Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 18
1.1 Краткая характеристика системы цитохрома Р-450 18
1.2. Изменение состояния системы цитохрома Р-450 под влиянием индукторов различной химической структуры 23
1.3. Роль цитохрома Ъ$ в регуляции активности изоформ цитохрома Р-450 64
1.4 Особенности изменения системы цитохрома Р-450 под влиянием индукторов у морских свинок ... 91
1.5 Изменение состояния системы цитохрома Р-450 при патологических состояниях и модуляция их проявлений факторами внешней среды . 94
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 134
2.1.Сенсибилизация животных 134
2.2. Оценка чувствительности животных к введению среднесмертельной (ЛД50) дозе гистамина 137
2.3 Методы исследования системы цитохрома Р-450 печени 137
2.4. Изучение гормонального статуса 141
2.5. Газохроматографический анализ состава жирных кислот 143
2.6. Способ введения и дозы лекарственных средств и ксенобиотиков ; 143
2.7. Экспериментальные пищевые рационы и методика проведения экспериментов по влиянию алиментарных факторов 144
2.8. Статистическая обработка результатов проведенных экспериментов 156
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 157
3.1. Влияние индукторов цитохрома Р-450 различной химической природы на состояние системы цитохрома Р-450 печени, выраженность проявлений пищевой анафилаксии и чувствительность к гистамину 157
3.2. Изменение тяжесть проявлений пищевой анафилаксии, чувствительности к среднесмертельной дозе (ЛД50) гистамина, состояния системы цитохрома Р-450 печени и метаболизма 17-оксикортикостероидов в зависимости от исходного состояния системы цитохрома Р-450 169
3.3. Изменение тяжесть проявлений пищевой анафилаксии, чувствительности к среднесмертельной дозе (ЛД50) Гистамина, состояния системы цитохрома Р-450 печени и
метаболизма 17-оксикортикостероидов под влиянием фенобарбитала и 3-метилхолантрена у животных с различным исходным состоянием монооксигеназной системы печени 187
3.4 Изменение тяжесть проявлений пищевой анафилаксии, чувствительности к среднесмертельной дозе (ЛД50) гистамина, состояния системы цитохрома Р-450 печени под
влиянием синтетических соединений пептидной при роды 206
3.5. Выраженность пищевой анафилаксии, состояние системы цитохрома Р-450 печени и метаболизм 17-оксикортикостероидов под влиянием рационов, содержавших белки коровьего молока, их гидролизат и ультрафильтрат 222
3.6. Влияние рационов, содержавших липидные композиции с различным соотношением полиненасыщенных жирных кислот семейств -6 и со-3, на состоняие системы цитохрома Р-450 печени и выраженность проявлений экспериментальной пищевой анафилаксии 233
3.7. Влияние рационов с различным углеводным составом на аллергическую реактивность, состояние системы цитохрома Р-450 печени и гормональный статус животных 254
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 269
ВЫВОДЫ 314
ЛИТЕРАТУРА 317
ПРИЛОЖЕНИЯ
392
- Краткая характеристика системы цитохрома Р-450
- Оценка чувствительности животных к введению среднесмертельной (ЛД50) дозе гистамина
- Влияние индукторов цитохрома Р-450 различной химической природы на состояние системы цитохрома Р-450 печени, выраженность проявлений пищевой анафилаксии и чувствительность к гистамину
- ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Введение к работе
Актуальность проблемы. В конце 40-х годов прошлого века Abderhalden R. (1950) сформулировал положение о том, что аллергия является болезнью развитой цивилизации, которое получает подтверждение в настоящее время. Уже в 60-е годы аллергические болезни занимали первое место среди хронических патологических состояний [Залманов А.С., 1966]. В последние годы увеличивается не только число аллергических заболеваний, но повышается и тяжесть их проявлений. Все чаще возникают поли- и даже паналлергии. У одного человека достаточно часто выявляется симптомы пищевой аллергии, сочетающиеся с поллинозами, атопической бронхиальной астмой, непереносимостью ацетилсалициловой кислоты, а также артритами различной этиологии [ErikssonN.. 1976, Panush R., 1988].
В настоящее время доказано, что в поддержании гомеостаза организма принимают участие, как и иммунная система, так и ряд ферментных систем, метаболизирующих эндогенные соединения и ксенобиотики различной химической природы [Арчаков А.И. и др., 1988, Ковалев И.Е. и др., 1985, Nebert, D., 1987]. Выделяют три линии ферментной защиты организма. Первой линией является система цитохрома Р-450 печени, второй - система ферментов, осуществляющих процесс конъюгации различных эндогенных и экзогенных соединений, а третья линия представлена- лизосомальными ферментами, катализирующими гидролитическое расщепление биополимеров и зстерифицированных веществ [Тутельян В.А., 1984].
Описано более 500 различных изоформ цитохрома Р-450, локализованных
в различных органах и тканях. Эти ферменты традиционно делят на семейства и
подсемейства. Например цитохром Р-450 1А, индуцируемый
полиароматическими углеводородами, или цитохром Р-450 2В фенобарбиталом. В 80-е годы прошлого века М.В. Изотовым был предложен метод определения двух групп цитохрома Р-450 с различной ориентацией активных центров терминальной оксидазы в микросомальной мембране, который основан на избирательном восстановлении ионов железа гема фермента. В результате все многообразие изоформ было разделено на две группы - группа цитохромов Р-450В, активный центр которых ориентирован в водную среду, и группу цитохромов Р-450Л, молекула которых погружена в липидную фазу микросомальной мембраны. Отмечается, что под действием фенобарбитала повышается содержания группы цитохромов Р-450В, а под влиянием 3-метилхолантрена - цитохромов Р-450Л [IzotovM., е.а., 1988].
Изоформы системы цитохрома Р-450 осуществляют биотрансформацию различных эндогенных субстратов и ксенобиотиков, в ряде случаев с образованием токсичных и канцерогенных метаболитов [Nebert, D., 1987]. В
ЛЬКАЯ і ІКА . 1
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ| БИБЛИОТЕКА
СПет«рб»г ,0» 700>«т>-„.^
результате метаболизма-многих, соединений, встречающихся в окружающей среде, особенно в крупных городах, в организме человека, могут синтезироваться радикалы кислорода с высокой активностью, которые служат пусковым механизмом развития многочисленных патологических состояний, в том числе и аллергических заболеваний. Среди причин столь значительного распространения аллергических заболеваний необходимо выделить следующие:
- загрязнение внутренней среды организма человека ксенобиотиками, что приводит к снижению резистентности организма в целом, иммунологической реактивность, в частности [Арчаков А.И. и др., 1988, Лопаткин НА.и др., 1989, JordeW., 1988];
участие системы цитохрома Р-450 печени в обеспечении иммунохимического гомеостаза организма путем биотрансформации ксенобиотиков и эндогенных модуляторов иммунологической и аллергической реактивности - стероидных гормонов, простагландинов, лейкотриенов, полиненасыщенных жирных кислот, симпатомиметических аминов и т.д., а изменение активности ферментов вызывает нарушение баланса между соотношением биологически активных соединений [Сергеев П.В. и др., 1973, Ковалёв И.Е. и др., 1985, СоппеуА., 1986, Mukhtar Н., е.а., 1989]:
Также необходимо подчеркнуть тот факт, что скорость реакций гидроксилирования у жителей разных регионов планеты неодинакова. Это связано с наличием двух метаболических фенотипов - с активными метаболическими реакциями (AMP) и с медленными метаболическими реакциями (ММР). Обнаружено, что фенотипы, обладающие ММР, с большей частотой встречаются в индустриально развитых странах, что рассматривается как приспособительная реакция вследствие возрастающего воздействия ксенобиотиков на организм человека. Показано, что вероятность возникновения пищевой аллергии зависит от преобладания метаболического фенотипа в данной популяции. Выявлена взаимосвязь между частотой возникновения пищевой аллергии и "низкой скоростью реакций гидроксилирования" [Mbanefo С, е.а., 1980, BrostoffJ., 1988].
Проблема загрязнения внутренней среды организма также тесно связана с особенностями питания населения, особенно в индустриально развитых странах. С одной стороны, широкое применение в сельском хозяйстве и. в пищевой промышленности различных химикатов (удобрений, пестицидов, анаболических средств, гормонов, антибиотиков, консервантов, красителей и др.) в значительной степени повышает степень загрязнения пищевых продуктов [Маслинский Ц., 1979, Ferrara L., е.а., 1989]. С другой стороны, унификация производственных и технологических процессов в сельском хозяйстве и пищевой промышленности позволяет повсеместно употреблять самые разнообразные и порой экзотические пищевые продукты, что приводит к
нивелированию сезонных и климатогеографических особенностей питания населения. Все большее число людей использует одинаковые продукты питания, редко применявшиеся ими в прошлом [Макдональд Я., 1986, Ferrara L., е.а., 1989], результатом чего является усиление интенсивности воздействий чужеродных химических соединений природного и антропогенного происхождения на внутреннюю среду организма, человека. В этих условиях концепция охраны химической чистоты внутренней среды организма человека, сформулированная А.А.Покровским (1979) в качестве одного из основных принципов современной нутрициологии, направленных на разработку "важных, интегральных мер защиты организма от болезней", превращается в острую медико-социальную проблему.
Таким образом очевидно, что проблемы загрязнения внутренней среды, организма и развития аллергического статуса тесно взаимосвязаны. Выдвинутая в 1985 г. Ковалевым И.Е. концепция d функциональной взаимосвязи иммунной и монооксигеназной систем позволяет с новых позиций рассмотреть патогенетические механизмы развития аллергических заболеваний и подходы к их лечению [Ковалев И.Е. и.др., 1985]. Сопряженное функционирование этих двух систем обеспечивает сохранение иммунохимического гомеостаза, то есть поддержание химической чистоты внутренней среды организма, а разбалансировка их сочетанной деятельности повышает риск развития патологических состояний. Результаты исследований, представленные в работах [Ковалев И.Е. и.др., 1985, Лопаткин НА. и др., 1989, Nebert D., 1979], отражают наличие определенной реципрокности между иммуностимулирующими воздействиями и состоянием активности монооксигеназной системы, с одной стороны, а также между индукцией системы цитохрома Р-450 печени и явлениями иммуносупрессии, с другой. Следовательно, как филогенетически более древняя, монооксигеназная система печени [Gotch О.,е.а., 1989, Nebert D., е.а., 1989],. обеспечивая химическую чистоту внутренней среды организма метаболическим путем, осуществляет и выраженную модуляцию функционального состояния иммунной системы, сформировавшейся на более позднем этапе филогенетического развития у птиц и млекопитающих [Купер Э., 1980, Пол У., 1987].
Разбалансировка системы цитохрома Р-450 печени выявленная в динамике сенсибилизации организма, а также ингибирующее действие медиаторов аллергии и воспаления на активность и экспрессию изоформ цитохрома Р-450, свидетельствует о важной роли ферментной системы в процессе развития аллергической реакции [Гаппаров М.М. и др., 1989, Morgan Е., 2001]. Различные лекарственные препараты и ингредиенты пищи оказывают значительное влияние как на иммунологический статус организма, так и на состояние системы цитохрома Р-450. В связи с этим можно обозначить новый подход к
лечению и профилактике аллергических состояний путем целенаправленного изменения аллергической реактивности организма за счет подбора определенных лекарственных препаратов или сочетаний компонентов пищи.
Актуальность исследований биохимических аспектов патогенеза реакций гиперчувствительности и метаболических основ изменения резистентности организма к аллергизирующим воздействиям, наряду с перечисленными выше обстоятельствами, определяется также традиционными представлениями основоположников отечественной аллергологии А. А. Богомольца (1936), Н.Н.Сиротинина (1937), А.Д. Адо (1970, 1983), которые указывают на основную роль нарушений обмена веществ в развитии аллергии. Весьма-актуальным и в настоящее время остается положение сформулировано Unger G. С соавторами (1958) о том, что "решение основных проблем аллергологии зависит от прогресса биохимии".
В то же время роль системы цитохрома Р-450 печени в модуляции реакций гиперчувствительности исследована пока недостаточно.
В связи с вышеизложенным целью исследования явилось изучение роли структурно-функционального состояния системы цитохрома Р-450 печени в механизмах развития резистентности организма к сенсибилизирующим воздействиям на модели экспериментальной пищевой анафилаксии и ее изменение, как под влиянием химических соединений, так и пищевых факторов, оказывающих модулирующее действие на систему цитохрома Р-450 печени.
Задачи исследования.
1. Исследовать взаимосвязь между тяжестью проявлений пищевой
анафилаксии, изменением состояния системы цитохрома Р-450 печени морских
свинок под влиянием ксенобиотиков - химических соединений (3-
метилхолантрен, изосафрол) и лекарственных средств (фенобарбитал,
рифампицин, метирапон, циклофосфамид).
2. Выявить особенности организации монооксигеназной системы печени,
профиля экскретируемых 17-оксикортикостероидов и чувствительности к
сенсибилизирующему воздействию у морских свинок с различным исходным
состоянием системы цитохрома Р-450 печени, тестированным in vivo по
длительности гексеналового сна.
3. Оценить влияние фенобарбитала и 3-метилхолантрена на
аллергическую реактивность, систему цитохрома Р-450 печени и профиль
экскретируемых 17-оксикортикостероидов у морских свинок с различным
исходным состоянием монооксигеназной системы печени.
4. Исследовать взаимосвязь между антиаллергической активностью
соединений пептидной природы (даларгин, глюдалан и у-глутамилгист;цчии|
при пероральном введении с их влиянием на состояние системы цитохроААЯ Р-
450 печени и содержание кортизола и его предшественников в.сыворотке крови.
5. Изучить потенциальную аллергенность белковых компонентов рациона
в зависимости от степени ферментативного гидролиза, определить их влияние
на сенсибилизирующую активность модельных аллергенов, структурно-
функциональную организацию системы цитохрома Р-450 и профиль
экскретируемых 17-оксикортикостероидов.
-
Оценить изменение тяжести проявлений, пищевой анафилаксии к модельным аллергенам, состояние монооксигеназной системы печени и профиль экскретируемых 17-оксикортикостероидов под влиянием рационов с различным соотношением полиненасыщенных жирных .кислот (ПНЖК) семейств (0-6 И (0-3.
-
Провести сравнительное изучение влияния различных углеводных компонентов рациона на выраженность проявлений экспериментальной анафилактической реакции, систему цитохрома Р-450 печени и содержание кортизола и инсулина в сыворотке крови у морских свинок.
8. Выявить закономерности изменения выраженности проявлений
анафилактической реакции в зависимости от состояния системы цитохрома Р-
450 печени и профиля экскретируемых 17-оксикортикостероидов у животных.
Научная новизна работы. Получены новые экспериментальные результаты, подтверждающие взаимосвязь между изменением структурно-функционального состояния системы цитохрома Р-450 печени и тяжестью проявлений экспериментальной анафилактической реакции под влиянием ксенобиотиков различной химической структуры и компонентов рациона. Результаты исследования позволяют с новых позиций раскрыть значение метаболического статуса организма в развитии аллергических реакций.
Впервые установлена корреляционная зависимость между содержанием в микросомальной фракции печени морских свинок группы цитохромов Р-450В, активный центр которых ориентирован в водную фазу, количеством цитохрома bs, длительностью гексеналового сна, экскрецией полярных глюкокортикоидов с мочой и тяжестью проявлений экспериментальной пищевой анафилаксии.
Впервые получены данные, характеризующие изменение содержания группы цитохромов Р-450В в печени морских свинок под влиянием индукторов І.типа (фенобарбитал, рифампицин) и II типа (3-метилхолантрен), а также в зависимости от введенной дозы соединений (циклофосфамид, метирапон). Установлено, что выраженность анафилактической реакции зависит от типа индуктора цитохрома Р-450 (фенобарбитал или 3-метилхолантрен) и от использованной дозы препарата (циклофосфамид, метирапон).
Впервые выявлено различное влияние фенобарбитала и 3-метилхолантрена на состояние монооксигеназной системы животных в зависимости от ее исходного состояния.
Впервые исследовано гипоаллергенное действие соединений пептидной природы (даларгин, глюдалан, у-глутамилгистамин) при пероральном применении, а также их способность модулировать активность системы цитохрома Р-450 печени и повышать содержание кортизола и его предшественников в сыворотке крови.
Впервые установлено, что низкомолекулярная фракция гидролизатов молочных белков, полученная методом ультрафильтрации (НМ20/80), обладает антианафилактическим эффектом, который сопровождается повышением общего, содержания цитохрома Р-450 печени, увеличением соотношения цитохромов Р-450В/Р-450Л и снижением относительного содержания полярных форм 17-оксикортикостероидов в моче.
Получены новые данные о противоаллергическом действии липидных композиций, в которых преобладают полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) семейства СО-6, и их влияния на структурно-функциональное состояние системы цитохрома Р-450 печени, проявившимся в увеличении отношения цитохромов b5 и Р-450, групп цитохромов Р-450В/Р-450Л наряду с уменьшением относительного содержания полярных форм экскретируемых 17-оксикортикостероидов. В составе мембран (микросомальной фракции) печени животных, получавших рацион с высоким содержанием ПНЖК семейства со-6, отмечается повышение количества арахидоновой кислоты (20:4, о-6) и относительного содержания среднецепочечных жирных кислот (12:0 +14:0).
Впервые исследовано влияние различных углеводных компонентов рациона морских свинок на анафилактическую резистентность, систему цитохрома Р-450 печени и изменение гормонального статуса. Выявлена достоверная корреляция между противоаллергическим действием рационов, содержанием в них фруктозы и исследованными показателями монооксигеназной системы.
Результаты проведенных исследований вносят определенный вклад в развитие биохимических (молекулярных) основ патогенеза аллергических реакций.
Теоретическая и практическая значимость работы. Проведенные исследования существенно расширяют представление о роли системы цитохрома Р-450 печени в обеспечении резистентности организма к неблагоприятным воздействиям внешней среды и, в частности, к аллергизйрующим факторам алиментарной природы. Полученные данные уточняют существующие представления о биохимических механизмах развития пищевых аллергических реакций и позволяют разработать новые подходы к медикаментозному и диетологическому лечению и профилактике пищевой аллергии.
Выявленная в работе высокая устойчивость к пищевой сенсибилизации животных с короткой продолжительностью гексеналового сна, отличающихся высокой скоростью синтеза суммы микросомальных гемопротеинов de novo, преобладанием в микросомальной фракции печени группы цитохромов Р-450В, преимущественной конъюгацией 17-оксикортикостероидов по пути глюкуронирования и низким относительным содержанием полярных форм гормонов в свободной фракции гормонов в суточной порции мочи, позволяет подойти к рассмотрению проблемы индивидуальной чувствительности организма к сенсибилизирующим воздействиям с позиции его метаболического статуса, обусловленного, в значительной мере, особенностью организации и функционирования системы цитохрома Р-450 печени. Данные, отражающие существенное, различие в относительном содержании полярных 17-оксикортикостероидов, а также глюкуронидов и сульфатов в составе экскретируемых глюкокортикоидов у животных с разной анафилактической чувствительностью, указывают на целесообразность контроля за профилем основных экскретируемых метаболитов 17-оксикортикостероидов у лиц, подвергающихся воздействию неблагоприятных факторов внешней среды, в том числе аллергенов.
Выявленное повышение тяжести реакций пищевой анафилаксии у морских свинок под влиянием 3-метилхолантрена, высоких доз циклофосфамида или метирапона, служат основанием для разработки новых мер профилактики и лечения аллергических заболеваний у лиц, занятых на химическом, производстве. Полученные в работе данные о снижении выраженности пищевой анафилаксии при индукции системы цитохрома Р-450 по фенобарбиталовому типу, наблюдаемой как при применении соединений различной химической структуры (рифампицин, даларгин, глюдалан, у-глутамилгистамин), так и при использовании рационов, содержавших ультрафильтрат молочных белков (НМ20/80), высокое количество ПНЖК семейства со-6 или фруктозы, могут быть использованы для разработки новых лекарственных средств и специализированных продуктов питания с целью профилактики и лечения пищевой аллергии.
Выявленные в работе факты различного влияния полиненасыщенных жирных кислот семейств (0-6 и (0-3 на экспериментальные проявления пищевой анафилаксии были использованы для разработки способа моделирования аллергической токсидермии, защищенного авторским свидетельством за №1420609 4G09B23/28 от 1.05.88 г. Результаты тестирования различных гидролизатов белков и получение продукта с низкой аллергенностью защищенного авторскими свидетельствами за №4607274, 5A23J1/20 и №4858131, 5A23J3/00. Результаты работы послужили основанием для получения патентов на Противоаллергический препарат (RU2000119 С, Мб А61К38/08)
Гипоаллергенный продукт (RU2040259- СІ, 6 А61КЗ1/175, A23L 1/09), Гипоаллергенное средство (RU2036656 СІ, 6 А61К35/78) и Гипоаллергенное вещество (RU2068699 С1, 6. А61К35/78).
На основание результатов проведенных экспериментов разработаны два специализированных продукта питания «Фиталакт» и «Унипит-3».
Результаты исследования и литературные данные о функционировании монооксигеназной системы используются в курсе лекций кафедры общей и клинической фармакологии. РУДН ФПК MP и кафедры общей патологии и патофизиологии Российской Медицинской академии постледипломного образования МЗ РФ.
Положения выносимые на защиту.
1. Тяжесть проявлений пищевой анафилаксии у экспериментальных
животных находится в тесной взаимосвязи с состоянием системы цитохрома Р-
450, в частности, с такими показателями как абсолютное и относительное
содержание группы цитохромов Р-450В печени, активный центр которых
обращен в цитозоль клетки, соотношение цитохромов bs/P-450 и длительность
гексеналового сна, а также с экскрецией полярных форм; 17-
бксикортикостероидов.)
2. Выраженность анафилактической реакции у морских свинок зависит от
типа и дозы вводимого ксенобиотика.
3. Тяжесть пищевой анафилаксии и чувствительность к
среднесмертельной дозе (ЛДм) гистамина, профиль . экскретируемых
метаболитов 17-оксикортикостероидов у экспериментальных животных зависит
от исходного состояния монооксигеназной системы печени, которая тестируется
по длительности гексеналового сна.
4. Индукторы I и II типа (фенобарбитал и 3-метилхолантрен) системы
цитохрома Р-450 печени вызывают разнонаправленное изменение выраженности
экспериментальной пищевой анафилаксии и метаболизма 17-
оксикортикостероидов у морских свинок с различным исходным состоянием
монооксигеназной системы печени.
5. Соединения пептидной природы (у-глутамилгистамин, -даларгин,
глюдалан) оказывают протективное действие в отношении реакций
гиперчувствительности, модулируют систему цитохрома Р-450 печени
аналогично индукторам I типа и повышают содержание кортизола и его
предшественников в сыворотке крови.
6. Введение в рацион животных белковых компонентов, полученных
различивши технологическими способами, с различной потенциальной
аллергенностью (БКМ20/80, Г20/80 и НМ20/80) приводит к разнонаправленным
изменениям состояния системы цитохрома Р-450 печени, профиля
экскретируемых 17-оксикортикостсроидов и тяжести проявлений пищевой анафилаксии.
7. Различное абсолютное и относительное содержание в рационе морских
свинок полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) семейств (0-6 и С0-3
вызывает изменение липидного состава микросомальных мембран, состояния
системы цитохрома Р-450 печени, профиля экскретируемых 17-
оксикортикостероидов и вьфаженности пищевой анафилаксии.
8. Использование в качестве углеводного компонента рациона смеси
крахмала и фруктозы (не менее 25% от общего количества углеводов) оказывает
влияние . на активность монооксигеназной системы печени, содержание
кортизола в сыворотке крови и тяжести экспериментальной анафилактической
реакции.
Апробация работы. Основные материалы работы доложены на 4-м Всесоюзном симпозиуме по медицинской энзимологии (1983), Всесоюзной конференции «Цитохром Р-450 и охрана окружающей среды» (1985, Москва), V Всесоюзном биохимическом съезде (1986), V научн. Сессии «Актуальные вопросы реконструктивной и восстановительной хирургии.» (1987), Всесоюзной кнференции «Химия пищевых добавок» (1989), V Всесоюзной конференции «Цитохром Р-450 и модификация макромолекул» (1989), Научно-практической конференции «Ресурсосберегающие технологии переработки продуктов животноводства.»(1989), конференции с международным участием «Питание: здоровье и болезнь» (1990), XV Всесоюзной конференции «Физиология пищеварения и всасывания» (1990), XXIII International Deiry Congress, Montreal (1990), Всесоюзной научно-технической конференции «Совершенствование технологических процессов производства новых видов пищевых продуктов и добавок. Использование вторичных ресурсов пищевого сырья.» (1991), VI Международной конференции «Наукоемкие технологии» (1999), 5-м, 7-м, 9-м и 11-м Российском Национольном Конгрессе «Человек и лекарство» (1999, 2001, 2002,2004).
Объем и структура диссертации. Диссертационное исследование изложено на 399 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, семи разделов результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 644 источников, и приложения. Работы иллюстрирована 58 таблицами и 25 рисунками.
Краткая характеристика системы цитохрома Р-450
. Система цитохрома Р-450 относится к одной из самых древних ферментативных систем и выявлена у прокариотов и эукариотов от бактерий до человека. Структурная организация монооксигеназной системы и ее функциональное значение имеют свои отличия у животных, стоящих на различных ступенях эволюционной лестницы. В связи с известной ролью системы цитохрома Р-450 в метаболизме эндогенных соединений (стероидных гормонов, полиненасыщенных жирных кислот и др.) и ксенобиотиков мы остановимся на некоторых особенностях данной ферментативной системы у млекопитающих.
. Ферменты (изоформы), которые относятся к системе цитохрома Р-450, локализованы в различных органах и тканях организма. В последние годы показано, что наиболее хорошо изученные изоформы (Р4502В1/2, 2Е1, ЗА1/2, 2D6 and 2С12) представлены как в эндоплазматическом ретикулуме, так и в митохондриях [Anandatheerthavarada Н.К., е.а., 1997, Bhagwat S.V., е.а., 1999]. Однако пока неизвестна причина и функциональная целесообразность такой двойной локализации ферментов.
Реакции метаболизма различных эндогенных и экзогенных соединений с участием ферментов системы цитохрома Р-450 можно разделить на 6 стадий (рис. 1) [Ortiz de Montellano P., 1986]:
1. связывание субстрата (S) с ферментом (ион железа трехвалентный);
2. восстановление субстрат-ферментного комплекса (присоединение первого электрона) при участии НАДФН цитохром Р-450 редуктазы (ион желез трехвалентный);
3. присоединение молекулы кислорода с образованием фермент-субстратного оксикомплекса (возможно образование супероксид-аниона);
4. присоединение второго электрона с восстановлением иона железа до валентности 2+ (НАДФН цитохром Р-450 редуктаза);
5. присоединение иона водорода к атому кислорода с окислением иона железа, образованием воды и, возможно, пероксида водорода;
6. расщепление фермент-субстратного комплекса с образованием окисленного метаболита.
Оценка чувствительности животных к введению среднесмертельной (ЛД50) дозе гистамина
На первом этапе эксперимента у интактных животных, содержавшихся на стандартном рационе вивария, определяли ЛД5о гистамина при внутривенном введении различных доз гистамина гидрохлорида, растворенного в ФР. Вычисляли ЛД5о гистамина по формуле Г.Н. Першина (Кудрин А.Н. и др., 1967): ЛД50 = (a+b) (m+n) /200 , где а и b - величины смежных доз, тип- соответствующие данным дозам частоты смертельных исходов в процентах. На втором этапе эксперимента животным, которые подвергались экспериментальным воздействиям, внутривенно вводили ЛДбо гистамина. Разность между процентом летальности животных в контрольной и опытных группах отражала изменение их чувствительности к гистамину.
Гексеналовый сон (ГС) вызывали внутрибрюшинным введением гексобарбитала морским свинкам в дозе 30 мг/кг массы тела, мышам линии СВА, гибридам первого поколения BDF1- в дозе 36 мг/кг массы тела, мышам линии BALB/c h75 - в дозе 60 мг/кг
138 массы тела. Длительность сна определяли по продолжительности утраты животным рефлекса переворачивания со спины на ноги.
Эксперименты, описанные в разделах 3.2 и 3.3, проводили на двух группах морских свинок дифференцированных по продолжительности ГС 1-я группа - животные, не спавшие после введения гексобарбитала - с «нулевым» гексеналовым сном (НГС); 2-я группа - - животные, спавшие более 40 минут - с длительным гексеналовым сном (ДГС).
После декапитации животных печень немедленно извлекали, взвешивали, промывали охлажденным 1,15% раствором КС1. Гомогенат готовили по общепринятой методике в гомогенизаторе Поттера-Эльвейема с тефлоновым пестиком. Среда для гомогенизации содержала 0,15 М раствор калия хлорида в 0,05М Трис-НС1 буфере (рН 7,4) [Арчаков А.И., 1975, Карузина И.И. и др., 1977]. Процедуры выполняли при температуре 0 - +4С.
- Фракцию микросом получали методом дифференциального центрифугирования по двуступенчатой схеме. На первом этапе при центрифугировании в течение 15 при 10000g (центрифуга К-24, ГДР) осаждали частицы наружной мембраны клетки, ядра, митохондрии и лизосомы, на втором - из полученной надосадочной жидкости выделяли фракцию микросом при 105000g в течение 60 минут (центрифуга Ms Е-65, Великобритания, или «Specol-65» Beckman, США) [Арчаков А.И., 1975, Карузина И.И. и др., 1977].
Влияние индукторов цитохрома Р-450 различной химической природы на состояние системы цитохрома Р-450 печени, выраженность проявлений пищевой анафилаксии и чувствительность к гистамину
В настоящее время накоплено значительное количества фактов о особенностях организации и различном влиянии соединений на активность системы цитохрома Р-450 печени у разных видов животных и человека. В разделе 2.4 описаны особенности метаболизма различных соединений как у интактных морских свинок, так и под влиянием различных соединений. Также выявлены определенные отличия действия соединений у мышей, крыс, человека и т.д. [Miura S, е.а., 1991, Lehmann J., е.а., 1998., Easterbrook J., е.а., 2001], Например введение 3-метилхолантрена повышается N-гидроксилирование З-метокси-4-аминоазобензола в микросомальной фракции печени у мышей и хомячков. Тогда как у крыс и морских свинок не отмечается изменения метаболизма соединения [Miura S, е.а., 1991].
В связи с этим на первом этапе работа проводилось изучение структурно-функционального состояния монооксигеназной системы печени у морских свинок под влиянием индукторов I и II типа, а также смешанного типа, с последующим исследованием изменения интенсивности аллергической реактивности животных.
В качестве модуляторов системы цитохрома Р-450 печени использовали: фенобарбитал (ФБ), рифамшщин (РИФ) и 3-метилхолантрен (3-МХ), циклофосфамид (ЦФ) изосафрол и метирапон.
Соединения вводили интактным и сенсибилизированным куриным овальбумином (ОВА) животным внутрибрюшинно или перорально, ежедневно, в течение трех дней. Морские свинки контрольной группы получали соответствующий объем растворителя. Оценку влияния индукторов на систему цитохрома Р-450 печени и резистентность к среднесмертельной дозе (ЛД50) гистамина проводили через сутки после последнего введения соединений интактным животным. При изучении изменений тяжести проявления пищевой анафилаксии вещества вводили в течение 3-х до начала сенсибилизации или их введение заканчивали за сутки до введения разрешающей дозы гомологического белка. Активный анафилактический шок (ААШ) у сенсибилизированных ОВА животных вызывали на 7 сутки сенсибилизации. Выполнение остальных экспериментальных процедур осуществлялось как описано в разделе 3.
Обсуждение результатов
В представленной работе проведено:
- изучение характера взаимосвязи между структурно-функциональным состоянием системы цитохрома Р-450 печени, метаболизмом 17-оксикортикостероидов (17-ОКС) и тяжестью пищевой анафилаксии;
- выявлено значение изменения активности монооксигеназной системы в модуляции чувствительности животных к сенсибилизирующему воздействию и среднесмертельной дозе гистамина;
В результате проведенных экспериментальных исследований выявлено, что не зависимо от типа воздействия высокая устойчивость животных к сенсибилизации характеризуется:
- высоким абсолютным и/или относительным содержанием группы цитохромов Р-450В в печени; . .
- повышением содержания цитохрома bs и/или соотношения цитохрома bs к цитохрому Р-450, либо величина последнего показателя должна составлять приблизительно единицу;
- низкой длительностью гексеналового сна;
- высоким содержанием кортизола в сыворотке крови;
- снижением экскреции полярных форм 17-оксикортикостероидов.
Известно, что при сенсибилизации (аллергическом статусе) происходит значительное изменение гомеостаза организма, что проявляется в снижении концентрации кортикостероидов в сыворотке крови и угнетении системы цитохрома Р-450 печени, а также значительном повышении образования:
- медиаторов аллергии и воспаления (интерлейкинов, интерферонов, лейкотриенов, гистамина и др.);
- активных форм кислорода (перекиси водорода, гидроксильного радикала, супероксид аниона и др.) и оксида азота (МО -радикала);
- продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ).
Эти процессы оказывают значительное влияние на изменение активности многих ферментных систем, в том числе системы цитохрома Р-450.
В свете рассматриваемых вопросов необходимо остановиться на изменении активности ряда ферментных систем при тканевой гипоксии, которая является одним из ведущих звеньев патогенеза при аллергических состояниях [Федоров И.И., 1968].
Известно, что при гипоксии повышается ПОЛ, снижается содержание цитохрома Р-450 и активность- монооксигеназ печени. Большую роль в развитии этих процессов играют активные формы кислорода [Barakat М., е.а., 1996, Proulx М., е.а., 1995]. Одновременно повышается активность супероксид-дисмутазы и. снижается содержание в печени глутатиона и активность глутатионпероксидазы. Эти изменения приводят к повышению количества активных радикалов кислорода, которые могут повреждать мембраносвязанные ферменты, в том числе, ферменты системы цитохрома Р-450 [Proulx М, е.а., 1995], одной из центральных ферментных систем, поддерживающей гомеостаз внутренней среды организма [Ковалев И.Е. и др., 1985]. Перекисное оксиление липидов (ПОЛ) - важный физиологический процесс, постоянно протекающий в клеточной мембране и в норме играющий важную роль в жизнедеятельности клеток, например при биосинтезе простагландинов, лейкотриенов, а также при фагоцитозе [Соколов Е. И., 1996]. Однако на фоне развившейся тканевой гипоксии этот процесс резко усиливается в результате чего образуется большое количество свободно-радикальных соединений, которых защитные системы клетки не успевают нейтрализовать.