Введение к работе
Актуальность проблемы. Эндогенная опиоидная система проявляет чрезвычайно широкий спектр биологической активности, представляя собой одну из важнейших систем регуляции гомсостаза [Корнева Е.А., Шхинек Э.К., 1988; Гейн СВ., 2010; Smith Е.М., 2008; Bodnar R.J., 2010]. Ее компоненты, способные действовать как нейромедиаторы, гормоны или модуляторы многих физиологических функций, обнаружены в различных тканях - в нервной системе, надпочечниках, пищеварительном тракте, а также в иммунокомпетентных клетках [Зозуля А.А., Пшеничкин С.Ф., 1990; Sharp В.М., 2006]. Опиоидные пептиды, и в частности наиболее полифункциональный пептидный гормон р-эндорфина, участвуют в процессах нейроиммунных взаимодействий и обнаруживают выраженную иммуномодуляторную активность, реализуя свои многочисленные регуляторные эффекты через специфические опиатные сайты связывания трех основных классов и, 6, к, экспрессия которых на клетках адаптивного и врождённого иммунитета доказана на транскрипционном и трансляционном уровнях [Наволоцкая Е.В. и соавт., 2004; Bidlack J.M., 2000; Stein С, Lang L.J., 2009].
Наиболее древним в филогенетическом плане звеном иммунной системы является врождённый иммунитет, отвечающий за распознавание, уничтожение и удаление чужеродных агентов из организма. В реализации функций врождённого иммунитета принимают участие ряд клеточных популяций миелоидного (гранулоцити, моноциты-макрофаги, дендритные клетки) и лимфоидного (NK, NKT, убТ-клетки) происхождения, а также ряд гуморальных факторов (комплемент, естественные антитела) [Мейл Д. и соавт., 2007; Delves P.J., Roitt I.M., 2000J. Помимо антимикробной функции, клетки врождеігного иммунитета активно участвуют в регуляции адаптивного ответа против опухолевых и микробных антигенов, главными индукторами которого выступают С04+клетки (хелперы) [Iwasaki A., Medzhitov R., 2010]. В настоящее время показана способность опиоидных пептидов модулировать функции клеток врождённого и адаптивного
иммунитета [Plotnikoff N.P. et a!., 1999]. В то же время, ряд аспектов данной проблемы остаются мало исследованной областью науки. Достаточно противоречиво представлены в литературе данные о влиянии р-эндорфина на функции клеток врождённого иммунитета, в частности такие как продукция активных форм кислорода и секреция провоспалительных цитокинов. Недостаточно исследованными остаются молекулярные и клеточные механизмы иммунорегуляторного действия опиоидных пептидов, включающие в себя влияние на процессы пролиферации, кооперации и дифференцировки клеток адаптивного иммунитета, продукции ими ключевых цитокинов (y-lFN, IL-4, 1L-2, IL-ip), являющихся маркерными для регуляторных Т-лимфоцитов 1 и 2 типа (Thl/Th2) и определяющих выбор типа иммунного ответа [Van den Bergh P. et al., 1994; Peterson P.K. et al., 1998; Sacerdote P., 2003; Bodnar R.J., 2010].
Цель работы - исследовать роль р-эндорфина и синтетических агонистов опиатных рецепторов в регуляции функций эффекторных клеток врождённого иммунитета и процессов ТЫ/Тп2-дифференцировки Т-лимфоцитов.
Основные задачи:
1. Исследовать влияние р-эндорфина и синтетических агонистов ц-, 5-рецепторов на
продукцию активных форм кислорода фракциями лейкоцитов и нейтрофилов
периферической крови.
-
Оценить влияние Р-эндорфина и селективных агонистов ц-, 5-опиатных рецепторов на продукцию провоспалительных цитокинов фракциями лейкоцитов, мононуклеаров и нейтрофилов.
-
Исследовать влияние р-эндорфина и селективных агонистов ц-, 5-опиатных рецепторов на продукцию IL-4, IL-2 и IFN-y лейкоцитами и С04+лимфоцитами, оценить зависимость эффекта от присутствия клеток врождённого иммунитета в культуре.
-
Исследовать влияние р-эндорфина на продукцию IFN-y С08+лимфоцитами и нейтрофилами, оценить роль продуктов циклооксигеназного цикла в опиоид-опосредованной регуляции синтеза IL-4.
Научная новизна. Впервые показана зависимость влияния опиоидных пептидов на продукцию активных форм кислорода и секрецию провоспалительных цитокинов от клеточного состава культуры. Установлено, что в лейкоцитарной взвеси селективные 5- и ц-агонисты пептидной природы стимулировали спонтанную и угнетали индуцированную зимозаном реакцию люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) нейтрофилов. В очищенной фракции нейтрофилов Р-эндорфин и селективные 5- и ц-агонисты не влияли на спонтанную и угнетали активированную зимозаном ЛЗХЛ нейтрофилов. Впервые установлено, что [3-эндорфин оказывал разнонаправленное влияние на продукцию провоспалительных цитокинов, усиливая продукцию IL-ip и угнетая синтез IL-8 и TNF-cc. Стимулирующий эффект не отменялся опиатными антагонистами, в то время как угнетение IL-8 отменялось налоксоном и налтриндолом, а также зависело от присутствия липополисахарида (ЛПС). Все зарегистрированные эффекты |3-эндорфина, в частности, на продукцию IL-ip проявлялись преимущественно в условиях кооперации различных клеточных популяций. Впервые установлено, что клетки естественного звена иммунитета играют ключевую роль в регуляции р-эндорфином продукции IL-2, IL-4 и IFN-y СБ4+лимфоцитами, где решающая роль в процессе опиоид-опосредованной регуляции синтеза IL-4 и, как следствие, поляризации хелперов в направлении 1Ъ2-клсгок принадлежит продуктам циклооксигеназного цикла, преимущественно простагландину 1.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты существенно расширяют существующие представления о роли эндогенной опиоиднои системы в пеироэндокриннои регуляции иммунных реакций. В работе доказано вовлечение опиатергических механизмов в регуляцию микробицидной и цитокинпродуцирующей активности эффекторных клеток врожденного иммунитета (моноцитов и нейтрофилов). В работе приведён возможный механизм влияния опиоидных пептидов на процессы ТЫ/Тп2-дифференцировки Т-лимфоцитов. В связи с широким использованием агонистов опиатных рецепторов в практической медицине, необходим учет последствий их применения.
Результаты работы внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета (специальные лекционные курсы «Экспериментальная иммунопатология и иммунотерапия», «Молекулярные механизмы межклеточных коммуникаций»).
Положения, выносимые па защиту:
-
В лейкоцитарной взвеси селективные 5- и ц-агонисты пептидной природы стимулируют спонтанную и угнетают индуцированную зимозаном реакцию ЛЗХЛ нейтрофилов; в очищенной фракции нейтрофилов р-эндорфин и селективные 5- и ц.-агонисты не влияют на спонтанную и угнетают активированную зимозаном ЛЗХЛ нейтрофилов.
-
Р-эндорфин стимулирует продукцию IL-ip и IL-lra и угнетает синтез IL-8 и TNF-a и различные типы опиатных рецепторов могут опосредовать регуляцию цитокинпродуцирующей функции эффекторов естественного иммунитета; эффекты Р-эндорфина обнаруживаются преимущественно в условиях кооперации различных клеточных популяций - нефракционированной лейкоцитарной суспензии и фракции мононуклеаров, но не в моноцитарных культурах.
-
Клетки естественного звена иммунитета играют ключевую роль в регуляции Р-эндорфином продукции IL-4 и IFN-y С04+лимфоцитами; продуктам циклооксигеназного цикла, преимущественно простагландину Е2, принадлежит решающая роль в процессе опиоид-опосредованной регуляции синтеза IL-4 и, как следствие, поляризации хелперов в направлении ТЪ2-клеток; продукцию IFN-y СЭ8+лимфоцитами р-эндорфин не изменяет, в то время как секреция IFN-y нейтрофилами под воздействие опиоидных пептидов может усиливаться.
Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на III региональной конференции молодых ученых с международным участием «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии» (Пермь, 2007); I Всероссийской молодежной научной конференции «Молодежь и наука на Севере» (Сыктывкар, 2008); VII Международной конференции «Загрязнение окружающей среды, адаптация и иммунитет» (Пермь-Н.Новгород-Пермь, 2008); 12-ой
Международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2008); VIII Молодежной научной конференции Института физиологии Коми НЦ УрО РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2009); II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009); VI международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 5 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура работы. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 29 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 192 наименования, в том числе 28 отечественных и 164 зарубежных.
