Содержание к диссертации
Оглавление. 2
Введение, 6
1. Обзор литературы. 11
1.1 Токсичные пектины из семян клещевины. Особенности трехмерной организации их молекул.
1.2 Транспорт токсинов в клетке-мишени. 31
1.3 Синтез и секреция иммуноглобулинов. 38
2, Материалы и методы, 47
Материалы. 47
Выделение токсинов и их субъединиц. 47
Получение гибридом 50
Очистка мАт. 53
Биотинилирование белков. 53
Иммобилизация мАт Rchl и 2RBK1 на BrCN-акттированную сефарозу 4В. 54
Ds-Na-ПААГ- электрофорез. 54
Системы ТИФА. 55
Изучение диссоциации субъединиц R60 и RI20. 56
Оценка устойчивости клеток к токсинам с помощью МТТ-теста. 57
Выявление признаков апоптоза. 58
Определение R60 и RTA в супернатантах и лизатах клеток хр2/0 и гибридомы 1RAK3,
предобработаниых R60. 60
Получение копъюгатов с флуорохромами ФИТЦ и А1еха568. 61
Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. 62
Предсказание антигенных детерминант RTA в области, экранированной RTB. 63
3 Результаты и обсуждение результатов. 65
3.1 Гибридомы, продуцирующие мАт против нашивного рщана и гибридомы, продуцирующие мАт против нашивного агглютинина рицина. 65
3.2 Гибридомы, продуцирующие мАт против частично денатурированной А-субъединщы
рицина. 88
3.3 Гибридомы, продуцирующие мAm, реагирующие с изолированной А-субъединицей рицина, но
не с голотоксшюм. 102
Выводы. 136
Список литературы. 137
Благодарности 160
Список сокращений
флуорохромы, используемые в КЛСМ
А субъединица агглютинина рицина В субъединица агглютинина рицина конканавалин А - лектин из Canavalia ensiformis
А1еха568, А1еха488, PicoGreen
ARTA
ARTB
СопА
Ds-Na-ПААГ белковый электрофорез в поли акри лами дном геле по
электрофорез Леммли
GFP зеленый флуоресцентый белок (green fluorescent
protein)
LAMP1 мембранный белок лизосом (lysosomal associated
membrane protein-1)
MLI виску мин — токсин из листьев Vis cum album
МТТ 3-(4,5,-диметилтиозолил-2-ил)-2,5-
дифенилтетрозолий бромид
МТТ-тест оценка жизнеспособности клеток по количеству
МТТ, восстановившегося до формазана
R120 агглютинин рицина — токсин из семян Ricinus
communis
R120bi биотинилированный агглютинин рицина
R60 рицин — токсин из семян Ricinus communis
R60bi биотинилированный рицин
RTA каталитическая субъединица рицина
RTAbi биотинилированная
А субъединица рицина
RTB лектиновая субъединица рицина
RTBbi биотинилированная
В субъединица рицина
TGN сеть транс-Гольджи
WGA лектин из зародышей пшеницы
а. к. аминокислоты
АГ аппарат Гольджи
БСА бычий сывороточный альбумин
ДМСО димети л сульфоксид
ДТТ дитиотреитол
КЛСМ конфокальная лазерная сканирующая микроскопия
ЛД50 молярная концентрация токсина, при которой
наблюдается гибель 50% клеток
М6ФР рецептор для маннозы-6-фосфата
мАт моноклональные антитела
HAT среда RPMI, содержащая гипоксантин, аминоптерин,
тимидин
ОП оптическая плотность
ОФД ортофенилендиамин
ПРК перинуклеарный рециклинговый комлартмент
ПЭГ полиэтиленгликоль
p28sPHK рибосомальная288РНК
РИБП рибосоминактивирующий(-ие) белок(-ки) второго
типа
PC А рентгено структурный анализ
ТИФА твердофазный иммуноферментный анализ
ФИТЦ, флуорохромы, используемые в КЛСМ
ТРИТЦ,
ФСБ фосфатный буфер (8мМ Na2HP04, 1мМ NaH2P04,
0,35MNaCl,pH7,4)
ЭР эндоплазм этический ретикулум
Введение к работе
Настоящая работа посвящена изучению взаимодействия белкового токсина рицина (R60) из семян клещевины с клетками гибридом. Молекула R60 образована двумя субъединицами: каталитической (А или RTA), обладающей N-гликозидазной активностью в отношении p28SPHK эукариот, и лектиновой (В или RTB). Рицин проникает в клетку в результате эндоцитоза и достигает своей цитоплазматической мишени (p28SPHK) в ходе многостадийного внутриклеточного транспорта [Sendvig K.and van Deurs В., 2000]. Это делает его удобным объектом для изучения физиологически важных клеточных процессов, например рецептор-опосредованного эндоцитоза лектинов, везикулярного транспорта, сортинга, рециклинга и транслокации белков в цитозоль.
Высокая токсическая активность каталитической субъединицы рицина позволяет использовать ее для конструирования иммунотоксинов и других препаратов направленного действия для терапии опухолевых, аутоиммунных заболевания, а также для обработки трансплантируемых органов [Sandvig and van Deurs, 1996; Kreitman, 1999]. Обсуждается также возможность создания вакцин нового поколения на основе рицина. Были получены химерные молекулы, состоящие из рекомбинантной каталитической субъединицы рицина с инактивированным ферментативным центром, лектиновой субъединицы и короткого пептида [Smith D.C, et al., 2003]. Пептид презентировался на поверхности клеток в комплексе с MHCI, после чего наблюдалась активация специфичных CD8+ Т клеток.
Гибридомные клетки, продуцирующие мАт против токсинов, эффективно используются как удобные модельные системы для изучения некоторых этапов транспорта белков [Youle R.J., Colombatti М., 1987]. В основе этих модельных систем лежит предположение, что причиной устойчивости гибридом, секретирующих мАт против токсинов, является происходящее во внутриклеточных компартментах связывание их антителами. Однако в описанных в литературе модельных системах связывание антител с токсином вне клетки невозможно было исключить полностью. Кроме того, для предотвращения взаимодействия токсина с антителами вне клетки или во внутриклеточных компартментах в системы вводились дополнительные факторы, которые могли повлиять как на внутриклеточный транспорт токсина, так и на жизнеспособность (viability) клеток гибридомы [Youle R.J., Colombatti М., 1987; Kornfeld SB, 1991; Малюченко Н.В., 1999]. Получение устойчивых к интоксикации рицином гибридом, секретирующих мАт, специфически узнающих каталитическую субъединицу, но не голотоксин, позволяет разрешить сомнения относительно корректности «гибридомной модели».
Транспорт токсина в компартмент, где происходит его связывание мАт, принципиально важен для осуществления цитотоксичности. Анализ распределения рицина и секретируемых мАт с помощью конфокальной микроскопии позволяет количественно оценить их колокализацию, и, возможно, определить компартмент, в котором происходит это взаимодействие в гибридомной клетке.
Изучение устойчивости гибридом, полученных к ненативным токсинам - один из перспективных подходов, позволяющий в ряде случаев визуализировать конформационные изменения белков, сопряженные с их внутриклеточным транспортом [Малюченко Н.В и соавторы, 1997; Малюченко Н.В и соавторы, 2000].
Анализ внутриклеточной локализации и цитотоксичности родственных лектинов растительной и бактериальной природы таких как рицин, агглютинин рицина, вискумин, волкенсин, дифтерийный токсин, псевдомонадный экзотоксин А, холерный токсин, шига-токсин и других, в совокупности с изучением их строения может оказаться эффективным для выявления структур, вовлеченных во внутриклеточный транспорт лектинов. Изучение строения токсинов подразумевает комплексный методологический подход не только с помощью РСА и сайт-направленного мутагенеза, но и серологического анализа, атомно-силовой микроскопии, а также ТИФА.
Изучение динамики процессов эндоцитоза и рециклинга, а также детекция минорных фракций токсинов и их субъединиц в клетке требует точной количественной оценки. Эти задачи позволяют решать специфичные высокочувствительные тест-системы на основе мАт. Кроме того, тест-системы для детекции рицина могут быть использованы для его выявления в парфюмерных изделиях, касторовом масле и кормах для домашних животных.
Взаимное загрязнение препаратов субъединиц токсинов, а также взаимное загрязнение R60 и R120 создает определенные трудности, как при изучении биологии растительных токсинов, так и при использовании в медицине иммунотоксинов и вакцин на основе субъединиц R60. Эта проблема может быть во многом решена за счет использования специфичных иммуносорбентов.
Цель работы: изучение особенностей взаимодействия рицина с клетками млекопитающих с использованием модельных систем на основе гибридом и тест-систем, выявляющих минимальное количество рицина и его субъединиц.
Задачи исследования:
Получить гибридомы против нативного рицина, нативного агглютинина рицина (R120) и против нативной и ненативной каталитической субъединицы рицина. Оценить устойчивость полученных гибридомных клеток к интоксикации рицином.
Охарактеризовать полученные моноклинальные антитела (мАт). На их основе создать тест-системы, позволяющие определять RTA, R60 и R120 в присутствии друг друга.
Используя полученные тест-системы оценить интенсивность процесса интернализации рицина, а также определить наличие свободной RTA в супернатантах и лизатах клеток полученных гибридом. Изучить внутриклеточное распределение секретируемых иммуноглобулинов (Ig) и рицина.
Научная новизна работы.
Получены уникальные гибридомы, секретиругощие мАт против RTA, но не R60 и устойчивые к интоксикации рицином. На их основе предложена модельная система для изучения особенностей транспорта рицина, в которой абсолютно исключено взаимодействие антител с токсином вне клетки.
На основе полученных в работе мАт, созданы уникальные тест-системы для определения RTA, не чувствительные к R60, и тест-системы, позволяющие выявлять R60 и R120 в присутствии друг друга.
Впервые выявлена свободная RTA в клетках и супернатантах клеток, предобработанных R60.
Показано, что в гибридомах, секретирующих мАт против RTA, с иммуноглобулинами (Ig) колокализуется не более 2-5% внутриклеточного пула рицина. Однако, именно попадание токсина в места колокализации с Ig принципиально важно для интоксикации клетки-мишени.
Практическая значимость.
Полученные в работе иммуноферментные тест-системы могут быть использованы в лабораторной практике для решения ряда научных проблем, а также для выявления токсичных компонентов в касторовом масле, косметике и кормах для домашних животных. Полученные в работе иммуносорбенты позволили значительно повысить степень очистки препаратов R120, RTA и RTB от взаимного загрязнения.
Фундаментальные исследования механизмов взаимодействия рицина с клеткой, и особенно механизмов транслокации токсина в цитозоль, позволят повысить эффективность фармакологических препаратов, получаемых на основе токсинов, избавиться от побочных эффектов, возникающих при их применении, а также значительно расширить область их применения в клинической практике, в том числе за счет нанотехнологий.
Похожие диссертации на Взаимодействие рицина с клетками гибридом, секретирующих антитела против его каталитической субъединицы
