Введение к работе
Актуальность проблемы. Определение холина и фенола является важной биологической, клинической и токсикологической задачей. Более того, измерение активностей многих ферментов основано на регистрации продуктов гидролиза производных холина и фенола. К таким ферментам относятся ацетилхолинэстераза (АХЭ), бутирилхолинэстераза (БХЭ), карбоксилэстераза (КЭ), параоксоназа (ПОНІ) и N-ацетил-Р-Б-глюкозаминидаза (НАГаза). В свою очередь, знание активностей АХЭ, БХЭ, КЭ и ПОНІ является важным моментом как при проведении экспериментальных исследований в токсикологии, нейробиологии, фармакологии, так и в клинической практике - терапии, в т.ч. анестезиологии и клинической токсикологии. НАГаза является одним из биомаркёров мастита коров, и определение её активности может быть использовано для диагностики этого заболевания на ранней стадии.
На сегодняшний день наиболее распространенным методом определения активностей выше перечисленных ферментов-маркёров патологических состояний в биологических жидкостях является спектрофотометрия. Развитие оптических методов достигло высокого уровня и позволяет осуществлять высокопроизводительный анализ ферментативной активности в лабораторных условиях. Однако в настоящее время растет потребность в массовых экспресс-исследованиях активностей этих ферментов непосредственно по месту лечения и в полевых условиях для чего требуются малые объемы пробы. Использование высокочувствительных портативных биосенсоров для определения активностей ферментов-маркёров патологических состояний представляет большой интерес для подобного рода задач медико-биологического мониторинга.
Одним из простых, дешевых и удобных способов формирования биосенсорных покрытий является метод последовательной адсорбции полиэлектролитов и ферментов (ПНП). Он заключается в чередующейся электростатической адсорбции на поверхность сенсора компонентов, несущих противоположный заряд и позволяет включать различные виды материалов в состав пленочных структур полиэлектролитов. Качество сборки полиэлектролитных конструкций зависит от индивидуальных особенностей поверхности для адсорбции, структуры полиэлектролитов, количества слоев и т.д. Толщины слоев и другие физико-химические характеристики этих конструкций оказались чувствительными к таким факторам, как рН, ионная сила, температура, анионно-катионный состав, время адсорбции полиэлектролитов, ионной силы и температуры раствора полиэлектролита. Однако особенности формирования фермент-полиэлектролитных комплексов на твердой поверхности при их нанесении методом ПНП недостаточно изучены.
Таким образом, фундаментальные исследования в области создания сенсорных покрытий с последующим практическим применением разработанных биосенсоров является актуальной научной задачей.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилась разработка высокочувствительных биосенсоров для определения холина и фенола, а также исследование возможности практического применения разработанных биосенсоров для анализа АХЭ, БХЭ, КЭ и ПОНІ в крови млекопитающих и НАГазы в молоке коров. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Детальное исследование влияния условий формирования фермент-полиэлектролитных пленок на основе холиноксидазы (ХО) и тирозиназы (Тир) на поверхности электродов
Изучение аналитических характеристик полученных планарных холиновых и фенольных биосенсоров
Разработка чувствительного и воспроизводимого способа определения холина и фенола в крови и молоке с использованием планарных биосенсоров
- Разработка формата анализа ферментов-маркёров в крови и молоке с
использованием биосенсоров на холин и фенол.
Научная новизна. Исследовано влияние галогенид анионов (F", СГ, Вг~, Г) на адсорбцию ПДДА на поверхность графитового стержня и последующее нанесение отрицательно заряженных частиц (холиноксидазы и золота). Показано, что адсорбция ПДДА из растворов содержащих йодид-анион приводит к многократному увеличению чувствительности биосенсора (ПДДАы/ХО) по холину. Предложена физико-химическая модель, объясняющая процесс формирования фермент-полиэлектролитных пленок в присутствии различных анионов.
Еще одним важным фактором при создании сенсоров является предобработка поверхности для адсорбции фермента. Проведя исследование влияния различных способов подготовки поверхности, было обнаружено, что использование углеродных наностержней приводит к наибольшему увеличению чувствительности сенсора. При нанесении пленки ПДДА/ХО на подслой из УНС происходит более чем семикратное увеличение чувствительности.
Разработаны планарные холиновые и фенольные биосенсоры на основе холиноксидазы и тирозиназы, соответственно. Исследовано влияние условий адсорбции компонентов (время адсорбции, концентрация, время высушивания слоев) и определены параметры, влияющие на активность биосенсоров: гидрофобность, молекулярная масса и заряд поликатиона, анионный состав буферного раствора, природа растворителя и количество циклов нанесения слоев ПДДА/фермент, присутствие многозарядных нанообъектов. Пределы обнаружения холинового и фенольного планарных биосенсоров являются одними из самых низких среди известных на данный момент сенсоров на холин и фенол и составляют 50 и 2,6 нМ, соответственно.
Практическая значимость работы. Разработанные высокочувствительные холиновые и фенольные планарные биосенсоры могут быть использованы как для непосредственного определения холина и фенола в низких концентрациях, так и для измерения ферментативной активности. Разработан новый биосенсорный формат определения активностей ацетил- и бутирилхолинэстеразы, карбоксилэстеразы, параоксоназы в крови и 1Ч-ацетил-Р-В-глюкозаминидазы в молоке. Высокая чувствительность биосенсоров позволяет определять выбранные ферменты-маркёры в низких концентрациях, пределы обнаружения АХЭ, БХЭ, КЭ, ПОНІ и НАГ азы составили 4,5, 2, 2, 0,2 и 0,2 мЕд/мл, соответственно. Полученные пределы обнаружения значительно меньше нижней границы диапазона активностей этих ферментов в норме,
что позволит использовать для анализа большие разведения и соответственно малые объемы крови (несколько мкл).
Показана применимость нового биосенсора для биомониторинга воздействия ФОС на живые организмы и ранней диагностики мастита коров.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: Международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2005, 2010, 2011), Международных конгрессах «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2007, 2009, 2011), Всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы», (Белгород, 2008), Международной научной конференции «Биокатализ-2009» (Архангельск, 2009), конференции «1st Russian-Helenic Symposium «Biomaterials and bionanomaterials: resent advantage and safety-toxicology issues», (Крит, Греция, 2010), конференции «14th International Chemical Weapons Demilitarisation Conference», (Интерлакен, Швейцария, 2011).
Публикации. По материалам исследований опубликовано 13 работ, в том числе 2 статьи в международном и отечественном журналах, 1 глава из книги, 10 тезисов научных конференций.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 159 стр. и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения в 4-х главах, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 224 ссылок. Работа содержит 74 рисунка, 16 таблиц. Список сокращений:
