Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Морфоструктурные особенности эритроцитов (краткие сведения) 10
1.2. Антигенные системы эритроцитов 14
1.3. Иммунологические эффекты при переливании компонентов крови 22
Глава 2. Материалы и методы исследования 31
2.1. Объект и материал исследования 31
2.2. Методы исследования 34
2.2.1. Определение группы крови по системе АБО 34
2.2.2. Определение группы крови по системе Rh-Hr 35
2.2.3. Определение антиэритроцитарных антител системы Резус 36
2.2.4. Исследование количественных показателей периферической крови 36
2.2.5. Определение кислотной резистентности эритроцитов 37
2.2.6. Определение осмотической резистентности эритроцитов 37
2.2.7. Определение свободного гемоглобина в плазме крови 39
2.2.8. Исследование сорбционной емкости эритроцитов 40
2.2.9. Определение сорбционной емкости гликокаликса эритроцитов 40
2.2.10. Исследование поверхностной архитектоники эритроцитов 41
2.2.11. Статистическая обработка результатов 42
Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 43
3.1. Частота встречаемости антигенов систем АВО и Резус 43
3.2. Индекс сенсибилизации к антигенам системы Резус 48
3.3. Характеристика количественных показателей красной крови и индексов эритроцитов в зависимости от Резус-фенотипа у доноров и реципиентов 52
3.4. Характеристика кислотной и осмотической резистентности эритроцитов в зависимости от Резус-фенотипа у доноров и реципиентов 59
3.4.1. Устойчивость эритроцитов с разными Резус-фенотипами к кислотному лизису 59
3.4.2. Устойчивость эритроцитов с разными Резус-фенотипами к осмотическому лизису 68
3.5. Характеристика сорбционной емкости эритроцитов и гликокаликса в зависимости от Резус-фенотипа у доноров и реципиентов 80
3.6. Описательная характеристика поверхностной архитектоники эритроцитов с разными Резус-фенотипами у реципиентов 85
3.7. Уровень свободного гемоглобина в плазме крови в зависимости от Резус-фенотипа эритроцитов у доноров и реципиентов 88
Заключение 94
Выводы 98
Практические рекомендации 99
Список литературы 100
- Антигенные системы эритроцитов
- Частота встречаемости антигенов систем АВО и Резус
- Устойчивость эритроцитов с разными Резус-фенотипами к осмотическому лизису
- Уровень свободного гемоглобина в плазме крови в зависимости от Резус-фенотипа эритроцитов у доноров и реципиентов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Научные исследования в области трансфузиологии, изосерологии, иммунологии привели к значительному прогрессу в понимании и описании биохимических процессов, происходящих в клетках крови реципиентов.
Каждый человек иммунологически индивидуален в связи с тем, что его клетки и сывороточные белки имеют своеобразный и присущий только ему чрезвычайно широкий набор различных антигенных структур, в состав которых входят как антигены, специфические только для данных форменных элементов крови, так и антигены, свойственные различным клеткам гемопоэза [Сторожок С.А., Санников А.Г., 1997; Daniels D., 1999; Техническое руководство американской ассоциации банков крови, 2000].
Применяемые в трансфузионной медицине компоненты крови оказывают на организм больного многофакторное воздействие, зависящее как от состава и свойств трансфузионного средства, так и от реакции на них организма больного. Они вызывают сложный комплекс функциональных, биохимических и морфологических изменений, которые могут быть благоприятными (лечебное действие) или неблагоприятными (посттрансфузионные реакции и осложнения) [Дуткевич И.Г., 1998; Рагимов А.А., 2004; Серебрякова Е.Н., 2007].
В России производится около 5 млн. гемотрансфузий в год. В настоящее время во многих учреждениях практического здравоохранения донорскую кровь для переливания реципиенту подбирают только с учетом совместимости по антигенам системы АВ0 и антигену D системы Rh-Нr. При таком подборе повторные гемотрансфузии компонентов крови вызывают гемолитические реакции у 60% реципиентов, главным образом, по так называемым малым антигенам системы Rh-Нr – С, с, Е, е [Жибурт Е.Б., 2002; Рагимов А.А., 2003; Скудницкий А.Е., 2003]. Между тем, при проведении процедуры переливания крови подбор гемокомпонентов должен быть комплексным, полным, то есть включать в себя группу серологических, иммунологических, биохимических проб на индивидуальную совместимость по максимально эффективному числу методов. Данный подход не только повышает эффективность лечебной процедуры переливания крови, но и снижает опасность сенсибилизации больных к антиэритроцитарным антигенам.
На сегодняшний день переливание эритроцитов для некоторых категорий больных является основным и практически единственным методом восстановления сниженной газотранспортной функции крови. Характер непосредственного воздействия на организм гемотрансфузионных сред обусловливается структурной полноценностью и функциональной эффективностью перелитых эритроцитов, их морфологическим и биохимическим составом, степенью приживления, сохранностью и длительностью циркуляции в сосудистом русле, коллоидно-осмотическими свойствами среды, а также иммунологической совместимостью эритроцитов донора и реципиента, в том числе по АВ0-групповым и Rh-антигенам. Изучение особенностей структурного статуса эритроцитов в данном аспекте представляется особенно важным с целью предупреждения такого грозного осложнения, как иммунный гемолиз, в основе которого лежит способность поверхностных антигенов донорских эритроцитов (в случае их несовместимости с эритроцитарными антигенами реципиента) индуцировать выработку соответствующих антиэритроцитарных антител. Сенсибилизация эритроцитарными аллоантигенами, как правило, возникает при проведении длительных курсов заместительной гемокомпонентной терапии, ограничивая тем самым её эффективность [Климанский В.А., Рудаев Я.А., 1984; Тогайбаев А.А. и соавт., 1988; Hamilton S.M., 1993; Калнберзс В.К. и соавт., 1999; Минеева Н.В., 2004].
Несмотря на достаточно глубокое изучение антигенных систем крови человека, теоретическое представление об иммунных механизмах, происходящих в организме реципиента, доминирует над их практическим пониманием при использовании крови, ее компонентов и препаратов [Тодоров Й., 1986; Cartron J.P., 1994; Подберезин М.М., 1998; Шевченко Ю.Л., Жибурт Е.Б., 2000; Азизова О.А., Дементьева И.И., 2001]. Не уделяется должного внимания основной действующей единице иммунологического конфликта – эритроциту. Вместе с тем, указанные механизмы были и остаются основополагающими критериями, определяющими, с одной стороны, терапевтическую эффективность донорской крови, а с другой – вероятность развития гемотрансфузионных осложнений. Исследования АВ0- и гендерного распределения Rh-профилей эритроцитов крови, а также сенсибилизирующей активности наиболее распространенных антигенов системы Резус актуальны для профилактики гемолитических трансфузионных реакций у лиц, получающих не только экстренную, но и, прежде всего, регулярную плановую гемокомпонентную терапию по медицинским показаниям, а также в гинекологической и акушерской практике для проведения превентивных мероприятий у женщин-реципиентов с резус-отрицательной кровью, составляющих группу риска по развитию гемолитической болезни новорожденных, индуцированной посттрансфузионной изоиммунизацией.
Цель исследования: Оценить уровень иммунизации Rh-антигенами эритроцитов и влияние Резус-фенотипа на состояние периферического звена эритрона при аллогенной гемотрансфузии.
Задачи исследования:
-
Провести комплексное AВ0/Rh-типирование, охарактеризовать распределение Резус-антигенов, их комбинаций и уровень аллоиммунизации у здоровых доноров и реципиентов, получавших гемозаместительную терапию.
-
Определить групповые (АВ0) и гендерные различия Резус-фенотипов эритроцитов периферической крови у здоровых доноров и реципиентов аллогенной крови.
-
Оценить модулирующее влияние Rh-фенотипа на показатели, характеризующие состояние периферического звена эритрона, у реципиентов после массивных многократных переливаний эритроцитсодержащих компонентов аллогенной крови.
Научная новизна. По данным частотного распределения на примере г. Нижневартовска охарактеризована степень иммуногенности «минорных» (С, с, Е, е) Резус-антигенов эритроцитов, определен уровень сенсибилизации к Rh-антигенам у реципиентов аллогенной крови. По результатам антигенного типирования составлена шкала приоритетов антигенов системы Резус и Резус-фенотипов, установлены особенности их АВ0- и гендерного распределения. Показано модулирующее влияние наиболее распространенных Rh-фенотипов на характер анемического синдрома, уровень гемолиза, кислотную, осмотическую резистентность и сорбционные свойства гликокаликса эритроцитов у реципиентов в зависимости от Rh-фенотипа после проведения массивных многократных переливаний эритроцитсодержащих компонентов аллогенной крови.
Положения, выносимые на защиту:
-
Распределение антигенов системы Резус, опосредующих посттрансфузионные гемолитические реакции, на территории г. Нижневартовска представляется шкалой приоритетов: е > c > D > С > Е > d, а Резус-фенотипов – CcDee > CcDEe > ccdee > CCDee > ccDEe > Сde > ccDee > ccDEE > cdE. Наибольшей иммуногенностью в структуре «минорных» Rh-антигенов обладает Е-антиген: Е > c > C > e. Индекс сенсибилизации к Rh-антигенам эритроцитов у реципиентов аллогенной крови составляет 2,65%, у здоровых доноров – 0,60%.
-
Фенотипы CСDee и Сde более характерны для эритроцитов группы 0 (I), CcDEe, ccdee, cdE – A (II), ccDEe, ccDee B – (III), CcDee, ccDEE – AB (IV). Из них у мужчин частота обнаружения фенотипов CcDee, CCDee, CcDЕe и ccdee выше, чем у женщин.
-
Модулирующее влияние Rh-фенотипа на количественные и качественные показатели периферического звена эритрона обусловливает наличие и характер анемического синдрома, сорбционные свойства гликокаликса эритроцитов и уровень гемолиза у реципиентов после массивных многократных трансфузий эритроцитсодержащих компонентов аллогенной крови.
Теоретическое и практическое значение работы. Получены новые теоретические сведения о модулирующем влиянии Rh-фенотипа эритроцитов на состояние периферического звена эритрона у реципиентов аллогенной крови. Определены характер распределения отдельных Резус-антигенов эритроцитов и их комбинаций, частота встречаемости анти-Резус эритроцитарных антител. Полученные данные характеризуют сенсибилизационный фон населения, могут быть использованы для прогнозирования и профилактики посттрансфузионных осложнений, планирования лечебно-профилактических мероприятий в регионе, а также привлечения новых донорских кадров.
Созданный регистр 7722 типированных по антигенам системы Резус доноров г. Нижневартовска используется с целью подбора максимально совместимых пар «донор-реципиент» больным, требующим переливания гемокомпонентов аллогенной крови. Разработана новая доступная в обеспечении и использовании программа иммуносерологических исследований крови доноров и реципиентов путем аналитического определения ее антигенной совместимости и подбора совместимой крови.
Реализация апробации диссертации. Результаты исследований используются в лекционном и практическом курсе «Гематология» для студентов 5-го курса и элективном курсе «Основы общеклинического анализа. Гематология» для студентов 6-го курса медико-биологического факультета, а также преподавания раздела «Патофизиология системы крови» для студентов 3-го курса врачебных факультетов ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава. Материалы диссертации доложены на XI Межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии», Санкт-Петербург, 2005. Полученные данные применяются на станции переливания крови г. Нижневартовска при подборе крови реципиентам.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 3 в журналах, рекомендованных «Перечнем …» ВАК Минобрнауки России.
Объем и структура работы. Работа изложена на 118 страницах машинописного текста, состоит из разделов: введение, обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Библиография включает 194 источника, в том числе 146 отечественных и 48 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 33 таблицами и 16 рисунками.
Антигенные системы эритроцитов
Антигены - биоорганические вещества, которые обладают признаками генетической чужеродности и при введении в организм вызывают развитие иммунного ответа. Антиген характеризуется такими свойствами как антигенность, иммуногенность, специфичность.
Крупные белковые или полисахаридные молекулы несут несколько детерминантных группировок. Посредством определения количества молекул антител, присоединяющихся к одной молекуле антигена, рассчитывается число его реактивных групп (валентность), которое увеличивается пропорционально возрастанию молекулярной массы и имеет существенное значение для реализации антигенной функции. Различные антигенные детерминанты, расположенные на белковой полисахаридной молекуле, неравнозначны в аспекте стимуляции иммунного ответа. Наиболее активные из них получили название иммунодоминантных групп. Полисахариды, содержащие различные сахара и аминосахара, сами по себе, без связи с липидом или белком, при достаточной величине молекулярной массы могут выступать в роли полноценных антигенов. Они обязательно должны иметь повторяющиеся структурные элементы. Примером служат антигены групп крови. Антигены, по которым особи или группы особей организмов одного вида различаются между собой, получили название изоантигенов (аллоантигены) [42]. Они определяют внутривидовую индивидуальность организмов. Антигены, различающие организмы разных видов между собой называются гетероантигенами [39,117,137, 151].
Любая структура на поверхности эритроцита, способная индуцировать иммунный ответ, может рассматриваться как антиген группы крови. Экспрессия того или иного антигена зависит от наличия определенного гена и его варианта - аллеля. Большое количество генов придает антигенному составу каждого индивидуума неповторимость. Исключение составляют только однояйцовые близнецы, имеющие идентичный набор генов. Молекулы групповых веществ по своей химической природе являются либо полисахаридами, либо белками. Гены полисахаридных антигенов (АБО, Н, Р, MNSs, Lewis) кодируют специфические гликозилтрансферазы - ферменты, присоединяющие различные сахара к полисахаридным цепям-предшественникам. Гены белковых антигенов групп крови (Rh, Kell, Kidd, Duffy) кодируют полипептиды, которые самостоятельно встраиваются в мембрану эритроцита и формируют антигенные детерминанты [16, 38, 40, 50, 145, 148, 184]. Одна белковая молекула может нести несколько антигенных детерминант, к которым вырабатываются различные антитела. Ряд антигенов групп крови представлен только на эритроцитах (резус, Kell, Kidd, Duffy), другие (ABO, Lewis, Indian) экспрессируются также в некроветворных тканях [69, 175]. Отсутствуют они в хрусталике, плаценте, коже и спинномозговой жидкости.
По международной классификации (ISBT) антигены эритроцитов относятся к одной из групп: а) системы, б) коллекции, в) серии.
Системы групп крови состоят из антигенов, контролируемых одним генетическим локусом или двумя и более гомологичными генами, тесно связанными между собой. То есть основным признаком, по которому антигены объединяются в системы, является общность контролирующих их генов. Системам антигенов эритроцитов присвоены трехзначные номера, в порядке их открытия. Например: АВО - 001; MNS — 002; Резус — 004.
Коллекции групп крови содержат антигены, которые биохимически и серологически связаны на уровне фенотипа, но не могут входить в систему, поскольку не имеют общих генов, их кодирующих. Коллекции обозначаются номерами от 205 до 210.
Серии включают антигены, для которых не изучены кодирующие их гены. Они объединены в две группы - антигены с высокой частотой встречаемости под номером 901 и антигены с низкой частотой встречаемости под номером 701. В соответствии с классификацией ISBT, каждому антигену присваивается шестизначный идентификационный номер. Первые три цифры соответствуют системе (001 - 023), коллекции (205 - 215) или серии (901 -701). Следующие три цифры - порядковый номер антигена. Например, антиген А обозначается, как 001001, а антиген S - 002003.
Фенотип обозначает антигены, присутствующие или отсутствующие на эритроцитах, что определяется при взаимодействии исследуемых эритроцитов с соответствующими специфическими антисыворотками. При этом перечисляются только те антигены, по которым проводилось тестирование. При описании фенотипа антигены обозначаются знаком (+) или (-), который ставится после символа антигена [175, 141].
Одним из основных методов, с помощью которого определяют эритроцитарные антигены, служит реакция гемагглютинации [109]. Агглютинация эритроцитов опосредована антителами. Скорость и выраженность этого процесса зависят от числа эритроцитов, концентрации антител, рН, температуры и ионной силы раствора. Агглютинация происходит, когда силы связывания превышают силы отталкивания, обусловленные отрицательным зарядом клеточной поверхности эритроцитов. IgM, несущие 10 участков связывания, вызывают агглютинацию эритроцитов даже в физиологическом растворе. IgG не могут вызвать агглютинацию, пока отрицательный заряд эритроцитов не будет снижен с помощью какого-либо высокомолекулярного вещества (например, бычьего альбумина) или удаления сиаловых кислот (для этого эритроциты обрабатывают протеазами: фицином, папаином, бромелином или трипсином). Агглютинация также зависит от доступности, то есть количества и локализации молекул антигена на поверхности эритроцита. Антигены системы АВО (эритроцитарные антигены А и В) находятся на внешней поверхности клеточной мембраны и потому легко связываются с антителами, а антигены системы Rh— в ее толще. Доступность таких антигенов повышается при обработке эритроцитов ферментами.
Система АВО - первая известная антигенная система эритроцитов, которая была открыта в 1900 г. Карлом Ландштейнером [193, 194]. Изосерологическая классификация групп крови основывается на наличии или отсутствии в плазменных и клеточных элементах крови соответствующих изоантигенов (А, В) и изоантител (анти-А и анти-В). Формирование А- и В-антигенов связывают с действием генов на субстанцию Н, которая является их общим предшественником.
В настоящее время известно около 270 антигенов эритроцитов, объединенных в 29 антигенных систем. Выделяют часто встречающиеся (распространенность в популяции более 90%) и редко встречающиеся (распространенность в популяции не более 1%) антигены. К часто встречающимся относят антигены систем АВО, Резус, MNSs, Kell, Duffy и др.
Система Резус (Rh-Hr) - одна из наиболее крупных систем групп крови, объединяющая 45 антигенов, обозначенных номерами от RH1 до RH51 (из них 6 антигенов отсутствуют), которые наследуются и практически не меняются в течение всей жизни. Различное сочетание этих антигенов у одного индивида называют фенотипом системы Резус. В практической медицине, а также в учреждениях службы крови наиболее распространена номенклатура по Фишеру-Рейсу. Они обозначали антигены прописными (С, D, E) и строчными (с, d, є) буквами, что облегчает восприятие фенотипа [9,40, 136] (табл. 1).
Частота встречаемости антигенов систем АВО и Резус
Важным вопросом в оценке модулирующего влияния антигенных детерминант на поверхности эритроцитов на структурно-функциональные их свойства, является выявление частоты встречаемости исследуемых антигенов в популяции. В настоящее время известно, что у народов, проживающих в различных географических зонах, имеет место неодинаковая частота распределения эритроцитарных антигенов [1, 113, 115, 122, 164]. Как правило, северные города являются многонациональными. Население состоит из приезжих не только различных регионов России, но и ближнего и дальнего зарубежья. Смешение антигенных особенностей (смешенные браки, гемотрансфузии) каждой национальности может дать картину распределения фенотипов, отличающуюся от других регионов.
Частоту встречаемости эритроцитарных антигенов исследовали у доноров, сдавших кровь на станции переливания крови (СПК) г. Нижневартовска. Был проведен анализ донорских карточек от 6022 доноров, сдавших кровь в период с 2002 по 2007 гг. на СПК г. Нижневартовска. Также был проведен ретроспективный анализ журналов, фиксирующих данные по исследованию крови 1700 реципиентов, которые направлялись на СПК с 2002 по 2007 гг.
Проведенные исследования позволили установить следующую частоту встречаемости антигенов: А - 42,10%, В - 32,25%, D - 79,00%, С - 70,84%, с - 81,39%, E - 31,65%, є - 98,94%, d - 20,99% (табл. 6).
Среди обследованных был выявлен высокий процент лиц, эритроциты которых относились к резус-отрицательной крови (21%), что оказалось практически втрое выше, чем, к примеру, в азербайджанской популяции (6%) [135], а также почти вдвое выше, чем среди населения Среднего и Ближнего Востока, у которых частота резус-отрицательных лиц составляет 8-11% [109]. У коренных жителей Хакасии число резус-отрицательных лиц также значительно ниже — 3,5% [1]. Обращает на себя внимание постепенное увеличение доли резус-отрицательного населения в направлении от более южных и восточных территорий на север и запад страны. Так, по данным Москвы (Умнова М.А., 1979) и Первоуральска (Скудницкий А.Е., 2001), число доноров с резус-отрицательным фенотипом составляет 14,06% и 12,3% соответственно [30]. Среди жителей западной Сибири (г. Сургут) (Меркулова Н.Н., 2002) данная категория составляет 17,34%. Исследования, проводимые в малых изолированных этногруппах (коми, ханты, манси), показали более частое присутствие антигена D (99-100%) на эритроцитах в данных популяциях (Меркулова Н.Н., 2006) [74, 127, 166]. Как известно, население г. Нижневартовска состоит из слоев разных национальностей, этнических групп, приезжего и коренного населения, что объясняет генетически детерминированные качественные и количественные изменения антигенного состава крови у нового поколения жителей. Высокий процент резус-отрицательного населения города должен настораживать в отношении аллоиммунизации при гемотрансфузиях и у новорожденных при резус-конфликтной беременности антигеном D, который является наиболее иммуногенным среди других антигенов системы Резус. Необходимо рекомендовать обязательное определение антиэритроцитарных антител всем резус-отрицательным реципиентам.
Таким образом, шкала наиболее встречаемых антигенов системы Резус выглядит следующим образом: e c D C E d.
Наиболее часто встречаемые фенотипы по системе Резус в структуре АВО-групп крови у жителей т. Нижневартовска представлены в табл. 7, из которой следует, что по презентации Резус-антигенов на мембране эритроцита фенотипы CcDee и ccDEE чаще обнаруживались в АВ (IV) группе крови (35,24% и 1,15%), однако фенотип cdE в данной группе не встречался. Фенотипы CCDee и Cde чаще выявлялись в группе О (I) (18,18% и 3,17%). Сочетания антигенов CcDEe, ccdee и cdE были наиболее характерны для А (II) группы крови (24,91%; 19,55% и 0,74%). В В (III) группе преобладали фенотипы ccDEe и ccDee (12,01% и 3,13%).
Полученные данные по распределению антигенов групп крови согласуются с таковыми у европеоидов. Наиболее часто встречающаяся группа крови - 0 (I) (по некоторым регионам 0 (I) или А (II) с незначительным процентом преобладания) [30]. Наименьшее количество исследуемых доноров имело АВ (IV) группу крови.
При исследовании фенотипов эритроцитов по системе Резус (табл. 8) были получены следующие данные: на первом месте по встречаемости в г. Нижневартовске обнаруживался фенотип CcDee (в 29,55% случаев), что было ниже по сравнению с данными других регионов России. Также было выявлено меньшее по сравнению с жителями других городов количество исследуемых доноров с фенотипом ccDEe. Более высокий процент населения имел фенотип ccdee (18,41%). Остальные исследуемые фенотипы в своем распределении в популяции существенных различий с другими данными не имели.
На основании проведенной статистики мы можем выделить несколько наиболее часто встречающихся фенотипов, при работе с которыми можно думать о влиянии антигенного профиля системы Резус на ту или иную исследуемую величину. Сочетания антигенов CcDee, CcDEe, ccdee, CCDee, ccDee, которые составляли в совокупности 88,86% от всех фенотипов, имели наиболее часто встречающиеся антигены в гомо- и гетерозиготной форме, а также в различных сочетаниях друг с другом. С одной стороны, это дает возможность определить влияние каждого антигена на изменения, происходящие в эритроците после проведения гемотрансфузий, с другой -определяет четкость и наибольшую показательность исследований.
Также необходимо определить вопрос о схеме проведения гемотрансфузий. Руководствуясь действующими нормативными документами по иммуносерологии [106, 107], перед переливанием врач должен убедиться в том, что кровь донора не содержит антигены, против которых в крови реципиента содержатся антитела, т.е. она должна быть совместимой по антигенам А и В системы АВО и антигену D системы Резус. По другим антигенам системы Резус проверка на совмещение не проводится. Наличие антиэритроцитарных антител врач выясняет из анализа акушерского и трансфузионного анамнеза пациента. При невозможности уточнения анамнеза, гемотрансфузия производится, как правило, без учета антител и «минорных» антигенов. В связи с этим, существует необходимость пересмотра вопроса о концепции иммунологической совместимости эритроцитов доноров и реципиентов [31, 41].
При характеристике исследуемого контингента в зависимости от пола обращало на себя внимание значительное преобладание представителей мужского пола практически во всех фенотипах. Исключение составляли реципиенты, имеющие эритроцитарный фенотип CcDEe, среди которых процент представителей женского пола (6; 54,5%) был выше, чем мужского (5; 45,5%), что наглядно представлено на рис. 1. При этом выборка доноров мужского пола с фенотипом ccDee составляла 100%.
Устойчивость эритроцитов с разными Резус-фенотипами к осмотическому лизису
Под осмотической резистентностью эритроцитов (ОРЭ) понимается их устойчивость по отношению к гипотоническим растворам натрия хлорида. Минимальная резистентность эритроцитов определяется максимальной концентрацией гипотонического раствора натрия хлорида (в серии растворов с постепенно уменьшающейся концентрацией), при которой начинается гемолиз наименее устойчивых эритроцитов; максимальная резистентность — минимальной концентрацией гипотонического раствора натрия хлорида, вызывающего гемолиз всех эритроцитов крови, помещенных в этот раствор. Принцип метода заключается в динамической фотометрической регистрации изменения оптической плотности эритроцитарной суспензии в гипоосмотических условиях (суммарная величина светорассеяния отражает количество лизированных клеток).
Осмотическая (равно как и кислотная) резистентность эритроцитов отражает стабильность клеточных мембран. По данным И.А. Терского и И.И. Гительзона [19], гемолиз клеток протекает в несколько стадий:
1) предгемолитическая стадия;
2) стадия осмотического гемоглобинолиза;
3) стадия химического гемоглобинолиза;
4) стадия полного разрушения клеточных структур, которая включает в себя две фазы - фазу стромопороза и стромотолиза.
В прегемолитической стадии происходит выход ионов калия из клетки в окружающую среду, а также сферуляция эритроцитов.
В стадии осмотического гемоглобинолиза эритроцит набухает за пределы критического объема, что приводит к повреждению его поверхности и выходу большей части гемоглобина в плазму. Химический состав эритроцита на данном этапе не претерпевает заметных изменений, а электрохимические и коллоидно-осмотические свойства стромы почти не отличаются от свойств неповрежденных эритроцитов.
Третья стадия - стадия химического гемоглобинолиза — характеризуется полным истощением гемоглобина и переходом части стеринов (около 30-40%) в окружающую среду. На данном этапе гемолиза происходит изменение электрохимических и коллоидно-осмотических свойств эритроцитов.
В следующей стадии наблюдается разрушение клеточных структур эритроцитов. В ней различают две фазы: 1 — фаза стромопороза, в которой морфологическая целостность форменных элементов еще сохраняется, хотя клетки уже свободно пропускают электрический ток; 2 - фаза строматолиза, когда происходит полный распад стромы эритроцитов.
По данным литературы, при химическом гемолизе сферуляции и разбуханию эритроцитов предшествует этап проникновения гемолизирующего фактора в клетку [125, 131]. Возможны два варианта этого процесса: мембрана может быть проницаема и непроницаема для гемолитика. В первом случае гемолитик свободно проникает внутрь клетки, нарушает упорядочение протоплазматических структур и переводит большую часть молекул в растворенное состояние. Распадается также упорядоченная упаковка гемоглобина. Переход в раствор молекул гемоглобина повышает осмотическую активность внутриклеточного содержимого, мелкие освобожденные молекулы и ионы выходят наружу. Крупные липидные и белковые молекулы остаются в клетке, так как оболочка для них непроницаема. В результате этих процессов осмотическое давление внутри клетки увеличивается. Далее гемолиз развивается по осмотическому пути. Если же оболочка клетки непроницаема для действующего агента, к процессу гемолиза добавляется еще один этап. Проникновению гемолитика в клетку предшествует повреждение оболочки. В результате этого мембрана эритроцитов утрачивает непроницаемость для молекул лизина, после чего процесс развивается по ранее описанному пути [131].
На рис. 7 представлена кривая гипоосмотического гемолиза эритроцитов у здоровых доноров в зависимости от фенотипов. На данной кривой интенсивность гемолиза при 0,20-0,30% NaCl, являющаяся отражением лизиса наиболее устойчивых к осмотическому гемолизу эритроцитов (нижняя граница резистентности или максимальная резистентность), соответствовала 85-95% от общего числа клеток. При этом основная масса разрушенных клеток варьировала в зоне 0,10-0,40% NaCl. Начало гемолиза (верхняя граница осмотической резистентности или минимальная резистентность эритроцитов, при которой лизируются наименее устойчивые к гемолизу клетки) отмечалось при концентрации натрия хлорида, равной 0,50%. При сравнении процента гемолизированных клеток в серии убывающих растворов NaCl у обследуемых здоровых доноров в зависимости от фенотипов наиболее низкий уровень гемолиза устойчивых к осмотическому действию (0,20-0,30% NaCl) эритроцитов устанавливался при фенотипе CcDEe (р 0,05).
У реципиентов после проведенной им гемотрансфузионной терапии (рис. 8) эритроциты вовлекались в процесс гемолиза уже при 0,70% NaCl, т.е. отмечалось снижение минимальной осмотической резистентности клеток. При этом количество малостойких эритроцитов было выше, а число среднестойких эритроцитов - напротив, ниже, чем у здоровых доноров. Одновременно отмечалось увеличение количества высокостойких эритроцитов, о чем свидетельствовал более низкий уровень лизированных клеток при 0,30% NaCl (78%) и 0,20% NaCl (90%), чем в контроле (соответственно 85% и 95%) (рис. 7, 8).
При сравнении содержания гемолизированных клеток у реципиентов в зависимости от особенностей фенотипа циркулирующих эритроцитов наиболее низкий уровень гемолиза среднеустойчивых к осмотическому действию клеток при 0,40% NaCl определялся при фенотипах CcDee и CCDee, а при 0,50% NaCl - при фенотипе CcDEe (р 0,05) (рис. 8).
Процент разрушенных клеток в каждой концентрации раствора NaCl у доноров и реципиентов в зависимости от фенотипа представлен в таблицах (табл. 25-29). Динамика вовлечения эритроцитов в процесс осмотического гемолиза наглядно показана на сравнительных графиках (рис. 9-13).
У больных с фенотипом CcDee (табл. 25, рис. 9) имело место достоверное снижение (р 0,05) количества гемолизированных эритроцитов, т.е. повышение уровня ОРЭ в гипотонических растворах с концентрацией NaCl от 0,10% до 0,30%. Это свидетельствует о замедленном темпе разрушения высокостойких форм эритроцитов, повышении устойчивости эритроцитарной мембраны к осмотическим воздействиям. Однако у реципиентов с данным CcDee-фенотипом в растворах с концентрацией NaCl 0,40-0,80% регистрировалось достоверное повышение (р 0,05) процента разрушенных клеток по сравнению с данными показателями у здоровых лиц. Данный факт, напротив, свидетельствуют о повышенном распаде средне- и малостойких, возможно, деформированных под каким-либо воздействием форм эритроцитов.
При исследовании показателей осмотической стойкости мембраны эритроцитов у здоровых доноров с фенотипом CCDee (табл. 26, рис. 10) обращала на себя внимание изначально низкая устойчивость мембраны клеток к действию гемолитического фактора. При концентрации 0,30% NaCl количество разрушенных клеток в группе контроля составляло 95,27+4,12%. Такого рода повышенный уровень разрушения высокостойких форм эритроцитов у доноров с CCDee-фенотипом находился в некотором несоответствии с меньшим количеством малоустойчивых форменных элементов, сохраняющих резистентность при 0,50% NaCl.
У реципиентов с фенотипом CCDee уровень ОРЭ в гипотонических растворах с концентрацией NaCl от 0,10% до 0,30% был достоверно выше (р 0,05), а в растворах с концентрацией NaCl 0,40% и 0,50% - достоверно ниже (р 0,05; р 0,001) контрольного уровня. При этом процент гемолизированных клеток в растворах NaCl 0,60-0,80% практически не отличался от такового у здоровых лиц (табл. 26, рис. 10).
ОРЭ у реципиентов с фенотипом CcDEe (табл. 27, рис. 11) в гипотонических растворах NaCl 0,50-0,80% также не отличалась от таковой у здоровых доноров. Однако в более низких концентрациях гипотонического раствора устойчивость клеток реципиентов была ниже, а процент разрушенных клеток - выше (р 0,001), чем в группе сравнения.
Уровень свободного гемоглобина в плазме крови в зависимости от Резус-фенотипа эритроцитов у доноров и реципиентов
Часть эритроцитов ежедневно разрушается в кровеносном русле в норме (так называемый физиологический гемолиз) вследствие естественного старения эритроцитов. В результате разрушения эритроцитов происходит выход гемоглобина в окружающую эритроциты среду. Ввиду высокой токсичности свободного гемоглобина в организме существуют специальные системы для его связывания и обезвреживания. В частности, одним из компонентов системы обезвреживания гемоглобина является особый плазменный белок - гаптоглобин, специфически связывающий свободный глобин и глобин в составе гемоглобина. Комплекс гаптоглобина и глобина (или гемоглобина) захватывается макрофагами тканевой ретикуло-эндотелиальной системы (селезенки) и обезвреживается. Другой частью гемоглобинообезвреживающей системы является белок гемопексин, специфически связывающий свободный гем и гем в составе гемоглобина. Комплекс гема (или гемоглобина) и гемопексина захватывается печенью, где гем отщепляется и используется для синтеза билирубина и других желчных пигментов, или выпускается в рециркуляцию в комплексе с трансферрином для повторного использования костным мозгом в процессе эритропоэза [174, 175].
В условиях действия различных патологических агентов, направленных на изменение мембранной стабильности эритроцитов, количество поврежденных клеток увеличивается выше физиологической нормы, механизмы утилизации не справляются с уровнем токсических веществ, в результате чего повышается уровень свободного гемоглобина в крови (гемоглобинемия) и отмечается его появление в моче (гемоглобинурия). В диагностике ряда заболеваний, а также при действии различных повреждающих факторов большое значение имеет обнаружение повышенного уровня, свободного гемоглобина в крови. Увеличение количества свободного гемоглобина при переливании крови может быть обусловлено несколькими факторами: механическое повреждение клеток, связанное с разрушением эритроцитов до их попадания в кровяное русло реципиента; аллоиммунные процессы, в результате которых антиэритроцитарные антитела реципиента адсорбируются на донорских эритроцитах, связываются с антигенами их мембраны и вызывают разрушение клеток. Механизм разрушения эритроцитов зависит от характера антител и антигенов мембраны эритроцитов, против которых они направлены. Повышение уровня гемолиза возможно также под влиянием гемолизинов донора (специфических антител, способных соединяться только с эритроцитами иммунизированного человека). Гемолизины присоединяют к эритроциту комплемент, под воздействием которого происходит лизис эритроцитов реципиента.
Гемоглобин высоко токсичен при попадании значительного его количества из эритроцитов в плазму крови (что происходит при массивном внутрисосудистом гемолизе, переливании несовместимой крови и других патологических состояниях). Токсичность гемоглобина, находящегося вне эритроцитов в свободном состоянии в плазме крови, проявляется тканевой гипоксией - ухудшением кислородного снабжения тканей, перегрузкой организма продуктами разрушения гемоглобина - железом, билирубином, порфиринами. Однако нужно заметить, что данных о влиянии антигенного состава эритроцитарной мембраны на устойчивость клеток в чужеродном организме, и как показатель — уровень свободного гемоглобина в крови, в доступной литературе нет.
Метод определения малых концентраций гемоглобина в плазме крови основан на пероксидазных свойствах гемоглобина и на бензидиновой реакции [116]. В литературе нет единого мнения о нормах содержания растворенного гемоглобина в плазме у здоровых людей. Так, по мнению отдельных авторов (Кассирский И.А., Алексеев Г.А., 1947) [171], в плазме всегда присутствуют следы растворенного гемоглобина, как правило, в пределах от 0,2-2,5 мг% (Дервиз Г.В., Бялко Н.К., 1965) [34] до 1,0-4,0 мг% (Лорие Ю.И., 1964) [70].
Средние значения содержания свободного гемоглобина в крови у здоровых доноров г. Нижневартовска (взятые за «норму») варьировали в пределах от 0,13 до 0,20 мг% (табл. 33), что оказалось несколько ниже в сравнении с приведенными выше данными литературы [34, 70, 141]. При этом наиболее высокий уровень (0,20+2,12 мг%) свободного гемоглобина в крови при наибольшем как максимальном (0,205 мг%), так и минимальном (0,202 мг%) его содержании (рис. 15) выявлялся у здоровых доноров с фенотипом ccdee, что свидетельствует о высоком уровне физиологического разрушения красных клеток у лиц с данным Резус-вариантом крови.
По максимальному уровню свободного гемоглобина в плазме крови у доноров были выявлены статистически значимые отличия между фенотипами CcDee, CCDee, ccdee при сравнении с фенотипом ccDee (р 0,001). При этом в крови реципиентов с фенотипом ccDee обнаруживалось наименьшее максимальное значение показателя (0,108 мг%).
Те же фенотипы отличались по показателю среднего объема эритроцитов у здоровых доноров. При исследовании минимальных показателей гемоглобинемии у доноров в зависимости от фенотипов различия были значимыми между фенотипами CcDee и ccdee (р 0,001).
У реципиентов различия по максимальным показателям концентрации свободного гемоглобина в крови отмечались между фенотипами CcDEe, ccdee и ccDee (р 0,001). Кроме того, у реципиентов в посттрансфузионном периоде наибольший максимальный (1,87 мг%) и минимальный (0,28 мг%) уровень свободного гемоглобина в крови при повышенном среднем его содержании (0,77+0,64 мг%; р 0,001 по сравнению со здоровыми донорами) также определялся при фенотипе ccdee (рис. 16).
Как уже неоднократно отмечалось ранее, отсутствие на мембране эритроцитов основного по иммуногенности антигена D определяет фенотип ccdee как наименее безопасный при проведении переливания крови, что было продемонстрировано: а) при сравнении количественных показателей и индексов красной крови (отсутствие статистически значимых различий у доноров и реципиентов); б) при оценке иммуногенных свойств, т.е. способности антигенов с и е к индукции антителообразования (с - 11%, е — 1%). Вместе с тем, наиболее высокий при ccdee-фенотипе у доноров и реципиентов уровень свободного гемоглобина в крови при пониженной резистентности эритроцитов к кислотному и осмотическому гемолизу и повышении у реципиентов содержания патологических форм эритроцитов (24,6% по данным электронной микроскопии) может служить, с одной стороны, отражением высокого уровня разрушения клеток в крови, с другой - свидетельствовать о достаточной компенсаторной функции организма при наличии данного фенотипа. Тем не менее, такого рода изменения определяют необходимость более пристального отношения к категории резус-отрицательных реципиентов в отношении планирования объемов гемокомпонентной терапии. По-видимому, отсутствие антигена D на мембране эритроцитов не делает их абсолютно резистентными к массивной трансфузии аллогенной крови, а реципиентов с данным фенотипом — невосприимчивыми к переливаемым гемокомпонентам.
Наряду с этим, наиболее низкий минимальный уровень свободного гемоглобина в крови после переливания донорских эритроцитов был зафиксирован у реципиентов при фенотипе CcDee (0,12 мг%) (рис. 16). Наибольшее же различие по величине свободного гемоглобина между донорами и реципиентами было обнаружено при CcDEe-фенотипе эритроцитов: 0,13+4,17 мг% у доноров и 0,74+0,87 мг% - у реципиентов (табл. 32), что у последних вместе с высоким уровнем топографически измененных эритроцитов, снижением сорбционной емкости гликокаликса и кислотной и осмотической резистентности клеток может свидетельствовать об индуцированном трансфузией гемолизе эритроцитов.
В целом показатель свободного гемоглобина не является универсальным при исследовании «приживляемости» эритроцитов с определенными фенотипами в чужеродном организме, но его уровень может быть информативным при увеличении рефрактерности эритроцитов реципиента к донорским эритроцитам и отсутствии ожидаемого клинического эффекта от перелитой дозы эритроцитарной массы.
