомых попадают в кровеносное русло человека при укусах жалящих и кровососущих насекомых;
контактный - соприкосновение и раздавливание членистоногих;
опосредованно контактный (например, конъюктивит и отек век в результате расчесывания глаз после мануального контакта с личинками членистоногих);
ингаляционный - вдыхание фрагментов тел, фекалий и других
метаболитов членистоногих;
алиментарный - попадание продуктов питания, инфестированными
синантропными членистоногими, в организм человека через желудочно-
кишечный тракт.
Насекомых, вызывающих аллергические реакции, можно разделить на группы жалящих и не жалящих [25,27,37]. Наиболее изученными являются жалящие виды насекомых (осы, пчелы, шмели, муравьи). На их аллергены развиваются более тяжелые аллергические реакции, так как сенсибилизация организма происходит парентеральным путем, что способствует быстрому поступлению аллергенов в кровь и развитию аллергической реакции (вплоть до летального исхода) [29]. Так же парентеральным путем в организм человека попадают аллергены кровососущих (комаров, блох, клопов) и кусающих насекомых (мух). В последние годы приобрели значение как важные источники аллергенов тараканы, моль, пауки, жуки. Этих насекомых можно отнести к группе не жалящих и не кусающих. Количество случаев проявления гиперчувствительности к различным представителям не жалящих видов насекомых с каждым годом увеличивается, в связи с чем и возрастает интерес исследователей к проблеме аллергии, вызванной синантропными насекомыми [136].
С точки зрения способности вызывать аллергические реакции у людей наибольшую опасность представляют следующие виды членистоногих,
обитающих на территории Европейской части России: таракан рыжий {Blatella germanicd) таракан черный {Blatta orientalis), таракан американский {Periplaneta americand), таракан пепельный {Nauphoeta cinered), рыжий домовый муравей {Monomorium pharaonis L.), платяная моль {Tineola bisselliella Нитт), комнатная муха {Musca domesticd), домовый паук {Tegenaria derhami), кожеед {Attagenus smirnovi Zhan), постельный клоп {Cimex lectularius), комар обыкновенный {Culex pipiens).
В группе не жалящих насекомых можно выделить не кусающих, к которым относятся тараканы {Blatella germanica, Periplaneta americana, Blatta orientalis, Nauphoeta cinered), моль {Tineola bisselliella), паук {Tegenaria derhami), кожеед {Attagenus smirnovi Zhan), кусающих насекомых: комнатная муха {Musca domesticd), домовый муравей {Monomorium pharaonis L.), кровососущих насекомых: постельный клоп {Cimex lectularius), комар обыкновенный {Culex pipiens), блохи (С. felis,C.canis) (табл. № 1).
Таблица № 1
Таксономия членистоногих (Arthropoda), класс Insecta, вызывающих
аллергические реакции:
Надотряд Новокрылые {Neopterd)
Отряд Тараканообразные (Blattodea)
Семейство Тараканы {Blattidea)
Род Blattella
Вид Рыжий таракан {Blatella germanica)
Род Blatta
Вид Черный таракан {Blatta orientalis)
Род Periplaneta
Вид Американский таракан
{Periplaneta americana)
Род Nauphoeta Вид Пепельный таракан {Nauphoeta cinerea)
Отряд Перепончатокрылые {Hymenopterd)
Подотряд Жалящие {Aculeata)
Суперсемейство Formicoidea
Семейство Муравьи {Myrmecidae)
Вид Рыжий домовый муравей {Monomoriumpharaonis L.)
Отряд Двукрылые (Diptera) Отряд Двукрылые (Diptera)
Семейство Мухи настоящие (Muscidae) Семейство Комары настоящие (Culicidae)
Род Муха (Musca) Род Culex
Вид Комнатная муха (Musca domesticd) Вид Комар обыкновенный (Culex pipiens)
спымсм
Отряд Полужесткокрылые (Heteroptera)
Семейство Постельные клопы (Cimicidae)
Род Постельный клоп (Cimex)
Вид Постельный клоп (Cimex lectularius)
Отряд Бабочки (чешуекрылые)
(Lepidoptera) Подотряд Разнокрылые (Frenata)
Семейство Настоящие моли (Tineidae)
Род Tinea
Вид Платяная моль (Tineola bisselliella
Нитт)
Отряд Жуки (Coleoptera)
Подотряд Разноядные {Polyphaga)
Семейство Кожееды (Dermestidae)
Род Anthrenus Вид Кожеед смирновский (Attagenus smirnovi Zhan)
Класс Паукообразные (Arachnida)
Отряд Пауки (Aranei)
Семейство Воронковые пауки (Agelenidae)
Род Домовые пауки (Tegenaria)
Вид Паук домовый (Tegenaria derhami)
A. He жалящие и не кусающие насекомые
Самыми распространенными насекомыми, обитающими в жилище человека, являются тараканы. Аллергия к тараканам была описана ещё в 1964 году, но сначала этой проблеме уделялось мало внимания [51,67,78,136].
Распространенность тараканов в разных типах жилых и общественных зданий (блочные, кирпичные, деревянные) свидетельствует о длительных и частых контактах с тараканами большого количества людей [17,128,141]. У людей, проживающих в крупных городах и мегаполисах, риск развития аллергических реакций выше, чем у живущих в пригороде и сельской местности. Излюбленным местом тараканов в городских квартирах является кухня и спальные комнаты [9,141].В жилищах средней полосы России встречаются, в основном, 3 вида тараканов, аллергены которых являются причиной развития аллергических заболеваний у человека: Blattella germanica, Blatta orientalis, Periplaneta americana [9,13,17,55,76,96]. В настоящее время встречается новый вид тараканов - пепельный таракан Nauphoeta cinerea, который мало изучен.
Положительная аллергическая реакция при контакте с тараканами отмечается у 22% жителей бетонных домов, однако у жителей деревянных домов аллергической реакции на тараканы обнаружено не было [23,56]. Развитие симптомов заболеваний наблюдается преимущественно в осенне-зимний период, когда идет активное размножение насекомых. Этот факт позволяет считать тараканов круглогодичным причинно-значимым фактором развития аллергических реакций [39].
Специфические IgE-антитела к таракану часто обнаруживаются в крови у пациентов с астмой и другими аллергическими состояниями [23,41,67]. Уровень IgE-AT к аллергену таракана неодинаков у больных аллергическими заболеваниями, проживающих в разных климатических условиях. Так у пациентов, живущих в сухом, возвышенном над уровнем
моря регионе не обнаруживались IgE-AT к аллергену таракана, а в городской популяции до 70% астматиков имеют повышенный уровень IgE к аллергену таракана [9,35,50,122].
Наиболее выраженными аллергенными свойствами обладают фрагменты головы, кутикула и экскременты тараканов. Последние термостабильны и могут сенсибилизировать организм человека алиментарно при приеме пищи, зараженной экскрементами насекомых [7,30].
Замечено, что люди, страдающие гиперчувствительностью к аллергенам тараканов, не переносят пищевые ингредиенты, которые чаще других употребляют в пищу и тараканы [29].
Исследуя больных бронхиальной астмой в двух Северных Американских городах, Kang et al. обнаружили в их крови IgE-антитела к 2-12 компонентам аллергенов P.americana, B.germanica и Blatta orientalis. У большинства пациентов были определены IgE-AT, по крайней мере, к одному аллергену, каждого из этих насекомых [78]. Helm et al. в крови больных обнаружили IgE-AT к 8 аллергенам (18-92 kD) таракана B.germanica [73].
Как показано рядом авторов [45,47,143,149] экстракты из тел рыжих тараканов Blatella germanica содержат 6 главных аллергенов с молекулярной массой 90; 36; 25; 23; 20; 18 кДа; из американских тараканов Periplaneta americana — 5, с молекулярной массой 78; 72; 45; 32; 28 кДа; из черного таракана Blatta orientalis — 5 аллергенных белков с мол.массой 65; 52; 36; 27 и 20 кДа.
Главным аллергеном рыжего таракана {Blatella germanica) является аллерген с молекулярной массой 90 кДа, который обладает перекрестной реактивностью с аллергенами клеща домашней пыли и креветок [76,77]. Перекрестная реактивность аллергенов тараканов составляет по литературным данным от 40 до 60%, причем перекрестная аллергия между
некоторыми белками B.germanica и P.americana достигает 70-100% [150,152].
Предполагается наличие сходных эпитопов между аллергенами таракана и аллергенами таких насекомых, как жуки, моль, комары [7,67].
Одним из представителей не жалящих и не кусающих насекомых
является моль. Как причина ингаляционной аллергии моль была упомянута
в литературе уже в 1928 году, но в то время сообщалось лишь о редких,
единичных случаях [52,145]. Различные реакции, токсические и
аллергические, могут быть вызваны контактами с молью; как со взрослыми
особями, так и с личинками и гусеницами. Повреждение кожного покрова
щетинками моли само по себе вызывает раздражение кожи и облегчает
проникновение ядовитых компонентов в организм. Реакции могут быть
местными и общими. Местные реакции проявляются симптомами
дерматита, крапивницы. Общие реакции характеризуются головной болью,
лихорадкой, насморком, симптомами бронхиальной астмы и
аллергического ринита, а также развитием шоковой реакции
[7,47,60,82,109,140].
Другими представителями не жалящих и не кусающих насекомых являются различные виды жуков и их личинки (большой хрущак (Tenebrio molitor), рисовый долгоносик (Sitophilus oryzae), амбарный долгоносик (Sitophilus granarius). Например, контакты с жуками-кожеедами семейства Dermestidae вызывают дерматиты, везикулезную, папулезную сыпь, крапивницу. Присутствие частиц жуков-кожеедов в составе домашней пыли может стать причиной приступов бронхиальной астмы [7,54,75,101,116,130].
В группу не жалящих и не кусающих членистоногих входят пауки -самый большой отряд паукообразных, включающих более 27 тысяч видов. На территории нашей страны обитают около 1500 видов. Наиболее характерными представителями являются: домовый паук (Tegenaria domesticd), паук-крестовик (Araneas diadematus), тарантул (Lycosa
singoriensis), паук-серебрянка (Argyroneta aquaticd), обитающие на территории нашей страны. Очень многие виды пауков приспособились жить рядом с человеком, а некоторые - непосредственно делят с ним его жилище. Домовый паук {Tegenaria domestica) встречается как в сельских домах, так и в городских квартирах любых небоскребов [10].
Представители класса паукообразных, например, домовый паук также могут вызывать аллергические реакции, возникающие при попадании их секрета в организм через специальные прокалывающие органы [72].
Б. Не жалящие кусающие насекомые
Ярким представителем кусающих насекомых является рыжий муравей [79]. Рыжие муравьи при нападении сначала выбрасывают струю муравьиной кислоты, а затем кусают мощными челюстями. Попадая в ранку, кислота причиняет жжение, зуд, боль, иногда весьма ощутимое. В тяжелых случаях при укусах муравьями могут появиться и симптомы респираторной аллергии, в частности, приступы бронхиальной астмы [36,95,98]. Эти реакции могут быть либо вследствие первичной сенсибилизации к муравьиному яду либо перекрестной реактивности при наличии аллергии к осиному яду [7].
Частицы тела рыжего домового муравья (Monomorium pharaonis) находятся в составе домашней пыли, которая является важным источником респираторной аллергии. Исследования Kim C.W. и соавт. показали повышенное содержание в образцах домашней пыли аллергенов муравья осенью и зимой, приводящее к сенсибилизации жителей таких помещений [81]. Из большого числа обследованных больных бронхиальной астмой около 18% пациентов имели положительные кожные реакции к экстракту муравья. Имеются данные, что аллергены муравья сходную белковую структуру с аллергенами клеща домашней пыли и аллергенами таракана,
что может привести к перекрестным аллергическим реакциям у больных бронхиальной астмой [80].
К кусающим насекомым относятся комнатные мухи (Musca domestica), домовые мухи {Muscina stabulans) и падальные мухи (Calliphora maggots). В литературе описаны случаи возникновения у людей симптомов ринита, крапивницы или приступов удушья при контакте с мухами [133,142]. У больных с инсектной аллергией в 10-29 % случаев регистрируются положительные кожные пробы на экстракт комнатных мух [7,71]. В экстрактах из тела домашних мух обнаружены аллергены с молекулярной массой 36; 34; 31; 27; и 17 кДа [90]. В препарате аллергена из комнатной мухи методом вестерн-блота выделены белковые компоненты с молекулярными массами 70, 50 и 16 кДа [65]. Биохимическая природа аллергенов представлена тропомиозином [90].
В. Кровососущие насекомые
Группа кровососущих насекомых включает представителей разных видов: Culicidae (комары), Cimicidae (клопы), Liposcelidae (вши), Pulicidae (блохи) и другие [16]. Аллергические реакции на укусы кровососущих насекомых (комары, клопы) выявляются у 17-20 % лиц, страдающих атопическими заболеваниями [7,92]. Они связаны с поступлением в организм слюны насекомых, содержащей наряду с токсическими, анестезирующими, противосвертывающими веществами и различные аллергены [1,17,37,53,87].
Типичные представители кровососущих насекомых - комары. В России комары распространены повсеместно, а в последние годы отмечается их большое количество в Москве [2,7,13].
Аллергенной активностью обладает секрет слюнных желез взрослого комара, а также ткани куколки. Из слюны комаров выделен высокомолекулярный белок, содержащий 34 % глицина, 11 % пролина.
В экстракте из слюны и слюнных желез комаров разных видов (в т.ч. Culex pipiens) выявлено свыше 20 белков, большинство из которых являются аллергенами с молекулярной массой от 16 до 95 кДа [107]. В Институте иммунологии ФМБА России создан и апробирован аллерген из комаров вида Aedes aegypti. Это единственный аллерген в России, разрешенный для диагностики in vivo и проведения аллерген-специфической иммунотерапии больным с инсектной аллергеией. Главным аллергеном комаров рода Aedes является аллерген Aed а 2 с молекулярной массой 37 кДа [11]. Охарактеризованы также аллергены Aed ale Мм 68 кДа, который содержит 562 аминокислотных остатка и аллерген Aed а 3 с Мм30кДа[106].
Симптомы повышенной непереносимости укусов комаров
характеризуются в основном развитием локальных кожных реакций в месте
укуса (отек, зуд, сыпь), но иногда отмечаются и общие реакции в виде
симптомов острой крапивницы, затрудненного дыхания,
гастроинтестинального синдрома. При сильно выраженных местных реакциях могут отмечаться и явления общей интоксикации в виде головной боли, тошноты, озноба, потливости, сухости во рту, бессонницы.
Развитие симптомов наблюдается чаще в сезон активного вылета комаров[2,87].
Ещё одним кровососущим насекомым, вызывающим аллергические реакции у людей, является постельный клоп (Cimex lectularius). Возвращение кровососущих клопов в страны, где они на протяжении нескольких десятков лет считались полностью уничтоженными, связано, по мнению специалистов, с отказом домовладельцев от использования высокотоксичных веществ в борьбе с другими домашними насекомыми. Пестициды, использовавшиеся ранее для борьбы с тараканами, были смертельны и для постельных клопов, однако в настоящее время тараканов чаще морят отравленным кормом, что не причиняет никакого вреда клопам, питающимся исключительно кровью.
9?
У людей, проживающих в США, Аргентине, Бразилии и других странах, описаны анафилактические реакции, связанные с укусами клопов семейства Триатомы [123]. Чувствительность больных аллергическими заболеваниями к укусу клопа зависит от количества укусов и вида насекомого. Клиническая картина ранней (немедленной) аллергической реакции развивается стремительно после укуса одной особью. Интервал между укусом и развитием симптомов в большинстве случаев составляет от 10 до 40 минут. Через несколько часов после укуса возможно усиление выраженности местных симптомов: плотного отёка, зуда, гиперемии, иногда локальной гипертермии. Существует и иная динамика проявления аллергической реакции на укус: она возникает через 6-12 часов, нарастает в течение 48 часов, характер течения рецидивирующий, возможно появление папулёзной сыпи. Отмечаются и системные реакции в виде генерализованной уртикарной сыпи, отёка Квинке, бронхоспазма [7,29,69,113,136,138]. У пациентов с папулезной крапивницей помимо IgE-антител в сыворотке крови обнаружены IgG-антитела к аллергенам постельного клопа, комара и блохи [38]. Из секрета слюнных желез клопа Т. protracta выделен белок с Мм 18-20 кДа, который идентифицирован как главный аллерген клопа. Биохимической природой этого аллергена является прокалин [57,103].
Учитывая . многообразие проявлений аллергических реакций, возникающих при укусах кровососущими насекомыми, следует помнить и о многообразии видов этих насекомых. Комар обыкновенный (Culex pipiens), блохи (Siphonaptera), слепни (Tabanidae) вызывают подобные проявления гиперэргических реакций у людей, но препаратов аллергенов данных насекомых для диагностики инсектной аллергии в отечественной аллергологической практике пока не существует.
Концепция «паналлергии»
Аллергены представителей разных отрядов насекомых могут вызывать перекрестные реакции у пациентов с аллергическими заболеваниями. Вероятно, это может быть связано с наличием сходных по структуре аллергенных белков у разных насекомых и тем, что «воздушный планктон» содержит дебрис разных видов насекомых. В результате происходит одновременная сенсибилизация аллергенами насекомых, относящихся к разным семействам и отрядам, приводящая к поливалентному характеру аллергии [7,89,136,146]. Это положение лежит в основе понятия «паналлергия».
«Концепция «паналлергии» заключается в том, что лица, чувствительные к одному виду членистоногих, могут иметь аллергическую реакцию к другим видам. По-видимому, это обусловлено наличием перекрестно-реагирующих аллергенов, включающих высокогомологичные белки насекомых, клещей, ракообразных, моллюсков и паразитов [48,59,61,64,115]. Такими белками являются тропомиозин, липопротеин [47], лизосомальная аспартатпротеаза [43], группа белков суперсемейства гемоцианина [93], мышечный белок парамиозин [52]. Тропомиозин — белок, входящий в состав миофибрилл мышц, обнаружен в мышцах моллюсков и некоторых членистоногих. Тропомиозин беспозвоночных животных обладает видовой специфичностью [40,41,45,77,78,83,84,90,125,134]. Тропомиозины беспозвоночных животных примерно на 80% гомологичны тропомиозину позвоночных животных, однако, перекрестная реактивность между ними слабая. В последние годы был выявлен новый класс пан-аллергенов беспозвоночных, вызывающих перекрестные реакции. К ним относится фермент аргининкиназа с Мм 40 кДа [52]. Этот фермент катализирует обратный перенос высокоэнергетического фосфата от АТФ к L -аргинину, образуя АДФ и N - фосфо - L - аргинин, служащий энергетическим депо в клетках беспозвоночных [62,151]. (В отличие от
беспозвоночных, позвоночные животные депонируют энергию в виде креатинфосфата, в связи с чем обладают активностью креатинкиназ).
M.Focke и соавт. обнаружили в экстракте комнатной мухи методом вестерн-блота белковые компоненты с молекулярными массами 70, 50 и 16 кДа [65]. Сходные белки определялись в экстрактах рыжего, черного, американского тараканов. Наличие белков одинаковой молекулярной массы у разных насекомых может обуславливать возникновение перекрестно-аллергических реакций у больных на аллергены указанных насекомых.
Класс перекрестно-реагирующих паналлергенов может быть вовлечен
в индукцию и поддержание респираторной и алиментарной аллергии у
полисенсибилизированных пациентов [47,89,119]. Так у пациентов с
аллергией на клеща домашней пыли (КДП), ранее подвергавшихся
аллерген-специфической иммунотерапии (АСИТ) КДП или в процессе
такого лечения, после употребления в пищу креветок или улиток возможны
аллергические реакции при контакте с насекомыми
[59,105,118,119,139,148]. Алиментарная провокация специфическими аллергенами ракообразных, высвобождающимися в процессе кулинарной обработки, может сопровождаться возвратом клинических симптомов аллергии. При этом выраженность аллергической реакции варьирует от кожных проявлений в виде эритемы и индурации кожи и подкожной клетчатки в области предплечья в участках проведения АСИТ КДП до анафилактического шока [48].
З.Симптоматика аллергических заболеваний, вызванных различными членистоногими
Членистоногие могут вызывать разнообразные по тяжести и клиническим проявлениям патологические реакции - от легкого раздражения кожи до смертельного анафилактического шока [3,53,97]. У
лиц, несенсибилизированных к аллергенам членистоногих, возникают только симптомы местной реакции: покраснение, отечность, жжение, зуд [3,28,34,114,120,132].
Аллергия к синантропным членистоногим может протекать бессимптомно, в виде скрытой сенсибилизации, и выявляться только при проведении специального аллергологического обследования. Более выраженная аллергическая реакция к синантропным членистоногим проявляется в виде локальных кожных изменений (эритемы, уртикарий, крапивницы, атопического дерматита, образования кожных язв по типу феномена Артюса [120], генерализованной некротической сыпи с исходом в рубцевание), аллергического кератоконъюнктивита, аллергического ринита, бронхиальной астмы [ПО]. Тяжелые проявления аллергической реакции могут сопровождаться в некоторых случаях потерей сознания, отеком век, языка, гортани, бронхоспазмом, диспноэ, анафилактическим шоком с летальным исходом [74,99,114].
В литературе также описываются случаи обструктивного евстахеита, аллергического васкулита, острой воспалительной демиелинизирующей полинейропатии (синдром Жильбера) и нефритического синдрома[102], сочетанного иммунного ответа по типу «сывороточной болезни» [68], а также кишечных спазмов, судорог, хронического гастрита и пептических язв [121].
Помимо полиморфности проявление аллергии к синантропным членистоногим может носить полисимптоматический характер [124], иметь длительный латентный период и круглогодичное течение в отличие от сезонной аллергии к членистоногим, обитающим в открытой природе [73]. Полисимптоматический характер инсектной аллергии привносит значительные трудности в диагностику и лечение данной группы заболеваний.
4.Принципы и методы аллергологической диагностики
инсектной аллергии
В развитии аллергопатологии могут участвовать разные факторы, а проявления аллергических заболеваний многолики и зависят не только от причины аллергии, но и от состояния иммунной и других систем организма пациента. Также существует ряд инфекционных, паразитарных и системных заболеваний, которые имеют клиническую картину, сходную с проявлениями аллергии, что затрудняет диагностику. Аллергия к насекомым характеризуется следующими отличительными признаками:
Связь клинических проявлений с контактом с насекомым.
Положительные кожные тесты с экстрактами из тел и продуктов жизнедеятельности насекомых.
- Наличие в сыворотке крови больных специфических IgE-антител к
инсектным аллергенам.
Тщательно собранный анамнез имеет большое значение в диагностике аллергии, позволяет выяснить характер заболевания и выявить предположительный аллерген или группу аллергенов. При сборе анамнеза учитывают:
связь обострения заболевания с возможным контактом с насекомыми или продуктами их жизнедеятельности
присутствие насекомых в жилище, на рабочем (учебном) месте
время между контактом с насекомым и возникновением реакции
наличие в анамнезе аллергических реакций при контакте с этим или другим насекомым
другие аллергические заболевания у больного [27,30].
Больные, сенсибилизированные к аллергенам внутрижилищных членистоногих, как правило, указывают на проживание в деревянных домах или квартирах с повышенной влажностью. Отмечается сезонность обострения аллергического заболевания - осенью, весной в период
повышенной влажности и массового размножения насекомых. Улучшение состояния больные связывают со сменой места жительства, при выходе из дома на улицу, что свидетельствует о бытовой сенсибилизации. Эти предположения должны быть подтверждены специфическими методами обследования - in vivo: кожными, провокационными тестами и in vitro: лабораторными методами, к которым относят метод твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), иммуноблот, иммунокап (ImmunoCap), хемилюминесцентный метод. С помощью специфической диагностики дифференцируются аллергические и псевдоаллергические заболевания; выявляется причинный аллерген или группа аллергенов.
Кожная проба - физиологический тест, позволяющий обнаружить сенсибилизированные тучные клетки в коже человека. Классификация кожных проб проводится по методу введения провокационного материала в зону исследования: аппликационные (накожные, patch - тесты, эпикутанные); внутрикожные пробы; прик-тест; скарификационные.
Метод кожного тестирования достаточно прост и удобен для постановки, но имеет ряд противопоказаний: распространенное поражение кожных покровов, дети младшего возраста, больные с тяжелыми хроническими заболеваниями в стадии декомпенсации, риск развития аллергической реакции вплоть до развития анафилактического шока [17,20,26]. Это относится и к конъюнктивальным, назальным и ингаляционным провокационным тестам.
Для постановки кожных проб при аллергии к не жалящим насекомым применяют аллерген из рыжего таракана, из восковой моли, из зерновой моли, из коконов тутового шелкопряда, а также аллерген из комаров вида Aedes aegypti, созданный в ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России. Постановку кожных тестов рекомендуется проводить с определенной осторожностью не менее чем через 2—3 недели после развития системной реакции. Оценивать кожную реакцию следует через 20 мин, 6, 24 и 48 часов [31].
Лабораторная диагностика, в отличие от клинических методов, имеет
ряд преимуществ, так как не связана с введением аллергена в
сенсибилизированный организм. Лабораторные методы безопасны для
больного, высоко информативны, позволяют обследовать пациентов с
высокой степенью сенсибилизации, при непрерывно рецидивирующем
течении заболевания без периодов ремиссии, а также при невозможности
отмены антигистаминных препаратов; способствуют выявлению
поливалентной сенсибилизации, когда нет возможности провести тестирование in vivo сразу всеми предполагаемыми аллергенами в ограниченные сроки обследования [27].
При определении аллерген-специфических антител in vitro возможно определение не только индивидуальных аллергенов, но и определение "панелей" - групп из нескольких родственных аллергенов, иммобилизованных на твердофазном носителе. Это удобно при обследовании больных с полисимптоматическим характером аллергических заболеваний. Исследование с помощью панели аллергенов дает возможность прогнозировать риск развития аллергических реакций при контакте с новыми аллергенами, оценить потенциальные перекрестные реакции и предупредить аллергические реакции у пациента на непредвиденный компонент.
Основным механизмом многих аллергических заболеваний является Ig Е-опосредованная аллергия. Определение специфических IgE-AT в крови человека является стандартным методом диагностики аллергии. Для этого широко применяются метод твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), иммуноблот, иммунокап (ImmunoCap), хемилюминесцентный метод.
Методы ИФА характеризуются относительной безопасностью для исследователя, стабильностью реагентов, легкостью и быстротой проведения реакции [4,5,19,21]. Чувствительность метода ИФА такова, что
позволяет определять низкий уровень реагиновых антител у детей раннего возраста, когда кожное тестирование невозможно. С помощью ИФА проводится количественное определение аллергенспецифических IgE-AT в образцах крови больного. Ценность этого метода состоит в том, что для его проведения сразу с большим количеством аллергенов требуется небольшое количество сыворотки.
Технология ImmunoCap («Phadia АВ», Швеция) используется для проведения дифференциальной диагностики между атопическими и не атопическими заболеваниями. Принцип действия системы «Иммунокап» основан на реакции иммунодиффузии. Наборы системы «Иммунокап» включают наиболее распространенные ингаляционные аллергены: бытовые, эпидермальные, пыльцевые, а также пищевые аллергены. Данный способ диагностики является простым и удобным для практики, дает возможность проанализировать одновременно десятки проб.
Метод иммуноблота основан на разделении белковых смесей в зависимости от их молекулярной массы и позволяет выявить аллерген-специфические AT к различным белкам (аллергенам). Известны коммерческие сиситемы иммуноблота (Diagnostic Products Corporation) к аллергенам из клещей домашней пыли {D.pteronissinus, D.farinae), яда некоторых насекомых, латекса.
На основе метода иммуноблота разработана тест-система AllergoScan
(Innogenetics) для количественного определения аллерген-специфических
IgE. На индикаторные полоски нанесены по 20 бытовых (ингаляционных) и
пищевых аллергенов. Результат анализа проводится путем автоматического
сканирования и содержит значения абсолютных концентраций аллерген-
специфических IgE к тестируемым аллергенам. Этот
высокочувствительный и высокоспецифичный метод подтверждает диагноз
для пациентов с положительными или неопределенными реакциями
анализов, полученных при помощи ИФА.
Для определения IgE-AT в сыворотке крови больных применяются методы, основанные на эффекте хемилюминесценции. Принцип постановки тестов такой же, как и в ИФА и PACT, однако в качестве индикатора реакции используются фотореагенты, свечение которых регистрируется на фотометре [21].
Для проведения диагностики инсектной аллергии in vitro в России используются аллергены комара {Aedes aegypti), таракана {Blattella germanica), мошки {Simulium galeraturn), шершня {Vespa crabrd), тел ос {Vespula vulgaris), тел пчел {Apis mellifera) [7,30].
Выявление специфических IgE-AT позволяет выявить факт
сенсибилизации организма определенным аллергеном, оценить степень сенсибилизации, прогнозировать остроту аллергической реакции именно на этот аллерген, оценить риск развития у пациента аллергической реакции на другие виды аллергенов, с которыми он пока еще не встречался.
Описанные методы диагностики могут быть использованы для оценки специфической активности разработанных нами препаратов аллергенов из синантропных членистоногих.
5.3аключение
Инсектная аллергия остаётся ещё малоизученной областью медицины, а быстрый рост заболеваемости атопией, утяжеление течения аллергических заболеваний и, как следствие, инвалидизация населения диктуют необходимость выявлять новые источники аллергенов.
Актуальность проблемы инсектной аллергии носит как медицинский, так и социальный характер, и связана с широкой распространенностью синантропных членистоногих, вызывающих аллергические реакции, а также с отсутствием новых диагностических препаратов инсектных аллергенов.
Учитывая вышесказанное, целью настоящего исследования является приготовление диагностических аллергенов из синантропных членистоногих и исследование их физико-химических и иммунобиологических свойств.
И. МАТЕРИАЛЫ и МЕТОДЫ
2.1. Технология получения препаратов аллергенов из синантропных
членистоногих
Препараты аллергенов из синантропных членистоногих приготавливают методом A. Coca [32]. Это общепринятый метод получения неинфекционных аллергенов водно-солевой экстракцией активных компонентов сырья.
Согласно применяемой технологии процесс получения препаратов инсектных аллергенов включает следующие этапы:
Подготовка сырья к экстракции (обезжиривание)
Экстрагирование буферным раствором следующего состава: реактив 1 - 0,5л (NaCl-50rp., КН2Р04-3,ЗЗгр., Na2HPO4-14,30rp.) и реактив 2 - 0,5л (фенол 4%) плюс дистилированная вода - 4л.
Центрифугирование
Стерилизующая фильтрация
Диализ
Получение готовой формы
Готовые формы доводят до требуемой концентрации и разливают в стерильные флаконы.
2.2. Определение безвредности и токсичности препаратов инсектных
аллергенов
Данное исследование осуществляется на двух видах животных: белых мышах и морских свинках, не использованных ранее в опытах. Исследуемый препарат вводят мышам внутрибрюшинно по 0,5 мл и морским свинкам подкожно по 1 мл. Наблюдают за животными в течение 7 дней [32].
О безвредности и токсичности препаратов аллергенов судят по отсутствию признаков заболеваний, снижения массы тела, гибели животных.
2.3.Определение содержания белка в препаратах инсектных аллергенов
Количественное содержание белка водно-солевых экстрактов аллергенов определяют методами Несслера и Бредфорда [32].
Метод Несслера основан на свойстве реактива Несслера давать цветную реакцию с ионами аммония, образующимися после минерализации белковых продуктов. В центрифужную пробирку вносят пипеткой 5 мл препарата и добавляют 80%-й раствор трихлоруксусной кислоты. Пробу оставляют на 20 часов при температуре 4-8С. Осадок отделяют центрифугированием при частоте вращения 2000 об/мин в течение 30 минут, промывают 1 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, вновь центрифугируют в тех же условиях и удаляют надосадочную жидкость. К осадку прибавляют 0,1 мл концентрированной серной кислоты. Затем пробу минерализуют на песочной бане не менее 10 часов до обесцвечивания содержимого пробирки. Для колориметрирования в пробирку добавляют 100 мл реактива Несслера. Реактив Несслера включает: ртуть двуйодистая - Юг, калия йодид - 5г, натрия гидроксид -20г, вода -100мл. Оптическую плотность раствора определяют на спектрофотометре при длине волны 400 нм. В качестве контрольной пробы используют 0,1 мл концентрированной серной кислоты. Чувствительность метода 0,01 мг/мл препарата.
Метод Бредфорда основан на изменении окраски Кумасси G-250 при связывании его с белком. К 4,5 мл раствора исследуемого образца добавляют 1,5 мл красителя Кумасси G-250 . Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при длине волны 620нм. Для контроля
используют пробу не содержащую белок. Концентрацию белка в препаратах аллергенов определяют по калибровочному графику. В качестве стандарта используют бычий сывороточный альбумин («Serva» Германия). Чувствительность метода 0,01 мг/мл препарата.
2.4.Электрофорез в полиакриламидном геле с додецил-сульфатом натрия (PAGE-SDS)
Изучение фракционного состава водно-солевых экстрактов аллергенов проводят методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) по Laemmli (Laemmli, 1970; Остерман, 1981) [24]. Используют вертикальную электрофорезную камеру. Для проведения электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия готовят концентрирующий и разделяющий гели в следующих объемах:
Концентрирующий гель
АА/бисАА 0,32 мл
TrisCl/SDS рН 6,8 0,6 мл
Вода 1,5 мл
ПСА 10% 0,025 мл
(персульфат аммония)
TEMED 0,005 мл
(тетраэтилендиамид)
