Содержание к диссертации
Введение
CLASS ГЛАВА 1. Обзор литературы 1 CLASS 1
1.1. Лечение туберкулеза в условиях его современного патоморфоза 11
1. 2. Применение средств растительного происхождения во фтизиатрической практике: история и перспективы 18
1.3. Цетрария исландская: химический состав, фармакологические характеристики и область применения в качестве лекарственного растения 28
CLASS ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 3 CLASS 6
2. 1. Общая характеристика материала и объем исследований... 36
2. 2. Методики, используемые in vitro, для изучения противо туберкулезной активности ислацета 37
2. 3. Модели воспроизведения экспериментального туберкуле за, схемы лечения и показатели оценки эффективности терапии 38
2. 4. Методики оценки пораженности внутренних органов 39
2. 5. Методики исследования функциональной активности спленоцитов мышей 42
2. 6. Методики исследования функциональной активности фагоцитов мышей и кроликов 42
2. 7. Определение циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови кроликов 44
2. 8. Оценка терапевтического эффекта ислацета 44
2. 9. Статистическая обработка результатов исследования 45
ГЛАВА 3. Противотуберкулезная активность ислацета в условиях in vitro и терапевтическая эффективность in vivo 46
3.1. Влияние ислацета на рост лабораторных и клинических культур микобактерий туберкулеза (опыты in vitro) 46
Эффективность монотерапии ислацетом генерализованно-3 2 47
го туберкулеза мышей, вызванного М. tuberculosis Erdman.
3.3 Эффективность ислацета в условиях монотерапии ислаце том генерализованного туберкулеза мышей, вызванного М. bovis bovinus 8 52
ГЛАВА 4. Влияние ислацета на эффективность этиотропного лечения экспериментального туберкулеза, вызванного М. Ьо-vis-bovinus 8 59
4. 1. Эффективность комплексного лечения экспериментально го туберкулеза мышей с использованием ислацета 59
4. 1. 1. Исследование влияния ислацета на функциональную активность спленоцитов и перитонеальных макрофагов мышей 69
4. 1.2. Гистологическая оценка характера изменений в легких мышей в условиях применения ислацета 78
4, 2. Эффективность ислацета при экспериментальном туберкулезе кроликов 85
4. 2. 1. Исследование влияния ислацета на функциональную активность нейтрофилов кроликов 88
4.2.2. Изучение влияния ислацета на уровень ЦИК в периферической крови кроликов 90
4. 2. 3. Гистологическая оценка характера изменений в легких кроликов в условиях применения ислацета 92
ГЛАВА 5. Влияние ислацета на эффективность этиотропной терапии мышей, зараженных клиническим штаммом МБТ с множественной лекарственной устойчивостью 96
Обсуждение Результатов 104
Выводы 115
Указатель литературы 117
- Лечение туберкулеза в условиях его современного патоморфоза
- Методики, используемые in vitro, для изучения противо туберкулезной активности ислацета
- Влияние ислацета на рост лабораторных и клинических культур микобактерий туберкулеза (опыты in vitro)
- Эффективность комплексного лечения экспериментально го туберкулеза мышей с использованием ислацета
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время в России сохраняется напряженная эпидемическая обстановка по туберкулезу (Ловкова М.Я. и др., 2001; Перельман М.И., Шилова М.В., 2002; Шилова М.В., 2005). Остаются на крайне низком уровне все показатели эффективности лечения впервые выявленных больных туберкулезом легких: прекращение бактериовыделения составило 73,5%; закрытие полости распада - 62,4%; летальность - 4,5% (Шилова М.В., 2005). Очевидные причины терапевтических неудач обусловлены неблагоприятным социальным и экологическим фоном, снижением способности организма больных к репаративным процессам, распространенностью устойчивости микобактерий к химиопрепаратам (Перельман М.И., Шилова М.В., 2002; Левашев Ю.Н., 2003; Онищенко Г.Г., 2003; Репин Ю.М., 2003; Вишневский Б.И., 2003). В клинико-морфологическом плане это сказывается в появлении прогрессирующих форм туберкулеза легких (до 72,3%) с острым началом и массивным бактериовьтделением (Соколова Г.Б. и др., 2000; Иванова Л.А. и др., 2001; Мишин В.Ю., 2001; Ариэль Б.М., 2003; Iseman М., 1998; Davey S., 2001). На фоне вынужденной полихимиотерапии с привлечением противотуберкулезных препаратов резервного ряда снижается функциональная активность систем защиты макроорганизма, регистрируются побочные реакции со стороны различных органов и систем, что обусловливает затяжное течение и хронизацию воспалительных процессов (Павлова М.В., 2000; Елькин А.В., 2000; Мишин В.Ю. и др., 2004). Более того, полирезистентность микобактерий и дефекты иммунной системы выделены в качестве ведущих факторов неэффективности лечения больных туберкулезом (Иванова Л.А., 1995; Аленова А.Х. и др., 2002; Жук Н.А., 2003). Поэтому активно разрабатываются и применяются различные технологии совершенствования терапии туберкулеза.
К настоящему времени во фтизиатрии накоплен определенный опыт использования в комплексе терапевтических мероприятий лекарственных растений, обладающих как этиотропным действием, так и способствующих ку-
пированию патофизиологических нарушений, вызванных туберкулезным процессом и длительной химиотерапией. Согласно экспериментально-клиническим данным, лекарственные растения и препараты на их основе, проявляющие туберкулостатическую активность, в сочетании с базовой химиотерапией повышают эффективность лечения на 8 — 20%, снижают формирование лекарственной устойчивости возбудителя, усиливают бактерио-статическую активность крови, сокращают бактериовыделение и сроки закрытия полостей распада в легких (Макаренко А.Б., 1989; Негматов М.М., 1991; Руденко И.В., Тронникова И.В., 1997; Джумаев Б.Д. и др., 1998; Шку-рупий В.А. и др., 2002; Виноградова Т.И. и др., 2003). В этом аспекте широкие перспективы имеет цетрария исландская или исландский мох (Cetraria islandica (L.) Аск). Цетрария исландская издавна использовалась народами России и Европы, ас 1671 г. - в официальной медицине для лечения многих заболеваний, в том числе туберкулеза. Это многолетний, листовидно-кустистый лишайник, который произрастает в странах Европы, Азии, Америки и Австралии. Лекарственным сырьем является слоевище, где в течение всего вегетационного периода накапливаются биологически активные вещества, в том числе, полисахариды, лишайниковые кислоты (Горшкова Р.П. и др., 1997). Показано, что полисахариды цетрарии исландской (лихенин, изо-лихенин, галактоманнан) обладают иммуномодулирующими, противовоспалительными, противоопухолевыми, гепатопротекторными свойствами (Га-лицкий Л.А. и др., 1997; Ingolfsdottir К. et al., 1997; Ogmundsdottir Н.М. et al., 1998). Лишайниковые кислоты (усниновая, лихестериновая, протолихестери-новая) характеризуются противомикробной активностью в отношении стафилококков, стрептококков, кислотоустойчивых микроорганизмов, грибов, простейших и вирусов (Ahmadjian V., Hale М. Е., 1973). Однако, в современной фармацевтической индустрии при наработке широкого ассортимента БАД и фитопрепаратов сложного состава, используются только полисаха-ридные комплексы цетрарии.
7 В рамках отраслевых программ «Конструирование и изучение новых лекарственных соединений на основе органического синтеза или лекарственных трав» и «Фтизиопульмонология» специалистами Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии разработана технология получения сухого экстракта (ислацет) из слоевищ цетрарии исландской, обеспечивающая максимальное извлечение, а также длительное сохранение действующих веществ (полисахаридов, лишайниковых кислот). На основании фармакологических исследований установлены низкая токсичность, противовоспалительный, антигипоксический, гепато- и гастропротекторный эффекты сухого экстракта (Сафонова М.Ю., 2002).
Цель исследования: на основе экспериментальных исследований определить возможность повышения эффективности этиотропной терапии генерализованного туберкулеза за счет сухого экстракта цетрарии исландской. Задачи исследования:
Изучить влияние ислацета на ростовые свойства микобактерий с различной характеристикой лекарственной чувствительности.
Оценить протективное и лечебное действие ислацета в условиях монотерапии экспериментального генерализованного туберкулеза мышей в сравнении с противотуберкулезными препаратами (изониазид, этамбутол, офлок-сацин).
Изучить эффективность ислацета в составе базовой химиотерапии на моделях генерализованного лекарственно-чувствительного и устойчивого туберкулеза у животных.
Исследовать особенности состояния системы иммунитета у инфицированных микобактериями туберкулеза животных, в первую очередь, моноци-тарно-макрофагального звена, в условиях применения ислацета.
Научная новизна. Впервые в эксперименте установлено прямое ингиби-рующее действие ислацета на ростовые свойства лекарственно-чувствительных и устойчивых микобактерий. В условиях монотерапии экспериментального туберкулеза определена протективная и лечебная актив-
8 ность сухого экстракта цетрарии исландской в сравнении с противотуберкулезными препаратами (изониазида, этамбутола и офлоксацина). Изучены ан-тимикобактериальные и иммунотропные механизмы действия ислацета, обеспечивающие эффективность комплексной терапии туберкулеза.
Практическая значимость работы. Полученные в ходе исследования данные о противотуберкулезной активности ислацета и эффективности на фоне химиотерапии генерализованного туберкулеза после официального разрешения для клинического применения могут быть использованы для выбора дифференцированных режимов его назначения во фтизиатрии.
Положения, выносимые на защиту:
Оригинальный сухой экстракт из слоевищ цетрарии исландской (исл-ацет) подавляет ростовые свойства чувствительных и устойчивых культур микобактерий. Протективное и терапевтическое действие ислацета в условиях монотерапии экспериментальной туберкулезной инфекции сопоставимо с этамбутолом и офлоксацином. Выраженное противотуберкулезное действие in vitro и in vivo характеризует сухой экстракт из слоевищ цетрарии исландской как активное этиотропное вещество.
Применение ислацета в комплексе с противотуберкулезными препаратами при генерализованном туберкулезе у животных, инфицированных лекарственно-чувствительными и устойчивыми штаммами микобактерий, обеспечивает выраженную положительную динамику: уменьшение эндогенной интоксикации, сокращение бактериовыделения из селезенки, ускорение регрессии воспалительных изменений в легочной ткани.
Лечебное действие сухого экстракта из слоевищ цетрарии исландской при монотерапии экспериментального генерализованного туберкулеза воспроизводится на фоне достоверного снижения высеваемости МВТ из селезенки, активации поглотительной и переваривающей способности перитоне-альных макрофагов. Высокая обратная корреляционная связь между этими
9 показателями свидетельствует о наличии у ислацета иммунотропного действия.
4. Иммунотропная направленность действия сухого экстракта из слоевищ цетрарии исландской вносит существенный вклад в улучшение результатов полихимйотерапии экспериментального туберкулеза за счет повышения пролиферации спленоцитов и продукции ими ИЛ-2, стимуляции фагоцитоза и генерации супероксиданиона перитонеальными макрофагами.
Реализация результатов работы. На основании проведенных исследований выдан патент № 2203081 RU «Препарат ислацет для профилактики и лечения туберкулеза и способ его получения».
Результаты по изучению эффективности ислацета в составе базовой химиотерапии туберкулеза включены в лабораторный регламент и отчет по его доклиническому изучению для получения разрешения на проведение клинических исследований во фтизиатрии.
Основные положения диссертации используются в научно-исследовательской работе на кафедрах фармакогнозии и фармацевтической химии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии, в преподавании фтизиатрии, фармакологии и клинической фармакологии в Военно-Медицинской академии, Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования и Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова.
Апробация материалов диссертации. Основные положения работы обсуждены на конференции «Тибетская медицина Бурятии на рубеже XXI века: состояние и перспективы исследований» (Улан-Удэ, 1999); на VII международной специализированной выставке «Аптека - 2000» (Москва, 2000); на Всероссийской научно-практической конференции «Туберкулез. Проблемы диагностики, лечения и профилактики» (Санкт-Петербург, 2003); на 10, 11 и 14 национальных конгрессах по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 2000; Москва, 2001, 2004).
По результатам исследования опубликовано 12 работ.
10 Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, четырех глав с изложением использованных методов и результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, указателя литературы, включающего 330 источник, в том числе 247 отечественных и 83 иностранных. Работа иллюстрирована 28 таблицами и 6 рисунками.
Лечение туберкулеза в условиях его современного патоморфоза
В Российской Федерации борьба с туберкулезом признана важным направлением обеспечения безопасности общества: с 1992 по 1999 г.г. рост заболеваемости наблюдался более чем в 2 раза, в первые годы XXI века темпы роста основных эпидемиологических показателей значительно снизились, однако тенденция к продолжению накопления резервуара инфекции сохраняется (Перельман М.И., Шилова М.В., 2002; Капков Д.П., 2002; Шилова М.В., 2005). Сложившаяся ситуация во многом обусловлена экономическим кризисом, военными конфликтами, усилившимися миграционными процессами, увеличением числа дезадаптированных лиц, экологическим неблагополучием, демографическими факторами.
В результате резко изменилось течение туберкулезной инфекции и структура клинических форм, возросла частота диссеминированных процессов, ин-фильтративно-казеозных и казеозных пневмоний, участились случаи (до 72,3%) прогрессирующего течения туберкулеза с острым началом и массивным бактериовыделением (Хоменко А.Г., 1999; Ерохин В.В., 2000; Соколова Г.Б., 2000; Иванова Л.А. и др., 2001; Мишин Ю.В., 2001; Черкасов В.А. и др., 2002; Ариэль Б.М., 2003; Вишневский Б.И., 2003), что ведет к формированию бациллярного ядра и определяет эпидемиологическую опасность данной категории больных.
Одной из основных составляющих противотуберкулезных мероприятий является химиотерапия - основа комплексного лечения и важнейший фактор выздоровления больных различными формами туберкулеза, значительного снижения летальности, уменьшения резервуара туберкулезной инфекции. При своевременно начатом и правильно проведенном лечении впервые выявленный туберкулез в абсолютно большинстве случаев излечивается. Принципы химиотерапии туберкулеза постоянно совершенствуются. Испытыва-ются и внедряются в практику новые схемы химиотерапии, основанные на результатах исследований о различном влиянии химиопрепаратов на внекле точно и внутриклеточно расположенные микобактерии туберкулеза, совершенствуются пути введения этиотропных препаратов для создания более высоких концентраций в очаге поражения. Также идет постоянный поиск новых средств и методов патогенетической терапии, в первую очередь, способствующих повышению защитных свойств организма и ускоряющих репаратив-ные процессы (Хоменко А.Г., 1995, 1996; Васильев А.В. и др., 1996; Чуканов В.И., 1997; Иванова Л.А., 1995; Перельман М.И., Корякин В.А., 1996; Соколова Г.Б., 1998, 2000; Крофтон Д. и др., 1997; Raviglione М.С. et al., 1995; Enarson D.A., 1995; Stead W.W., 1997; Brennan P.Y., 1997; Grange Y.M., 1997).
Распространение в 1980 - 1990 г. г. штаммов микобактерии туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (которые теперь определяются как устойчивые, по крайней мере, к Н и R) поставило под угрозу успех мероприятий по борьбе с туберкулезом (Бастиан И., Портале Ф., 2003), привело к снижению эффективности химиотерапии (Хоменко А.Г., 1996; Иванова Л.А. и др., 1997; Новикова Т.И., 1998; Iseman М. D., 1993; Bloch F. et al., 1994; Harkin T.I., Harris H. W., 1996). В 2003 г. по данным официальной статистики (Шилова М.В., 2005) показатели эффективности лечения впервые выявленных больных остаются на крайне низком уровне: закрытие полости распада - 62,4%; прекращение бактериовыделения - 73,5%; смертность - 21,8%. О низком уровне эффективности лечения свидетельствует показатель излечения в общих контингентах, не превышающий 18,4%, и абацилирования - 26,6% при частоте рецидивов 7,5 - 7,9%. Представленная характеристика проблемы на федеральном уровне подтверждается отрицательной динамикой эпидемиологических показателей в Северо-западном, Западно-Сибирском регионе и других (Племянникова Г.И. и др., 1996; Краснов В.А. и др., 1997; Марьяндышев А.О., 2002; Валиев Р.Ш., Филатова М.С, 2004; Левашев Ю.Н., Шеремет А.В., 2005).
Не вдаваясь детально в причины развития резистентности в разных регионах земного шара, необходимо подчеркнуть, что в настоящее время по данным специальных контролируемых исследований в ряде областей РФ час тота выделения лекарственно-устойчивых МБТ среди впервые заболевших достигает 19 — 26%, при обследовании клинических контингентов - до 38%, среди контингентов хронических больных ситуация еще серьезней - частота выделения лекарственно-устойчивых штаммов достигает 80 - 90% и при ост ґ ропрогрессирующих формах - до 100% (Репин Ю.М., 2003). Эффективность лечения в группах больных лекарственно-устойчивым туберкулезом зависит от спектра (множественности) и порога лекарственной устойчивости МБТ и при крайних степенях совершенно отсутствует (Хоменко А.Г. и др., 1999; Мишин В.Ю. и др., 2002).
Для «преодоления» этих трудностей в лечении туберкулеза, используется два основных подхода: «мощное» антибактериальное лечение для «преодоления» резистентности микобактерий к противотуберкулезным препаратам и применение различных средств патогенетической терапии (Хоменко А.Г., 1996; Иванова Л.А., 1995; Борисова Н.К. и др., 1994; Павлова М.В., 2000; Краснов В.А. и др., 1997; Чуканов В.И., 2001; Скворцова Л.А. и др., 2003; . Ganagacharam R., 1994; Raviglione М. et al., 1995).
Естественно, не всем больным удается провести лечение по первоначальным схемам и на каком-то этапе заболевания по разным причинам (лекарственная устойчивость, непереносимость препаратов и т.д.) режим химиотерапии может быть изменен.
Говоря о первом подходе, необходимо подчеркнуть, что Всемирная организация здравоохранения в 1991 г. сформулировала глобальную программу новой стратегии - кратковременной контролируемой химиотерапии (DOTS), основанной на введении стандартных схем лечения больных бактериовыдели-телей, с целью резкого уменьшения резервуара туберкулезной инфекции. Согласно этой программе лечение проходит в два этапа: противотуберкулезная терапия 4-5 противотуберкулезными препаратами в течение 2-3 месяцев у впервые выявленных больных и у больных с рецидивом заболевания (интенсивная фаза), а затем поддерживающая терапия 2-3 препаратами в течение 4-5 месяцев; а у больных-«хроников» индивидуализированная терапия, с учетом устойчивости микобактерий к соответствующим препаратам (Chan S.L., 1994; ChauletP. et al., 1995; Mitchison D.A., 1997, 1998; ConinxR. et al., 1999).1
В Российской Федерации также была принята федеральная программа «Неотложные меры борьбы с туберкулезом в Российской Федерации на 1998 - 2004 г. г.». По мнению М.И. Перельмана (2004), «в российской программе фактически присутствуют все пункты программы DOTS, более того, она значительно шире и прогрессивнее, чем достаточно примитивная программа DOTS».
Методики, используемые in vitro, для изучения противо туберкулезной активности ислацета
Антибактериальную активность ислацета определяли по его минимальной концентрации (мкг/мл), ингибирующей рост суспензии микобактерий, содержащей в 1 мл 5 х 107 клеток. Использовали стандартный метод двукратных серийных разведений вещества в синтетической полужидкой среде Сотона с добавлением 25% нормальной лошадиной сыворотки и питательного агара (0,35г на 100,0 мл среды). Исходная концентрация препарата составила 200,0 мкг/мл, диапазон исследуемых концентраций - от 100,0 до 1,56 мкг/мл. Культуры микобактерий туберкулеза: 1) чувствительные к существующим противотуберкулезным препаратам лабораторные тест-штаммы, входящие в Mycobacterium tuberculosis complex, полученные из Государственного учреждения «НИИ стандартизации и кон троля медицинских и биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича»: - М. tuberculosis Erdman; - М. tuberculosis H37Rv; - М. bovis bovinus 8; 2) культуры с множественной лекарственной устойчивостью, выделенные от больных с впервые выявленным туберкулезом: - №5419 СПбНИИФ, устойчива к изониазиду (10 мкг/мл), рифампицину (40 мкг/мл) и стрептомицину (50 мкг/мл); - №2483 СПбНИИФ, устойчива к изониазиду (1 мкг/мл), рифампицину (40 мкг/мл), стрептомицину (5 и 10 мкг/мл), рифабутину (40 мкг/мл), этамбутолу (2 мкг/мл).
Микобактериальную суспензию готовили ex tempore из трехнедельных культур микобактерий туберкулеза, выросших на картофельно-глицериновой среде Павловского, высушивали стерильной фильтровальной бумагой, взвешивали 1 мг полувлажной бактериальной массы (100 млн. микробных клеток), затем тщательно растирали в стерильной ступке и разводили физиологиче ским раствором или жидкой синтетической средой Сотона с 10% нормальной лошадиной сывороткой до концентрации 5 х 107 клеток в 1 мл.
В опытные пробирки с различными разведениями ислацета и контрольные пробирки, содержащие только питательную среду, вносили по 0,2 мл (1x10 клеток) микобактериальной суспензии методом поверхностного наслоения. Интенсивность роста микобактериальной пленки учитывали после 7 суток экспозиции посевов в термостате (+37С): (+++) - равномерный рост пленки на поверхности среды и стенках пробирки (высотой на 1 см); (++) — пленка значительно тоньше, высота ее на стенках не превышает 0,2 - 0,5 см; (+) - тонкая (полупрозрачная) пленка покрывает только поверхность среды, не поднимаясь на стенки пробирки; (-) - отсутствие роста МБТ. Критерием активности служила величина минимальной концентрации (МИК, мкг/мл) ислацета в питательной среде, полностью ингибирующая рост микобактериальной пленки.
Генерализованный туберкулез моделировали у беспородных белых мы-шей введением в боковую хвостовую вену взвеси (10 КОЕ в 0,2 мл) трехнедельных лабораторных чувствительных штаммов М. tuberculosis Erdman, М. bovis bovinus 8, а также клинического изолята М. tuberculosis № 5419 СПбНИИФ, устойчивого к изониазиду (10 мкг/мл), рифампицину (40 мкг/мл) и стрептомицину (50 мкг/мл).
Кроликов заражали путем введения в краевую ушную вену суспензии ла-бораторной культуры М. bovis bovinus 8(10 КОЕ в 0,5 мл).
Лечение мышей проводили по двум вариантам: 1) со второго дня после заражения; 2) при обнаружении в легких множественных субмилиарных очагов специфического воспаления (на 8-16 дни после заражения).
Ислацет мышам вводили внутрь в дозах 60 и 120 мг/кг, рекомендованных разработчиками препарата, в виде монотерапии или на фоне этиотропных средств. Для лечения животных, зараженных чувствительным лабораторным штаммом, противотуберкулезные препараты использовались в средних терапевтических дозах: изониазид - 10 мг/кг, подкожно; рифампицин — 10 мг/кг, внутрь, этамбутол - 20 мг/кг и пиразинамид - 25 мг/кг, внутрь. При терапии мышей, инфицированных клиническим штаммом с множественной лекарственной устойчивостью, противотуберкулезные препараты назначались в высших терапевтических дозах: изониазид - 25 мг/кг, подкожно; амикацин -30 мг/кг, подкожно; рифабутин - 15 мг/кг, внутрь; офлоксацин - 20 мг/кг, внутрь; этамбутол - 50 мг/кг, внутрь.
Терапию зараженных кроликов начинали при появлении в легких распространенного диссеминированного процесса (рентген-контроль). Ислацет назначали внутрь в дозе 25 мг/кг, соответствующей оптимальной дозе 120 мг/кг, установленной в опытах на мышах, на фоне этиотропных средств (изониазид -10 мг/кг, подкожно; пиразинамид - 25 мг/кг, внутрь, этамбутол - 20 мг/кг, внутрь).
Во всех экспериментах группами сравнения являлись интактные (здоровые, нелеченные), зараженные нелеченные животные (контроль заражения), а также животные, получавшие только противотуберкулезные препараты (ПТП) весь период наблюдения (контроль лечения).
Эвтаназию животных выполняли в соответствии с Методическими рекомендациями (1985): мышей выводили из опыта путем декапитации, кроликов - путем введения в краевую вену уха 10 мл 10% раствора тиопентала натрия.
Эффективность лечения туберкулезного процесса у экспериментальных животных оценивали по: динамике массы тела; выживаемости животных; макроскопическому исследованию легких, печени и селезенки с вычислением индексов их поражения и коэффициентов массы; результатам микробиологического, иммунологического и гистологического исследований.
Влияние ислацета на рост лабораторных и клинических культур микобактерий туберкулеза (опыты in vitro)
Влияние ислацета на терапевтический эффект различных комбинаций противотуберкулезных препаратов изучено в трех сериях экспериментов на 407 мышах с прогрессированием специфических воспалительных изменений в легких. Базисом полихимиотерапии служили изониазид (10 мг/кг, подкожно) и рифампицин (10 мг/кг, внутрь). Третьим специфическим препаратом являлись пиразинамид (25 мг/кг, внутрь) или этамбутол (20 мг/кг, внутрь). Исл-ацет вводили в двух дозах - 60 и 120 мг/кг, внутрь. Лечение мышей начинали на 16 день после инокуляции инфекта при выявлении в легких очагов специфического воспаления. Курс терапии составил 8 недель, ее эффективность оценивали с периодичностью в 2 недели.
Введение культуры МБТ сопровождалось развитием генерализованного процесса, о чем свидетельствовали наблюдения за животными группы контроля заражения (табл. 10). Так, дефицит массы тела мышей к 30-му дню от заражения составил 19,5%, с 23-его по 33-й день погибло 71,3 % животных, остальные были забиты на 33-й день болезни. При вскрытии мышей отмечено тотальное специфическое поражение легких: ИП- 5,63+0,14 усл. ед., коэффициент их массы - 4,76±0,35усл. ед. против 1,33+0,09 усл. ед. в интактной группе (р 0,001). В посевах селезенок мышей регистрировали сплошной рост МБТ (300,0 КОЕ).
Как видно из таблиц 10 и 11, лечение вышеуказанными комбинациями противотуберкулезных препаратов способствовало положительной динамике показателей тяжести течения специфического процесса. Уже через 2 недели лечения достоверно снизились коэффициенты массы легких - в 1,6 — 1,9 раза, а также индексы их поражения - в 1,4 - 1,8 раза (р 0,05). Следует отметить, что в течение первого месяца терапии несколько менее успешные результаты регистрировали у животных, получавших HRZ (третья группа), где по сравнению с шестой группой мышей, леченных HRE, сохранялись: отрицательная динамика массы тела (-4,1% против +12,8%), а также увеличенные (на 7,0 -22,0%) биометрические показатели легких и индексы их пораженности. К завершению курса химиотерапии прирост массы тела животных увеличился на 34,8%) и 25,6%), коэффициенты массы легких уменьшились в 1,6 и 1,4 раза (р 0,05), массивность бактериовыделения из селезенки сократилась в 7,4 и 6,9 раза соответственно в третьей и шестой группах контроля лечения.
Таким образом, использованные варианты комбинаций противотуберкулезных препаратов являлись адекватными для лечения экспериментального генерализованного туберкулеза мышей.
Влияние ислацета на лечебное действие композиций этиотропных средств оказалось неоднозначным и варьировало в зависимости от его дозы, длительности применения, а также свойств сокомпонентов (табл. 10, 11). Так, ислацет в дозе 60 мг/кг на начальном этапе (2 недели) лечения достоверно повышал на 11,4%о терапевтическую активность более слабой композиции HRZ по коэффициенту массы легких (на 14,58%, р 0,05) и индексу их поражения (на 19,75%), р 0,05). На этом же сроке наблюдали тенденцию ослабления на 12,26% эффективности более активного комплекса HRE под действием ислацета за счет увеличения показателей пораженности легких: коэффициента массы на 10,4% и индекса поражения на 26,35%. Необходимо отметить, что на данном этапе обследования мышей ислацет не влиял на уровень высеваемости МБТ из селезенки. К исходу курса лечения (8 недель) наблюдали противоположное действие ислацета в дозе 60 мг/кг на эффективность этиотропных композиций.
Так, при применении ислацета в комплексе с HRZ на фоне достоверного уменьшения индекса поражения легких (на 17,33%, р 0,05) происходило снижение на 4,05% суммарной терапевтической активности по массе легких (на 4,97%) и количеству КОЕ в посевах гомогенатов селезенки (на 24,5%). Одновременно регистрировали усиление лечебного эффекта композиции HRE под влиянием ислацета преимущественно за счет сокращения степени пораженно-сти легких (коэффициента массы на 10,27%) и индекса поражения на 15,82%, р 0,05) на фоне увеличения показателя высеваемости МБТ из селезенки на 4,35%.
Более благоприятные результаты получены при введении в схемы химиотерапии ислацета в дозе 120 мг/кг (табл. 10, 11). Так, ислацет на протяжении всего курса лечения усиливал терапевтическую активность композиции HRZ. Уже после двух недель совместного назначения HRZ + ислацет суммарный прирост эффективности терапии составил 13,72%о, что подтвердилось снижением не только коэффициентов массы легких (на 18,31%, р 0,05) и индекса их поражения (на 12,31%о, р 0,05), но и достоверным сокращением бактериовыделения из селезенки (на 10,0%, р 0,05). На завершающем этапе лечения (8 недель) в этой группе регистрировали дальнейшее усиление терапевтической активности в среднем на 20,5% с вариацией показателей пораженности от 11,6% (уменьшение массы легких) до 32,18% (снижение высеваемости МБТ, р 0,05).
Особенности влияния ислацета в дозе 120 мг/кг на лечебные свойства другой композиции HRE зависели от длительности его применения. Так, по истечении двухнедельного назначения вещества наблюдали снижение суммарной терапевтической активности на 3,83% за счет увеличения индекса поражения легочной ткани (на 14,29%).
Эффективность комплексного лечения экспериментально го туберкулеза мышей с использованием ислацета
При гистологическом исследовании проводили качественную и количественную оценку влияния ислацета на характер изменений в легочной ткани при введении его в терапию экспериментального генерализованного туберкулеза.
У зараженных нелеченных животных (группа контроля заражения) через 17 дней после инокуляции инфекта в 100% случаев отмечалось значительное снижение воздушности легочной ткани, регистрировалось небольшое количество эмфизематозно расширенных альвеол с сохранившейся воздушностью (табл. 17). Специфическое поражение представлено обширными, сливающимися участками десквамативно-казеозной пневмонии, в составе пневмонических инфильтратов (очагов альвеолярно-макрофагального экссудата) наблюдали скопления эпителиоидных клеток. Альтеративные изменения в легочной ткани зараженных нелеченных мышей характеризовались наличием скоплений нейтрофильных гранулоцитов, частично распадающихся и образующих большое количество ядерного детрита, обнаруживались сформировавшиеся очаги некроза, большей частью обширные (у 60% животных), отмечена ис-тонченность, отечность, разрыхленность, местами десквамация эпителия бронхов с отеком подслизистой (у 100,0% мышей).
Таким образом, специфическое воспаление при экспериментальном туберкулезе у зараженных нелеченных животных носило альтеративный характер с наличием выраженного некротического компонента.
Комплексная этиотропная терапия экспериментального генерализованного туберкулеза способствовала регрессии воспалительных изменений легочной паренхимы (табл. 17, 18).
Так, уже после 2-х недель лечения комплексом HRE наблюдалось увеличение ее воздушности до 40,0±21,9% против 100,0% в контроле заражения. В микропрепаратах легких животных этой группы отсутствовали очаги творожистого некроза, а также ядерный детрит (против 20% случаев при лечении HRZ).
В легочной ткани всех мышей групп контроля лечения значительно уменьшилась площадь участков десквамативнои пневмонии, альвеолы в них не содержали экссудата, клетки представлены большим количеством пенистых макрофагов, скоплениями эпителиоидных клеток и нейтрофильных гранул оцитов. В ходе лечения этиотропными препаратами наблюдалась постепенная нормализация структуры легочной ткани. К окончанию лечения (8 недель терапии) наиболее благоприятная динамика морфологических изменений регистрировалась при использовании комбинации HRE, что выражалось в восстановлении воздушности легких у 75% животных, отсутствии очагов творожистого некроза и ядерного детрита. Участки десквамативной пневмонии были невелики по площади, альвеолы в них практически свободны от экссудата, клеточный состав представлен большим количеством пенистых макрофагов, скоплениями эпителиоидных клеток и нейтрофильных гранулоцитов, наблюдалась умеренная лимфогистиоцитарная инфильтрация, эпителий бронхов в 25% случаев сохранял многорядность.
Позитивное влияние ислацета проявилось уже после 2-х недель лечения: воздушность легочной ткани восстановилась у 40 - 80% животных, обширные участки десквамативно-казеозной пневмонии встречались в 4 раза реже, сфор мированные очаги некроза не выявлялись ни в одном случае, практически не был выражен альтеративный компонент воспаления.
После 4-х недель терапии существенные различия в гистологических препаратах отмечались в группах, получавших ислацет на фоне HRZ (табл. 19). В гистологических срезах легких животных, дополнительно леченных ислаце-том в дозе 120 мг/кг, скопления нейтрофильных гранулоцитов и ядерного детрита встречались лишь в 20 - 40% случаев и отсутствовали при назначении ислацета в дозе 60 мг/кг (в контроле лечения сохранялись у 100% мышей).
