Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Промышленные методы деструкции крахмала 7
1.1. Способы получения высокомолекулярных продуктов деструкции крахмала 9
1.2. Каталитический гидролиз 11
1.2.1. Кислотный гидролиз крахмала 16
1.2.2. Ферментативный гидролиз крахмала 21
1.2.3. Сравнительная характеристика различных технологических схем 28
1.2.4. Характеристика глюкоамилазы и предполагаемый механизм катализа 31
1.2.5. Гетерогенные катализаторы на основе иммобилизованной глюкоамилазы...31
1.2.6, Макрокинетика гетерогенных биокаталитических процессов 43
Глава 2. Экспериментальная часть 47
2.1. Носители 47
2.1.1. Оксидные носители 47
2.1.2, Углеродные носители 49
2.2 Модификация поверхности оксидных носителей 53
2.2.1. Синтез КВУ-сяоя на поверхности оксидных носителей 53
2.2.2. Синтез Г-слоя на поверхности оксидных носителей 53
2.3. Методики приготовления и исследования биокатализаторов 53
2.3.1. Получение декстринов из крахмала 54
2.3.2, Адсорбция глюкоамилазы 55
2.3.3. Определение ферментативной активности глюкоамилазы 56
2.3.4, Определение стабильности глюкоамилазы 57
2.4. Типы используемых реакторов 58
2.4.1. Дифференциальный безградиентный реактор 58
2.4.2. Реактор с неподвижным слоем/РЕНЕС/ 58
2.4.3. Роторно-инерционный биореактор /РИБ/ 58
2.4.4. Вихревой погружной реактор /ВИПР/ 59
Глава 3. Иммобилизация глюкоамилазы на неорганических носителях 61
3 1. Адсорбционные свойства неорганических носителей 61
3.2. Биокаталитические свойства иммобилизованной глюкоамилазы 69
3.2.1. Зависимость активности и стабильности иммобжлизованой глюкоамилазы от морфологии поверхности адсорбента 69
3.2.2. Биокаталитические свойства глюкоамилазы, иммобилизованной наСибуните 75
Глава 4. Кинетика и макрокинетика гетерогенного процесса гидролиза декстринов в биореакторах различного типа 83
4.1. Определение областей протекания реакции гетерогенного гидролиза в дифференциальном безградиентном реакторе 83
4.2. Вихревые реакторы 87
4.2.1. Лабораторные испытания роторно-инерционного биореактора 87
4.2.2, Лабораторные испытания вихревого погружного реактора 93
4.3. Схема получения сахаристых веществ в лабораторном масштабе 97
Выводы 100
Список литературы 101
Благодарности HI
- Способы получения высокомолекулярных продуктов деструкции крахмала
- Модификация поверхности оксидных носителей
- Адсорбционные свойства неорганических носителей
- Определение областей протекания реакции гетерогенного гидролиза в дифференциальном безградиентном реакторе
Введение к работе
Актуальность проблемы. Получение сахаристых веществ из крахмала на сегодняшний день является важной задачей в рамках решения проблемы комплексной переработки возобновляемого растительного сырья в широкий ассортимент востребованных продуктов: паток, глкжозных и глюкозо-фруктозных сиропов. В настоящее время большую часть этих веществ отечественная пищевая промышленность импортирует или производит на заводах, находящихся под контролем зарубежных компаний.
В основе получения сахаристых веществ лежит каталитический гидролиз крахмала. В зависимости от используемого катализатора в промышленности применяют либо кислотный, либо ферментативный, либо комбинированный кислотно-ферментативный метод деструкции крахмала. Каждый из перечисленных методов обладает своими преимуществами и недостатками. Очевидно, что для пищевой промышленности ферментативный гидролиз имеет приоритетное значение по сравнению с кислотным, поскольку позволяет получать более широкий ассортимент сахаристых продуктов заданного углеводного состава с минимальным содержанием посторонних, в том числе токсичных, примесей.
Биокаталитические процессы могут осуществляться как в гомогенном режиме, когда исходный реагент (субстрат) и фермент находятся в жидкой фазе, так и в гетерогенном режиме с участием иммобилизованного на твердом носителе фермента. Считается общепризнанным, что гетерогенный режим проведения каталитических процессов является более экономически выгодным, особенно, в том случае если затраты на приготовление гетерогенного катализатора компенсируются значительным улучшением технико-экономических показателей всего производства. Для процесса получения сахаристых веществ из крахмала, в котором стадия осахаривания крахмала (гидролиза декстринов) осуществляется в гетерогенном режиме, такими показателями являются:
> повышение рабочих температур гидролиза за счет увеличения термоста
бильности глюкоамилазы при иммобилизации;
возможность проведения процесса гидролиза в непрерывном режиме;
сокращение расхода фермента за счет его многократного использования;
точный контроль над окончанием процесса гидролиза и исключение операции термоинактивации глюкоамилазы за счет быстрого удаления катализатора из реакционной среды;
отсутствие белковых примесей, вносимых с ферментным препаратом на стадии осахаривания, что особенно важно для производства глюкозо-фруктозных сиропов.
Несмотря на перечисленные показатели, в настоящее время гетерогенный процесс ферментативного гидролиза декстринов реализован за рубежом только на уровне пилотных установок. Одним из факторов, ограничивающих
внедрение данного процесса в производство, является отсутствие катализаторов с необходимой для промышленной технологии термостабильностью при 60-65С. Другой сдерживающий фактор — это относительно низкая производительность реакторов с неподвижным слоем катализатора в процессах, контролируемых диффузией субстрата к иммобилизованному ферменту.
Цели и задачи работы. Цель работы заключалась в приготовлении активного и высокостабильного гетерогенного катализатора на основе иммобилизованной глюкоамилазы и исследовании процесса гидролиза декстринов с участием данного катализатора. Для достижения этой цели решались следующие задачи:
-
Сравнительное исследование биокаталитических свойств глюкоамилазы, иммобилизованной на неорганических носителях, отличающихся геометрической формой (сотовые монолиты, пено-материалы, гранулы), текстурными характеристиками, химическими свойствами поверхности и морфологией синтезированного поверхностного углеродного слоя;
-
Изучение кинетических закономерностей процесса гидролиза декстринов с участием приготовленного высокостабильного катализатора на основе иммобилизованной глюкоамилазы;
-
Испытание вихревых реакторов оригинальной конструкции, специально разработанных для проведения гетерогенных диффузионно-контролируемых биокаталитических процессов.
Научная новизна. Впервые исследованы закономерности адсорбционной иммобилизации глюкоамилазы на разнообразных неорганических носителях. Установлено, что мезопористые углеродсодержащие носители, на поверхности которых синтезированы слои либо каталитического волокнистого углерода, либо пироуглерода, обладают высокой адсорбционной емкостью по отношению к глюкоамилазе; позволяют сохранить биокаталитическую активность иммобилизованного фермента на высоком уровне; существенно повышают стабильность фермента. Впервые в работе испытаны вихревые реакторы (роторно-инерционный и вихревой погружной), разработанные специально для проведения диффузионно-контролируемых биокаталитических процессов с участием гетерогенных катализаторов
Практическая ценность работы. Предложенный метод приготовления высокостабильных катализаторов путем адсорбционной иммобилизации глюкоамилазы на углеродсодержащих неорганических носителях по сравнению с методом ковалентной иммобилизацииявляется является более простым, дешевым и технологичным, отличается отсутствием дорогостоящих и токсичных реагентов. Полученные гетерогенные катализаторы превосходят по основным параметрам (термостабильность) известные литературные данные и отвечают требованиям, предъявляемым к промышленным катализаторам. Производительность испытанных вихревых реакторов в процессе гидролиза декстринов увеличивается в ~1,5 раза по сравнению с реактором с не-
подвижным слоем катализатора, традиционно применяемым для проведения биокаталитических процессов. Полученные высокостабильные биокатализаторы на основе иммобилизованной глюкоамилазы, и вихревые реакторы являются перспективными для производства крахмальных паток и глюкозных сиропов.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 статей в рецензируемых журналах и 2 патента РФ.
Апробация работы. Результаты работы обсуждались на конкурсе научно-исследовательских работ Института катализа СО РАН (2004), а также были представлены в виде тезисов на 10 российских и международных научных форумах: 1-3-ий Международные симпозиумы «Биотехнология. Состояние и перспективы развития» (Москва, Октябрь 2002, Ноябрь 2003, Март 2005); International Congress on Biocatalysis ВЮСАТ (Hamburg, July 2002); 6-th European Congress on Catalysis EUROCAT-VI (Insbruck, September 2003); 13-th International Congress on Catalysis ICC-13 (Paris, July 2004); 16-th International Congress of Chemical and Process Engineering CHISA-16 (Praga, August 2004); конференции РФФИ «Фундаментальная наука в интересах развития химической и химико-фармацевтической промышленности» (Пермь, Ноябрь 2004) и «Фундаментальная наука в интересах развития критических технологии» (Владимир, Сентябрь 2005); 3-d Russia-China Seminar on Catalysis (Novosibirsk, April 2004).
Основные положения, выносимые на защиту. Мезопористые углерод-содержащие носители, на поверхности которых синтезирован слой каталитического волокнистого углерода или пироуглерода, являются оптимальными адсорбентами для приготовления активных и высокостабильных катализаторов на основе иммобилизованной глюкоамилазы.
Катализатор, приготовленный адсорбционной иммобилизацией глюкоамилазы на мезопористом Сибуните, по активности и термостабильности превосходит известные литературные данные и удовлетворяет требованиям, предъявляемым к промышленным катализаторам.
Производительность вихревых реакторов оригинальных конструкций для диффузионно-контролируемых гетерогенных биокаталитических процессов, выше производительности традиционного реактора с неподвижным слоем катализатора.
Структура н объем работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 111 страницах и включает 10 таблиц, 45 рисунков, 4 схемы, библиографию из 131 наименования.
Способы получения высокомолекулярных продуктов деструкции крахмала
Механохимическая обработка заключается в измельчении гранул крахмала за счет дробления и истирания материала в шаровых мельницах [8]. Изучая физические свойства крахмальных гранул, Керр и сотр.[6] наблюдали под микроскопом, что при сильном давлении гранулы искажались по форме и немедленно теряли свойства двойного лучепреломления. Рентгенограммы поврежденных гранул не отличались от снимков полностью аморфного вещества. По мнению авторов это доказывало, что нарушалась определенная ориентировка молекул, в результате чего терялась их кристалличность, а не просто кристаллы разламывались на части. При дальнейшем увеличении давления (помоле) размеры молекул уменьшались, и их восстанавливающие свойства повышались. Диспергированный таким образом крахмал полностью растворялся в воде. Метод глубокого диспергирования крахмалсодержащего сырья может использоваться в технологии спиртового производства [8].
Сущность гидротермического метода состоит в предварительной кпейстеризации водной суспензии крахмала и последующем высушивании клейстера в тонком слое на паровых барабанных вальцовых сушилках, разогретых до температуры 120-180С [10]. Крахмальный клейстер, нанесенный на вальцы тонким слоем, высушивают за один оборот барабана, после чего сухую пленку снимают специальным ножевым устройством и подают в измельчитель ударного действия. В результате такой комбинированной обработки происходит деструкция гидратированных молекул полисахаридов и перестройка структуры крахмала за счет дегидратации тонкой пленки клейстера при высушивании. Этот способ используется для получения крахмалов (см. схему 1), клейстеризующихся в холодной воде и способных полностью или частично переходить в растворимое состояние. Гидротермомеханическая обработка представляет комбинацию вышеперечисленных методов и используется для получения экструзионных продуктов [11-12]. Такой обработке могут быть подвергнуты различные виды крахмалов, их смеси, а также многокомпонентные крахмалсодержащие продукты. Предварительно увлажненный материал подвергается сжатию, разогреву выше температуры клейстеризации, выдавливанию через сопла матрицы экструдера. Быстрое снижение давления приводит к разрыву набухших гранул крахмала, при этом за счет механического сдвига, температуры и естественной влажности крахмал теряет кристалличность и подвергается молекулярной деградации.
В основе термической деструкции - промышленного метода получения декстрина -лежит тепловая обработка сухого крахмала в присутствии катализатора или без него [9-10]. В результате происходит как расщепление молекул полисахаридов и уменьшение степени полимеризации, так и рекомбинация моно- и олигосахаридов с образованием новых а- и р-связей, приводящих к изменению исходной структуры углеводов. Варьируя режим тепловой обработки - время (0,5-3,5 ч), температуру (125-160С); вид и количество катализатора - соляная кислота или алюмокалиевые квасцы, можно получать декстрины различного состава, который обуславливает их технологические характеристики (растворимость, вязкость, цветность и клеящая способность) и определяет их применение. Обычно декстрины используются для технических целей: приготовление клеев, шлихтования стеклянных нитей сразу после экструзии, для загущения текстильных красок, при формовании заготовок в литейном производстве, для агломерации руд, брикетирования угля, гранулирования инсектицидов и т.п. В пищевой промышленности декстрины с высокой растворимостью в холодной воде используют в качестве носителей активных ингредиентов пищевых порошков и красящих веществ.
Уровень развития промышленности в целом и спрос потребительского рынка на те или иные продукты определяют развитие и использование конкретного метода. Так, например, до середины XX века в крахмалопаточной отрасли господствовали кислотный гидролиз и термическая обработка сухого крахмала, направленные на получение продукции большей частью технического назначения (растворимые и набухающие крахмалы, декстрин, гидрол). Патоки и глюкозный сироп, полученные кислотным гидролизом и предназначенные для пищевой промышленности, требовали высокую степень очистки от примесей с использованием механических (фильтрование) и физико-химических методов (адсорбция на активированном угле, ионообменной смоле). Поэтому доля этих продуктов в объеме получаемых крахмалопродуктов была невелика. Инновационные процессы в крахмало-паточной отрасли, начавшиеся во второй половине XX века, внесли изменение в соотношения между крахмалопродуктами технического и пищевого назначения; ассорти мент и масштабы производства последних значительно возросли. Этому способствовало развитие микробиологического производства широкого набора ферментов (амилаз и изо-мераз), необходимых для гидролиза крахмала и для получения фруктозы из глюкозы. Объединение ферментативных методов переработки крахмала в единую технологическую схему позволило получить новый, востребованный пищевой промышленностью продукт -гшокозо-фруктозный сироп, натуральный заменитель сахара [5].
Другим примером промышленных инноваций, разработанным и широко применяемым в последние десятилетия, можно назвать технологию экструзионных крахмало-продуктов. Этот способ обработки сырья позволяет получать новые виды продуктов, используемых в пищевой промьпиленности и для технических целей [12].
Завершая обзор методов деструкции крахмала, подробнее рассмотрим наиболее значимые по масштабу производства и ассортименту продукции способы каталитического гидролиза крахмала.
Модификация поверхности оксидных носителей
Синтез осуществляли путем пиролиза врдород-пропан-бутановой смеси на нанесенных никелевых катализаторах, полученных путем гомогенного осаждения никеля. Для этого носитель погружали в 0,28%-й раствор нитрата никеля в 0,6% растворе мочевины (для ячеистой пенокерамики концентрацию реагентов увеличивали в два раза) и выдерживали в этом растворе в течение 3 ч при 85С. После чего носитель высушивали под ИК-лампой при 200С в течение 4 ч и помещали в специальную пиролитическую установку. Процесс каталитического пиролиза проводили при 500С в течение 1 ч.
Варьирование гидрофильно-гидрофобных свойств поверхности проводили следующим образом. В целях повышения гидрофобности КВУ-слоя, углеродсодержащий носитель подвергали дополнительной обработке в восстановительной атмосфере водорода при 500СС в течение 2 часов. Для увеличения гидрофильных свойств КВУ-слоя поверхность подвергали окислению путем отжига в атмосфере кислорода (воздуха) или кипячением в 20%-ном водном растворе азотной кислоты в течение 1-го ч.
Готовили растворы различных концентраций (от 5 до 70%) сахара в воде. Носитель погружали в сироп на 10 мин, высушивали под ИК-лампой и карбонизировали при 500С в течение 2 ч в токе водорода.
В работе использовали следующие ферментные препараты: глюкоамилаза (Глю-коаваморин Г18Х) из A. awamori (удельной активностью по отношению к крахмалу / декстринам 300 ЕА/мг белка при 50С), а - амилаза (Амилосубтилин ГЗХ) из Bacillus subtilis, оба вида амилаз производства ПО «Сиббиофарм», Бердск, Новосибирская обл., глюкозооксидаза из Aspergillus niger (удельная активность 249 ЕА/мг, Serva, США). 2.3.1. Получение декстринов из крахмала
В качестве субстрата реакции гидролиза с участием глюкоамилазы использовали декстрины. Сырьем для получения декстринов служили пищевые крахмалы; кукурузный, картофельный, пшеничный. Активность глюкоамилазы по отношению к декстринам, приготовленным из различного сырья, была одинаковой.
Исходный крахмал смешивали с сухим препаратом Амилосубтилина в дезинтеграторе DESI-16 (AS DESINTEGRAATOR, Эстония), частота вращения лопастей которого составляла 3000-4000 об/мин, (или растирали с ферментом в ступке, если навески крахмала не превышали 100 г) полученную однородную смесь суспендировали в воде. Затем при интенсивном перемешивании суспензию быстро нагревали до 80, выдерживали при этой температуре в течение времени, необходимого для достижения требуемой степени расщепления крахмала. За кинетикой гидролиза следили по изменению окраски декстринов при их взаимодействии с йодом в кислой среде [123]. Для инактивации а-амилазы раствор декстринов кипятили 5 мин, затем охлаждали и фильтровали.
Определение растворенных сухих веществ в растворе декстринов проводили с помощью лабораторного рефрактометра RL3 (PZO "Warszawa", Польша) и выражали в массовых процентах. На измерительную поверхность рефрактометрической призмы наносили несколько капель исследуемой жидкости, верхнюю призму прижимали к измерительной поверхности. Поворотом тумблера совмещали граничную линию с серединой креста в верхнем окошке окуляра и отмечали результат измерения на шкале процентного весового содержания сахара. Точность показания прибора в диапазоне 0 - 50% содержания сухих веществ составляет 0,2%.
Адсорбцию глюкоамилазы проводили из буферных растворов Глюкоаваморина Г18Х рН 4,6 в статических условиях при периодическом перемешивании в течение 20-24 часов при комнатной температуре. Адсорбцию фермента в динамических условиях проводили в замкнутой циркуляционной системе: реактор, смеситель, насос; объемная скорость потока не превышала 5 мл/мин. Для определения изотермы адсорбции концентрацию белка в исходном растворе варьировали от 0,05 - 3,00 мг/мл. Соотношение массы адсорбента и объема контактирующего раствора фермента составляло 1:10. Величину адсорбции оценивали по разнице количества белка в растворе до и после завершения процесса адсорбции и выражали в мг белка на 1 г носителя.
Определение концентрации белка в растворе проводили при помощи специфического красителя Кумасси G-250 по модифицированной методике [124]. Метод основан на способности белка связываться с красителем, который в кислой среде находится в двух цветных формах: красной - в свободном состоянии с максимумом поглощения 465 нм и синей - в комплексе с белком с максимумом поглощения 595 нм.
Адсорбционные свойства неорганических носителей
Поиск оптимальных адсорбентов для иммобилизации глюкоамилазы основывался на требованиях, предъявляемых пищевой промышленностью к гетерогенным катализато рам: отсутствие токсичных реагентов, недорогой метод иммобилизации на доступных но сителях, обеспечивающих высокие эксплуатационные и технологические характеристики биокатализатора. Исходя из этого, было решено в качестве носителей использовать мате риалы алюмосиликатной и углеродной природы, а в основу иммобилизации фермента по Щ дожить адсорбционный метод. Невысокую адсорбционную емкость минеральных носите лей предполагалось повысить за счет синтеза на их поверхности углеродного слоя, изменяющего её химическую природу и морфологию. Исходными предпосылками для этого послужили два ранее установленных факта: во-первых, гетерогенные катализаторы, приготовленные иммобилизацией глюкоамилазы на активированных углях, пригодны для использования в процессе гидролиза декстринов [94, 96]; во-вторых, иммобилизация ферментов на поверхности углеродсодержащих неорганических носителях существенно по ! вышает их стабильность [126]. Разработанные в Институте катализа методы синтеза угле родного слоя различной морфологии на поверхности минеральной матрицы предоставили возможность приготовления принципиально новых адсорбентов, сочетающих высокую механическую прочность с развитой за счет углеродного слоя поверхностью.
В настоящей работе были исследованы свойства гетерогенных биокатализаторов, полученных путем адсорбционной иммобилизации фермента на неорганических носителях двух типов. Первый тип составляли носители оксидной природы с синтезироваииьм на их поверхности углеродным слоем, второй тип представляли носители чисто углеродной природы. Химические свойства и морфология поверхности углеродного слоя существенно влияли на характер адсорбции фермента, его активность и стабильность. От этих ключевых параметров, в свою очередь, зависела эффективность работы катализатора, включающая такой важный технологический показатель как операционная стабильность.
Для синтеза углеродного слоя на поверхности неорганических носителей в работе были использованы два метода, описанные в п. 2.2. Первый из них, основанный на пиролизе водород-пропан-бутановой смеси на никелевом катализаторе, приводил к образованию на поверхности носителя слоя углерода, состоявшего из волокон (КВУ-слой), длина которых зависела от условий синтеза (рис. 19). В основу второго метода положена карбонизация сахарозы, импрегнированной на поверхности матрицы, в атмосфере водорода. В этом случае поверхность неорганической матрицы была покрыта сравнительно гладким пленочным слоем графитоподобного углерода (Г-слой) (рис. 20).
Поверхность носителя СУМС-1 (см. рис. 10, в) была покрыта слоем пиролитиче-ского углерода (П-слой) в виде отложений кокса размером от 0,003 мкм до 0,1 мкм, имеющих сильно разупорядоченную графитоподобную структуру [127].
Следует отметить особенности образования поверхностного углерода, синтезированного на оксидах алюминия методом каталитического пиролиза.
Определение областей протекания реакции гетерогенного гидролиза в дифференциальном безградиентном реакторе
Особенностью процессов с участием иммобилизованных ферментов является зависимость наблюдаемой скорости реакции от скорости диффузии и массопереноса. Влияние этих факторов усиливается с использованием растворов высокомолекулярных субстратов, имеющих ещё и достаточно высокую вязкость. Поэтому эффективное использование гетерогенного катализатора возможно в том случае, если процесс гидролиза протекает в кинетической области реакции. Внешние и внутренние диффузионные ограничения значительно снижают производительность происходящего в реакторе процесса гидролиза.
Известно, что скорость диффузии в меньшей степени зависит от температуры, чем скорость реакции, следовательно, характер температурной зависимости реакции может служить критерием для определения границ кинетической и диффузионной областей [43]. При исследовании влияния температуры на процесс гидролиза 1%-крахмала было показано, что в отсутствие виешнедиффузионных ограничений при повышении температуры от 25С до 65С скорость гидролиза крахмала растворимой глюкоамилазой увеличивалась в среднем в 4 раза, тогда как для иммобилизованного фермента наблюдалось лишь 2-2,5-кратное повышение скорости реакции. Другими словами, температурный коэффициент реакции для фермента в растворе составлял 1,4; для иммобилизованного - 1,2. Обработка результатов в координатах Арреииуса (рис. 34) и сравнение энергий активации процесса, осуществляемого ферментом в растворе (28 кДж/моль) и иммобилизованной глюкоамилазой (13-14 кДж/моль) подтвердили вывод о том, что процесс гидролиза крахмала контролируется диффузией. Если изучаемый биокаталитический процесс протекает в области внутренней диффузии, то скорость этого процесса лимитируется скоростью массопереиоса субстрата внутрь пористого пространства биокатализатора [130], при этом наблюдается характерная зависимость скорости процесса от размера гранул биокатализатора. В работе были проведены измерения ферментативной активности биокатализаторов, полученных путем адсорбции глюкоамилазы на носителях, различающихся размерами гранул (от 0,06 мм до 3 мм) и пористой структурой, в условиях отсутствия внешнедиффузионного торможения. Оказалось, что как для мезопористых носителей (массивный КВУ. Сибуыит) с диаметром пор 30-40 нм, так и для крупнопористых (графит и КВУ-содержащий кордиерит) с диаметром нор более 1 мкм, при увеличении размера гранулы адсорбента наблюдалось падение ферментативной активности биокатализатора (рис. 35-а,-б). Можно лишь отметить, что для мезопористого массивного КВУ падение наблюдаемой активности иммобилизованной глюкоамилазы при увеличении размера гранул адсорбента было более существенным по сравнению с крупнопористыми адсорбентами, широкие поры которых в большей степени способствовали транспорту субстрата.
