Введение к работе
Актуальность темы диссертации. Апоптоз, или запрограммированная клеточная гибель, - генетически детерминированный процесс, нарушения в котором лежат в основе развития многих патологических процессов [Carson D.A. et al., 1993; Hetts S.W., 1998]. Одним из важных достижений последнего времени было установление роли апоптоза в канцерогенезе [Wickremasinghe R.G. et al., 1999]. Блокировка программы апоптоза позволяет опухолевой клетке выживать вне зависимости от факторов роста и гормонов [Igney F.H. et al., 2002]. В то же время показано, что уничтожение опухолевых клеток посредством иммунотерапии, химиопрепаратов, радиотерапии происходит за счет запуска в них программы клеточной гибели [Harmun Y.A., 1997]. Очевидно, что с апоптозом связаны как образование опухоли, так и ее элиминация [Debatin К.-М. et al., 2003].
Необходимость изучения апоптоза при онкологических заболеваниях заключается в том, что способность опухолевой клетки запускать программу апоптоза отражает ее чувствительность к лекарственно-индуцируемому апоптозу как in vitro (по результатам тестов на химиочувствительность), так и in vivo (по результатам ответа на терапию). Полагают, что именно способность к запуску программы клеточной гибели связана с эффективностью химиолучевой терапии и прогнозом заболевания [Zhivotovsky В. et al., 2003].
Объективной характеристикой, отражающей способность клетки к апоптозу, является показатель так называемого «спонтанного» (culture-induced) апоптоза, который характеризует апоптоз опухолевых клеток in vitro при отсутствии специфических индукторов. Проведенные немногочисленные исследования показали наличие связи между уровнем спонтанного апоптоза и химиочувствительностью опухолевых клеток in vitro [Efferth Т. et al., 1997] и in vivo [Smith B.D. et al., 1998]. Различные экспериментальные модели и методы определения апоптоза, используемые в настоящее время, приводят к противоречивым результатам [Tsuda Н. et al., 1993; Huang R.W. et al., 1993; Banker D.E. et al., 1997; Wuchter С et al., 2000, 2002; Svirnovski A.I. et al., 2000; GarridoS.M. etal., 2001].
Способность к апоптозу рассматривается в качестве одной из характеристик опухолевых клеток, поэтому важно оценить ее взаимосвязь с другими биологическими параметрами, а также прогностическими факторами при онкогематологических заболеваниях. Так, при Т-линейном остром лимфобластном лейкозе у детей выявлена зависимость чувствительности лейкемических клеток к дексаметазон-индуцированному апоптозу от стадии дифференцировки клеток [Wuchter С. et al., 2002]. При остром миелоидном лейкозе (ОМЛ) у взрослых показано значение цитогенетических перестроек для чувствительности опухолевых клеток к спонтанному апоптозу [Banker D.E. et al., 1997]. Было установлено, что прогрессия В-хронического лимфолеикоза
(ХЛЛ) сопровождается снижением чувствительности к апоптозу [Oliveira G.B. etal.,2001].
В регуляции уровня спонтанного и лекарственно-индуцированного апоптоза лейкозных клеток участвуют многочисленные проаптотические и антиапоптотические молекулы. Так, при остром лимфобластном лейкозе (ОЛЛ) у детей экспрессия опухолевыми клетками антиапоптотического белка Вс1-2 имела обратную корреляцию с уровнем их спонтанного апоптоза, тогда как при В-ХЛЛ у взрослых были получены противоположные результаты [Bromidge T.J. et al., 1998; Haarman E.G. et al., 1999]. К настоящему времени не сформировано единого мнения о прогностическом значении показателей апоптоза. Показано, что снижение уровня спонтанного апоптоза сопровождается худшим ответом на цитостатическую терапию при ОЛЛ у детей [Malinovska I. et al., 2002; Осипова Е.Ю. и др., 2003]. Однако другие исследователи полагают, что уровень экспрессии проапоптотического CD95, антиапоптотического Вс1-2, а также уровень спонтанного апоптоза не имеют значения для прогнозирования раннего ответа на терапию и не связаны с развитием рецидивов при ОЛЛ у детей [Wuchter С. et al., 2000].
Таким образом, интерес к проблемам апоптоза опухолевых клеток объясняется как неоднозначностью имеющихся данных на современном этапе, так и возможностью практического использования полученных результатов для прогноза ответа на терапию острого лейкоза.
Связь работы с крупными научными программами, темами. Исследования по теме диссертации проведены в рамках следующих НИР: «Разработать и внедрить классификацию признаков групп риска детей с острыми лейкозами на основе биологических свойств лейкозных клеток и их чувствительности к химиопрепаратам», выполняемой по заданию ОНТП «Охрана материнства и детства и медицинская генетика» (1999-2000 гг., номер госрегистрации 2000110 от 13.01.2000); «Зависимость лекарственной чувствительности от фенотипических и генетических свойств лейкозных клеток, полученных ex vivo», выполняемой по заданию Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований (БРФФИ) (2000-2002 гг., договор № Б99М-066, номер госрегистрации 20003044); «Разработать компьютерную систему анализа прогностических факторов риска для выбора адекватной терапии острых лейкозов у детей», выполняемой по заданию МНТЦ (грант № В-522, 2001-2004 гг.); «Изучение спонтанного апоптоза in vitro леикемических клеток человека», выполняемой по заданию БРФФИ (2002-2004 гг., договор № Б01-208, номер госрегистрации 20022583).
Цель исследования. Оценка способности леикемических клеток к спонтанному апоптозу и анализ их чувствительности к химиопрепаратам in vitro в зависимости от линейного происхождения, степени дифференцировки и других биологических особенностей опухолевых клеток при острых лейкозах у детей.
Задачи исследования:
-
Сравнить эффективность использования различных методов определения апоптоза лейкемических клеток.
-
Изучить влияние линейной принадлежности и степени дифференцировки лейкемических клеток на их способность к спонтанному апоптозу и чувствительность к химиопрепаратам in vitro.
-
Проанализировать взаимосвязь спонтанного апоптоза с лекарственной чувствительностью лейкемических клеток in vitro.
-
Исследовать зависимость спонтанного апоптоза и лекарственной чувствительности лейкемических клеток in vitro от их пролиферативной активности.
-
Оценить влияние экспрессии CD95, CD95L, Вс1-2 и P-gp на уровень спонтанного апоптоза и лекарственной чувствительности лейкемических клеток in vitro.
-
Исследовать связь способности лейкемических клеток к спонтанному апоптозу и их чувствительности к химиопрепаратам in vitro с инициальным лейкоцитозом и ранним ответом на терапию при В-линейном ОЛЛ, а также выявить особенности спонтанного апоптоза и химиочувствительности опухолевых клеток при рецидивах острого лейкоза.
Объект исследования. Лейкемические клетки костного мозга детей с диагнозом острый лейкоз.
Предмет исследования. Способность лейкемических клеток подвергаться спонтанному апоптозу и цитотоксическому действию химиопрепаратов in vitro.
Гипотеза. Лейкемические клетки различной линейной принадлежности и степени дифференцировки отличаются по способности подвергаться спонтанному апоптозу и действию химиопрепаратов in vitro. Такие биологические особенности лейкемической популяции, как пролиферативная активность, плоидность, экспрессия про- и антиапоптотических молекул, белков лекарственной резистентности определяют способность опухолевых клеток подвергаться спонтанному апоптозу и действию цитостатических препаратов.
Методология и методы проведенного исследования. В работе использована методология клинико-биологического исследования: изучали биологические особенности апоптоза, пролиферации, чувствительности к химиопрепаратам лейкемических клеток при острых лейкозах у детей с целью получения значимых для клиники данных. Применяли следующие методы: выделение лейкемических клеток и их краткосрочное культивирование; флуоресцентно-микроскопический и цитофлуориметрические методы выявления апоптотических клеток; метил-тиазол-тетразолиумбромид метод (МТТ-тест) определения чувствительности лейкемических клеток к химиопрепаратам; цитофлуориметрический метод оценки распределения
опухолевых клеток по фазам клеточного цикла; иммунофенотипический и цитогенетический анализы; методы статистической обработки данных.
Научная новизна и значимость полученных результатов. Впервые
показана зависимость уровня спонтанного апоптоза лейкемических клеток от
их линейной принадлежности. Установлено, что лейкемические клетки при
ОМЛ у детей характеризуются достоверно сниженной способностью к
. спонтанному апоптозу по сравнению с ОЛЛ.
Впервые оценена способность к спонтанному апоптозу опухолевых клеток при различных субтипах de novo ОМЛ и В-линейного ОЛЛ у детей. Установлено, что опухолевые клетки при М1-М2 субтипах проявляют достоверно большую способность к спонтанному апоптозу по сравнению с МЗ и М4 субтипами ОМЛ, а опухолевые клетки при пре-В субтипе более подвержены спонтанному апоптозу, чем при Common субтипе В-линейного ОЛЛ.
Впервые показано, что лекарственная резистентность лейкемических клеток in vitro при В-линейном ОЛЛ ассоциирована с высоким уровнем экспрессии CD34 (устойчивость к L-аспарагиназе, цитарабину и этопозиду), гиподиплоидным количеством хромосом (устойчивость к винкристину), низкой чувствительностью к спонтанному апоптозу (устойчивость к цитарабину и L-аспарагиназе).
Впервые установлено, что низкий уровень спонтанного апоптоза лейкемических клеток при В-линейном ОЛЛ является фактором развития раннего рецидива заболевания. Выявлено, что при рецидивах острых лейкозов у детей лейкемические клетки проявляют сниженную способность к спонтанному апоптозу по сравнению с de novo заболеванием как при ОЛЛ, так и при ОМЛ.
Практическая (экономическая, социальная) значимость полученных результатов. Метод определения in vitro лекарственной чувствительности лейкемических клеток к цитотоксическому действию химиопрепаратов включен в перечень тестов комплексной диагностики лейкозов (Инструкция МЗ РБ № 111-1102 от 13.02.2003 г. «Применение МТТ-теста для оценки чувствительности леикозных клеток к цитостатическим препаратам in vitro и прогнозирования ответа на химиотерапию при лейкозах»). Показатели спонтанного апоптоза и чувствительности опухолевых клеток к химиопрепаратам in vitro рекомендованы и используются для стратификации групп риска с целью проведения дифференцированной химиотерапии при острых лейкозах у детей (Методические рекомендации «Стратификация групп риска у детей с острым лимфобластным лейкозом», утвержденные МЗ РБ от 4 декабря 2000 г., регистрационный номер 14-1.001-1).
Основные положения диссертации, выносимые на защиту: 1. Для выявления апоптотических лейкемических клеток наиболее чувствительными являются методы, детектирующие ранние и промежуточные, но не поздние стадии апоптоза.
-
Лейкемические клетки миелоидного происхождения по сравнению с лимфоидными характеризуются сниженной способностью к спонтанному апоптозу и менее чувствительны к действию химиопрепаратов in vitro.
-
Лекарственная резистентность лейкемических клеток при de novo В-линейном ОЛЛ ассоциирована с высоким уровнем экспрессии CD34, гиподиплоидным количеством хромосом, сниженным количеством пролиферирующих клеток, экспрессией белка P-gp, низкой чувствительностью к спонтанному апоптозу.
-
Рецидив острого лейкоза по сравнению с первично диагностированным заболеванием характеризуется снижением способности лейкемических клеток к спонтанному апоптозу и чувствительности к химиопрепаратам in vitro. Сниженная способность лейкемических клеток к спонтанному апоптозу является фактором, указывающим на возможность развития раннего рецидива острого лейкоза.
Личный вклад соискателя. Выделение, культивирование, фиксация лейкемических клеток, частично их окраска для определения уровня спонтанного апоптоза методом проточной цитофлуориметрии, а также определение апоптоза методом флуоресцентной микроскопии, МТТ-тест и анализ результатов выполнены автором самостоятельно. Все цитофлуоримет-рические исследования проводились совместно с н.с. Савицким В.П. В диссертации не использованы результаты исследований соавторов публикаций.
Апробация результатов диссертации. Результаты исследований, включенные в диссертацию, докладывались: на II съезде детских онкологов и гематологов России (Ростов-на-Дону, 4-6 июня 2001 г.); VIII и IX международном симпозиумах «Актуальные вопросы детской онкологии и гематологии» (Минск, 27-29 апреля 2000 г., 25-27 апреля 2002 г.); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии» (Минск, 25-27 октября 2000 г.); VI Всероссийской научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (20-23 мая 2002 г.); 31-ом ежегодном конгрессе международного общества экспериментальной гематологии (Монреаль, 5-9 июля 2002 г.); III международном симпозиуме "Биологические основы терапии онкогематологи-ческих заболеваний" (г. Москва, 6-7 февраля 2003 г.).
Опубликованность результатов. По теме диссертации имеется 17 научных публикаций. Из них статей в научных журналах - 6, статей в рецензируемых сборниках научных материалов - 2, тезисов докладов в материалах научных конференций и съездов научных обществ - 9. Общий объем опубликованного материала - 52 страницы.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 100 страницах машинописного текста и содержит 10 иллюстраций, 20 таблиц. Список использованных литературных источников включает 186 ссылок (в том числе 23 - на русском и 163 - на английском языках). Диссертация включает
![Оптимизация режимов лечения больных бластным кризом хронического миелолейкоза с учетом лекарственной чувствительности бластных клеток in vitro [Электронный ресурс]](/i/i/4276/186521.png "Оптимизация режимов лечения больных бластным кризом хронического миелолейкоза с учетом лекарственной чувствительности бластных клеток in vitro [Электронный ресурс] Захарова Елена Станиславовна")
