Содержание к диссертации
Введение
Глава I Обзор литературы
1.1. Распространенность сахарного диабета 1 типа и поздних диабетических осложнений в мире и в России
1.2. Факторы риска развития и прогрессирования микрососудистых осложнений при сахарном диабете 1 типа
1.3. Гены ренин-ангиотензиновой системы как эндогенный фактор риска развития диабетических микроангиопатий
Глава II Материал и методы исследования
2.1. Объем исследования
2.2. Методы исследования
Глава III Результаты исследования
3.1. Характеристика групп сравнения
3.2. Состояние липидного обмена у пациентов с сахарным диабетом 1 типа в зависимости от наличия диабетических микроангиопатий
3.3. Характеристика питания и липидного обмена у детей и подростков с сахарным диабетом 1 типа
3.4. Показатели активности ангиотензинпревращающего фермента в сыворотке крови у детей с сахарным диабетом 1 типа
3.5. Анализ ассоциаций I/D полиморфизма гена АСЕ и Т174М полиморфизма гена AGT с клиническими особенностями сахарного диабета 1 типа, показателями липидного обмена и показателями активности ангиотензинпревращающего фермента
3.6. Анализ ассоциаций I/D полиморфизма гена АСЕ и Т174М полиморфизма гена AGT с клиническими особенностями сахарного диабета 1 типа, показателями липидного обмена и показателями активности ангиотензинпревращающего фермента на семейном материале
Глава IV Обсуждение результатов
Выводы
Практические рекомендации
Список литературы Приложение
- Факторы риска развития и прогрессирования микрососудистых осложнений при сахарном диабете 1 типа
- Методы исследования
- Состояние липидного обмена у пациентов с сахарным диабетом 1 типа в зависимости от наличия диабетических микроангиопатий
- Анализ ассоциаций I/D полиморфизма гена АСЕ и Т174М полиморфизма гена AGT с клиническими особенностями сахарного диабета 1 типа, показателями липидного обмена и показателями активности ангиотензинпревращающего фермента на семейном материале
Факторы риска развития и прогрессирования микрососудистых осложнений при сахарном диабете 1 типа
Сахарный диабет (СД) — состояние хронической гипергликемии, обусловленное воздействием на организм многих экзогенных и эндогенных (генетических факторов), нередко дополняющих друг друга [6,12,31]. СД занимает одну из драматических страниц мировой медицины. Самая ранняя из всех заболеваний инвалидизация и высокая смертность (третье место после сердечно-сосудистой патологии и злокачественных новообразований) определили сахарный диабет в качестве приоритета национальных систем здравоохранения всех без исключения стран мира, закрепленных Сент-Винсентской декларацией [26,34,45,57,106,97,117]. Ежегодно число больных в мире увеличивается на 5-7%, а каждые 12-15 лет — удваивается. По данным ВОЗ, в настоящее время в мире сахарным диабетом (СД) страдают около 129 млн. человек, в 2025г. их число превысит 250 млн. Примерно 10% из общего числа больных СД страдают диабетом 1 типа [7,14,142,146,149].
В течение последних двух десятилетий наши знания, касающиеся эпидемиологических характеристик сахарного диабета в детской популяции, значительно углубились и расширились. Благодаря мультинациональному проекту, известному как Olatoncl Project, собрана стандартизированная интернациональная информация о заболеваемости, факторах риска и смертности, ассоциированных с детским диабетом. Более 70 стран мира приняли участие в этом проекте. Согласно результатам этих исследований заболеваемости сахарным диабетом: - самые высокие показатели (более 20 на 100 тыс. в год) отмечены в Скандинавских странах (Финляндия, Швеция, Норвегия) и Сардинии (Италия); - средние (7 —19 на 100 тыс. в год) — в США, Новой Зеландии, Нидерландах, Испании; - низкие (менее 7 на 100 тыс. в год) в таких странах как Польша, Италия (кроме Сардинии), Израиль. К странам с наименьшим риском заболеваемости (менее 3 на 100 тыс. в год) были отнесены Чили, Мексика, Китай [15,16,130].
Частота сахарного диабета 1 типа (СД 1) в России (данные по Москве) более чем в 6 раз ниже, чем в Финляндии, и находится по данной "шкале" между Польшей и Германией (рис. №1.). В Российской Федерации на 01.01.2000. зарегистрировано 15 281 детей с сахарным диабетом 1 типа в возрасте от 0 до 14 лет. За последние пять лет отмечается рост заболеваемости с 10,4 до 13,4 случаев на 100 тыс., что соответствует средней заболеваемости в мире. За пятилетний период (1996 -2000 гг.) средняя заболеваемость в Москве составила 10,9 случаев на 100 тыс. детского населения [12].
Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в терапии СД 1, продолжительность жизни таких больных ниже среднепопуляционной и значительно увеличена смертность среди лиц молодого возраста [19].
Статистику заболеваемости и смертности при диабете определяют сосудистые осложнения. У больных СД 1 превалируют поражения глаз, почек, нервов (ретинопатия, нефропатия, нейропатия), связанные с развитием микроангиопатии [5,11,24]. Специфические для диабета поражения сосудов дебютируют уже в детском возрасте, определяя раннюю инвалидизацию больных [56,85,86,125,135].
Лидирующей причиной смертности больных СД 1 типа во всем мире является хроническая почечная недостаточность вследствие прогрессирования диабетической нефропатии (ДН) [34,48,138, 145,]. В США и Японии ДН занимает первое место по распространенности среди всех заболеваний почек (35-40 %), оттеснив на вторую-третью позицию такие почечные заболевания, как гломерулонефрит, пиелонефрит, поликистоз и др. В странах Европы «эпидемия» ДН носит не менее угрожающий характер, но удерживается на уровне 20-25% по потребности в экстракорпоральном лечении. В России смертность от почечной недостаточности при СД 1 типа, по данным Государственного регистра (1999-2000 гг.), не превышаете %, что в 3 раза ниже уровня, регистрируемого в мире на протяжении последних 30 лет. Этот пародокс можно объяснять отсутствием единой методологии регистрации смертности больных в России [54,59].
Методы исследования
Для определения активности ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) сыворотки крови использовали метод G. Maguire и С. Price(1985), модифицированный Голиковым П.П., Николаевой Н.Ю. (1998). В 2 пробирки вносили по 0,02 мл сыворотки крови, в одну пробирку добавляли 0,1 мл 1 мМ раствора фурилакрилоилфенилаланинглицилглицина (ФАПГТ) в 50 мМ трис-(гидроксиметил)-аминометановом буфере, содержащем 300 мМ хлорида натрия, рН 8,30), в другую - 0,1 мл 20 мМ раствора этилендитетроаминокапроновая кислота (ЭДТА) (контроль). Пробы инкубировали в термостате в течение 30 мин при 37 С. Затем пробирки помещали в ледяную баню и в опытную пробирку добавляли 0,1 мл ЭДТА, в контрольную - 0,1 мл раствора ФАПГТ, тщательно перемешивали. Через 5 мин в обе пробирки вносили по 2,3 мл буферного раствора и на спектрофотометре определяли оптическую плотность сред при 334 нм против воды. При этом эксинкция раствора контрольной пробы отражала исходный уровень абсорбции ФАПГТ, а экстинкция раствора опытной пробы свидетельствовала об уровне снижения абсорбции ФАПГТ в результате гидролиза субстрата ферментом до фурилакрилоиленилаланина и глицилглицина. По различию экстинкции между контрольными и опытными пробами определяли активность АПФ. Активность АПФ (в мкмоль мин 1 л 1 ) = 1667 5. Биохимические исследования выполнены совместно с аспирантами А.П. Деменковой и Л.В.Спириной под руководством д.м.н. Е.И. Кондратьевой.
Выделение тотальной ДНК проводили с помощью неэнзиматического метода с некоторыми модификациями [127].
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза (амплификация) специфической области ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксирибозид-трифосфатов, соответствующего солевого буфера и олигонуклиотидных праймеров, определяющих границы амплифицируемого участка репликации. Каждый цикл состоит из трех стадий с различными температурными режимами. На первой стадии при 94С происходит денатурация цепей ДНК, затем при 54-58 С — присоединение (отжиг) праймеров к гомологичным последовательностям на ДНК-мишени, и при температуре 72 протекает синтез новых цепей ДНК путем удлинения праймера в направлении 5 -З . В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40 циклов наработать ДНК, соответствующй размеру этого участка, в количестве, достаточным для ее детекции с помощью электрофореза.
Для генотипирования I/D полиморфизма гена АСЕ разделение продуктов амплификации проводили путем электрофореза в 2% агарозном геле с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете. Применяли следующую номенклатуру аллелей гена АСЕ: - аллель I (490 п.н.) - наличие (инсерция) Alu-повтора, аллель D (190 п.н.) - его отсутствие (делеция).
Для анализа рестрикционного полиморфизма Т174М гена AGT продукты амплификации подвергали гидролизу рестриктазой Bsp 191 («Сибэнзим», Россия). Объем рестрикционной смеси (10 мкл) включал 5 мкл амплификата, 1 мкл 10-кратного буфера для рестриктазы, поставляемого вместе с ферментом, и 2 единицы активности фермента Bsp 19 1. Рестрикцию проводили в микрокамерах для иммунологических реакций в течении 10-12 часов в термостате при темпратуре +37 С. Сверху для предотвращения испарения смесь закрывали 10 мкл минерального масла.
Разделение продуктов рестрикции ферментом Bsp 191 проводили путем элекрофореза в 8% полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием. Для электрофореза использовали трисацетатный буфер. В качестве маркеров молекулярного размера применяли ДНК плазмиды pUC19, гидролизованную ферментом Mspl. При электрофоретическом разделении продуктов рестрикции выявляются два аллельных варианта: аллель Т (отсутствие сайта рестрикции) - один фрагмент длиной 303 п.н.; аллель М (присутствие сайта) - два фрагмента 211 п.н. и 92 п.н. Нуклеотидная последовательность праймеров соответствовала данным, приведенным в литературе (табл. 14).
После идентификации полученные результаты вносились в компьютерную базу данных, и проводилась их последующая статистическая обработка с применением специальных программ.
Фенотипическое описание изменчивости изучаемых признаков и анализ их связи проводили с помощью стандартных методик, включая оценку параметров распределения количественных показателей (среднее значение дисперсии, стандартные ошибки средних). Использовали следующие методы статистического анализа: дисперсионный анализ, линейный регрессионный. Проводился корреляционный анализ с определением ранговой корреляции, сравнение групп по критерию Стьюдента [8,30].
Состояние липидного обмена у пациентов с сахарным диабетом 1 типа в зависимости от наличия диабетических микроангиопатий
Таким образом нарушения липидного обмена в виде статистически значимого повышения уровня ХС, ТГ, ХС-ЛПНП и ХС-ЛПОНП по сравнению с пациентами с СД 1, не имеющих диабетических микроангиопатий, обнаружено у больных СД 1 с сочетанием диабетической нефро- и ретинопатии. Не обнаружено статистически значимых различий показателей липидного обмена у пациентов с наличием только диабетической нефропатии или ретинопатии при сравнении с пациентами с СД 1 без осложнений.
Для верификации достоверности данного лабораторного исследования мы провели оценку чувствительности и специфичности теста среди обследуемой группы пациентов.
Примечание: - р 0,05, р - достигнутый уровень значимости различий группы пациентов с СД 1 с удовлетворительной компенсацией жирового обмена по сравнению с группой пациентов с СД 1 с неудовлетворительной компенсацией жирового обмена Для оценки питания у детей с СД 1 были сформированы следующие группы: дети с удовлетворительной компенсацией жирового обмена (уровень общего холестерина менее 5,2 ммоль/л), дети с неудовлетворительной компенсацией жирового обмена (уровень общего холестерина выше 5,2 ммоль/л). Как видно из таблицы 23, дети с неудовлетворительной компенсацией жирового обмена имели статистически значимо более высокий уровень гликированного гемоглобина, чем дети с удовлетворительной компенсацией жирового обмена, что согласуется с литературными данными о взаимозависимости компенсации углеводного и жирового обмена. Соответственно в группе детей с неудовлетворительной компенсацией жирового обмена процент детей с наличием поздних осложнений составил 76%, в то время как в сравниваемой группе - 51%.
Мозг, почки, язык, яйца (не более 1-2 желтков в неделю), печень (не более двух раз в месяц). Как упоминалось выше, характер питания обследуемых изучался с помощью опросника, составленного на основе стандартной диетической анкеты программы CINDI, частота употребления того или иного продукта в анкете делилась на шесть категорий: 1- раз в день или чаще, 2-почти каждый день, 3 -несколько раз в неделю, 4 - раз в неделю, 5-один или несколько раз в месяц, 6 -редко или никогда. Для анализа частота употребления продуктов была разделена на две группы: часто употребляемые продукты (1- раз в день или чаще, 2-почти каждый день, 3 -несколько раз в неделю) и редко употребляемые продукты (4 - раз в неделю, 5-один или несколько раз в месяц, 6 -редко или никогда). Кроме того, продукты, согласно гиполипидемической диете по рекомендациям Европейского Общества по Атеросклерозу, были объединены по группам (табл. 24).
Сравнение особенностей питания детей с СД 1 приведено в таблице 23 и рисунка 9-12. На рисунках показано процентное количество пациентов часто употребляющих тот или иной продукт, график контрастного цвета показывает частоту употребления того же продукта в сравниваемой группе.
К продуктам с преимущественным содержанием жира отнесли творог, сыр, сливочное масло, семечки, орехи. Сравниваемые группы практически не отличались по потреблению продуктов с преимущественным содержанием жира (рис. 9).
Проведенное анкетирование показало, что пациенты с СД 1 в основном не употребляют в пищу продукты с повышенным содержанием насыщенных жиров, за исключением колбас и консерв. Частота потребления этих продуктов среди сравниваемых групп принципиально не отличалась (рис. 10).
Как известно белки играют важную роль в пластическом обмене. Помимо пластического материала, белковые продукты содержат липотропные вещества и, таким образом, регулируют липидный обмен, поэтому перегрузка белком также нежелательна, так как способствует развитию кетоацидоза. Процентное соотношение частоты употребления продуктов с преимущественным содержанием белка в двух группах практически одинаковое (рис. 11). Доля потребления продуктов содержащих сложные углеводы, клетчатки из круп, фруктов и овощей среди пациентов с СД1. Пациенты в сравниваемых группах с одинаковой частотой потребляют продукты, содержащие сложные углеводы (рис. 12).
Для того чтобы оценить как часто употребляют в пищу растительное масло пациенты с СД 1 им предлагалось ответить на вопрос: какой вид жира Вы используете при приготовлении пищи? Предлагаемые варианты ответа были: растительный, маргарин, бутербродное масло, сливочное масло, жир (говяжий, кулинарный, свиной). В группе с удовлетворительной компенсацией жирового обмена в основном при приготовлении пищи использовали бутербродное масло, и совсем не использовали жир. В группе с неудовлетворительной компенсацией жирового обмена при приготовлении пищи использовали в основном растительные жиры, но в тоже время 5% из данной группы использовало при приготовлении пищи животные жиры.
Процентное количество пациентов часто употребляющих в пищу яйца (как основной источник холестерина) в обеих группах оказалось одинаковым и равно 62 %.
Проведенное сравнение особенностей питания в группе пациентов с СД 1 с удовлетворительной компенсацией жирового обмена и в группе пациентов с СД 1 с неудовлетворительной компенсацией жирового обмена, не обнаружило существенных различий в употреблении продуктов, способных повлиять на липидный обмен.
Анализ ассоциаций I/D полиморфизма гена АСЕ и Т174М полиморфизма гена AGT с клиническими особенностями сахарного диабета 1 типа, показателями липидного обмена и показателями активности ангиотензинпревращающего фермента на семейном материале
Сахарный диабет 1 типа является мультифакторным заболеванием (МФЗ), характеризующимся специфическим аутоиммунным разрушением /3-клеток поджелудочной железы и хроническим поражением сосудов различного калибра [57]. Сахарный диабет стоит в ряду приоритетов национальных систем здравоохранения всех стран мира. Эпидемиологические исследования в разных странах свидетельствуют об увеличении заболеваемости СД I типа у детей [3,15,25,87]. Главными причинами инвалидизации и летальности больных являются поздние осложнения сахарного диабета (ретинопатия и нефропатия) [5,13,34,108].
Основной целью современного обследования, лечения и диспансерного наблюдения детей и подростков, больных сахарным диабетом 1 типа, является предупреждение развития поздних сосудистых осложнений, приводящих к ранней инвалидизации и к летальным исходам в молодом возрасте. Микрососудистые осложнения при СД 1 - являются клинически гетерогенной и этиологически многофакторной патологией. Убедительно доказано, что основным патогенетическим звеном в развитии осложнений сахарного диабета является хроническая гипергликемия и патологические метаболические изменения, которые сопутствуют гипергликемии: энергетический голод, гиперлипидемия, усиление процессов перекисного окисления липидов, снижение синтеза гликозаминогликанов, активация ренин-ангиотензин-альдостероновой системы и др [49,91,94,124].
Учитывая факт, что не всегда качественный метаболический контроль позволяет предотвратить развитие диабетических осложнений, остается актуальным поиск потенциальных факторов риска развития микроангиопатий у больных сахарным диабетом 1 типа. Исследования ангиопатий на популяционном и семейном уровне указали на наличие генетического компонента в развитии этих осложнений [16,29,107]. Современные достижения в области молекулярной генетики открыли новые перспективы в изучении патогенеза болезней: появилась возможность идентифицировать гены, продукты экспрессии которых принимают участие в развитии патологических состояний. Геномные исследования у человека позволили сформулировать и развить концепцию кандидатных генов подверженности к МФЗ, среди которых - такое клинически и генетически гетерогенное заболевание, как сахарный диабет и его осложнения, в том числе диабетическая нефропатия, ретинопатия и т. д. [44,50,65,180].
Наиболее перспективным подходом к изучению генетических факторов риска при МФЗ является концепция молекулярной генетики об ассоциации полиморфных генетических маркеров с предрасположенностью или устойчивостью к развитию патологии. Методами молекулярной медицины было установлено, что у человека гены многих ферментов, рецепторов и других белков характеризуются наличием одного или нескольких структурных полиморфизмов, которые не приводят к значимым изменениям первичной структуры белка и, соответственно, очевидным патологическим последствиям, но оказывают влияние на функциональную активность кодируемых белков. Эти специфичные для конкретной патологии маркеры могут быть выявлены задолго до ее клинической манифестации, что позволит определить группы риска, организовать их мониторинг, а в случае необходимости, назначить превентивную терапию [98,107,147,165,173,]. В число генов-кандидатов, продукты которых могут участвовать в развитии диабетических ангиопатий, входят гены, кодирующие компоненты ренин — ангиотензиновой системы (РАС) [73,75,78,88,101]. РАС играет первостепенную роль в обеспечении нормальной физиологии сосудов, оптимальной гемодинамики и, как следствие, питания тканей и органов. Спектр патологических воздействий ангиотензина II на ткань почек и сосудов очень широк (табл 72). Перечисленные органы являются мишенями, поражаемыми при сахарном диабете в первую очередь. Поэтому не удивительно, что в лечении сосудистых осложнений сахарного диабета (прежде всего диабетической нефропатии), при сахарном диабете на первый план выходят препараты, блокирующие ренин- ангиотензиновую систему, а именно ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента и антагонисты ангиотензиновых рецепторов [ 12, 68,69,71,72].
В связи с этими фактами, нами были выбраны в качестве маркерных гены РАС, ответственные за синтез АПФ и ангиотензиноген, и проведен анализ ассоциаций инсерционно-делеционного (I/D) полиморфизма гена АСЕ и Т174М полиморфизма гена AGT с сахарным диабетом 1 типа и его клиническими особенностями.
![Функциональное состояние вегетативной нервной системы у детей и подростков с сахарным диабетом 1-го типа [Электронный ресурс]](/i/i/4394/186963.png "Функциональное состояние вегетативной нервной системы у детей и подростков с сахарным диабетом 1-го типа [Электронный ресурс] Власова Марина Станиславовна")
