Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 11
1.1. Посттрансфузионные инфекционные осложнения 11
1.2. Потенциальные риски гемотрапсфузий 39
1.3. Факторы риска развития посттрансфузионных инфекционных осложнений 41
Глава II. Материалы и методы 47
2.1. Нормативно-правовые основы обеспечения инфекционной безопасности гемотрансфузий 47
2.2. Материалы и этапы исследования 50
2.3. Методы исследования 52
2.4. Контроль качества при проведении исследования 59
2.5. Ретроспективный анализ заболеваемости ВГС доноров крови 59
2.6. Статистическая обработка результатов исследования 61
Глава III Результаты и их обсуждение 64
3.1. Основные понятия и определения 65
3.2. Процедура повторного серологического контроля 68
3.3. Тестирование нуклеиновых кислот 73
3.4. Выявляемость маркеров вирусного гепатита С 75
3.5. Оценка остаточного риска трапсфузиоино-трансмиссивной передачи вирусного гепатита С 85
3.6. Социально-экономическое обоснование внедрения алгоритма лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови 90
Заключение 94
Выводы 95
Библиографический список 97
- Потенциальные риски гемотрапсфузий
- Контроль качества при проведении исследования
- Процедура повторного серологического контроля
- Выявляемость маркеров вирусного гепатита
Введение к работе
Актуальность исследования
Вирусный гепатит С - кровяная вирусная инфекционная болезнь с контактным механизмом передачи. Она характеризуется преимущественным поражением печени и является социальнозначимой инфекционной патологией. На долю вирусного гепатита С в структуре вирусных гепатитов в нашей стране приходится от 5 до 15 % случаев [Онищенко Г.И., 2008].
Возбудитель заболевания - РНК-содержащий вирус. Источником инфекции являются люди, больные острым и хроническим гепатитом С, и вирусоносители. Вирус гепатита С (HCV) передается парентеральным путем. Один из способов передачи - трансмиссивное заражение при проведении гемотрансфузий.
Частота носительства возбудителя гепатита С у доноров крови достигает 7% [Дашкова Н.Г., Расницын СП., и др., 2005]. Это обуславливает необходимость лабораторного тестирования крови доноров для выявления возможных вирусоносителей гепатита С и выбраковки гемопродукции, заготовленной от этих доноров.
Существовавший до последнего времени алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С в крови доноров включал определение антител к вирусу гепатита С путем иммуноферментного анализа и проведение подтверждающего теста - иммунологического блотинга, метода выявления антител к отдельным антигенам возбудителя. Проведенные в последнее время исследования [Дашкова Н.Г., 2006; Карслян Л.С., 2007] указывают на недостаточность использования данных методов. Они не обеспечивают максимальную безопасность реципиентов от заражения вирусным гепатитом С и не позволяют с высокой степенью надежности оценить возможность сохранения заготовленной гемопродукции от лиц, сомнительные результаты первичного обследования которых не связаны с указанным выше вирусом.
Поэтому разработка усовершенствованного алгоритма лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови и ее компонентов является актуальной, так как адекватная схема диагностики снижает риск развития посттрансфузионного вирусного гепатита С у реципиентов, по результатам
лабораторных исследований решается вопрос о возможности использования заготовленной от донора гемопродукции, и способствует сохранению кадровых доноров.
Цель исследования
Разработать рациональный алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови и ее компонентов в соответствии с современными достижениями в области лабораторных исследований для снижения риска его трансфузионно-трансмиссивной передачи.
Задачи исследования
Обобщить данные о риске развития постгрансфузионного вирусного гепатита С.
Провести мониторинг выявления вирусного гепатита С у доноров крови и ее компонентов в зависимости от используемых методов лабораторной диагностики.
Усовершенствовать алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С в крови доноров в соответствии с использованием современных доступных методов.
4. Разработать алгоритм выбраковки гемопродукции по результатам
лабораторного обследования донорской крови на наличие маркеров вирусного
гепатита С.
5. Оценить медико-экономическую эффективность внедрения
разработанного алгоритма лабораторной диагностики вирусного гепатита С у
доноров крови и ее компонентов.
Научная новизна
Разработан алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови, впервые включающий процедуру повторного серологического контроля крови доноров с неоднозначными значениями по результатам первичного лабораторного скрининга и процедуру тестирования всех серонегативных на антитела к вирусу гепатита С образцов на наличие РНК вируса гепатита С (HCV). Разработан алгоритм выбраковки и использования заготовленной от доноров гемопродукции по итогам лабораторного
тестирования на наличие маркеров вирусного гепатита С. Рассчитаны уровни выявляемости вирусного гепатита С среди доноров крови г. Москвы за 2000-2008 гг. Рассчитан остаточный риск трансфузионно-трансмиссивной передачи вирусного гепатита С в г. Москве.
Практическая значимость исследования
Алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови, включающий повторное обследование доноров через 1-3 месяца и РНК-тестирование серонегативных на антитела к вирусу гепатита С (anti-HCV) образцов сыворотки крови, снижает риск инфицирования реципиентов при переливании компонентов крови.
Предложенный алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови позволяет сократить количество ложноположительных результатов исследования и использовать гемопродукцию, заготовленную от неинфицированных доноров.
Разработанные методические основы вычисления остаточного риска трансфузионно-трансмиссивной передачи вирусного гепатита С могут быть использованы на станциях переливания крови.
Положения, выносимые на защиту
1. Введение повторного серологического контроля через 1-3 месяца крови
доноров с неопределенными или сомнительными результатами скринингового
лабораторного исследования на наличие маркеров вирусного гепатита С
позволяет снизить риск инфицирования реципиентов при применении
компонентов крови.
Внедрение тестирования крови доноров на наличие РНК вируса гепатита С позволяет уменьшить остаточный риск инфицирования гепатитом С потенциальных реципиентов.
Алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С в крови доноров, включающий повторное обследование доноров через 1-3 месяца и РНК-тестирование, позволяет увеличить безопасность гемотрансфузий и минимизировать получение ложноположительных результатов.
4. Разработанный алгоритм выбраковки гемопродукции по результатам
лабораторного обследования донорской крови на наличие маркеров вирусного
гепатита С позволяет сохранить пригодные к использованию компоненты
крови.
5. Медико-экономическая эффективность внедрения разработанного
алгоритма лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови и
ее компонентов заключается в снижении остаточного риска
посттрансфузионного инфицирования ВГС, уменьшении заболеваемости в
данном спектре патологии и сокращении затрат на лечение.
Внедрение результатов исследования
Разработанный алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови лег в основу Приказа Департамента здравоохранения г. Москвы № 513 от 29 ноября 2007 г «Об усилении мер, направленных на снижение риска развития посттрансфузионных осложнений».
Методика расчета относительного риска развития трансфузионно-трансмиссивной передачи ВГС используется централизованной клинико-диагностической лабораторией станции переливания крови ДЗ. г. Москвы для оценки качества заготовленной гемопродукции.
Результаты полученные в ходе диссертационного исследования используются в процессе обучения врачей и биологов клинико-диагностических лабораторий на циклах усовершенствования и профессиональной переподготовки на кафедре клинической лабораторной диагностики ФУВ ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.
Апробация
Апробация состоялась 23 марта 2009 г. на совместном заседании кафедры клинической лабораторной диагностики ФУВ, ПНИЛ нуклеинового и белкового обмена ГОУ ВПО РГМУ Росздрава и централизованной клинико-диагностической лаборатории (ЦКДЛ) станции переливания крови Департамента здравоохранения г. Москвы.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.
Личный вклад автора
Автор провел повторное серологическое обследование 99 доноров. При этом выполнил 256 исследований методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) и 58 методом линейного иммунологического блотинга. В период с 2005 по 2008 г выполнил 3250 исследований методом ИФА, 4826 методом хемилюминесцентного иммунохимического анализа на микрочастицах, 568 методом линейного иммунологического блотинга. Внедрил метод тестировании РНК HCV на анализаторе Cobas Amplicor, проанализировав при этом 4248 образцов сыворотки крови доноров. Провел мониторинг выявляемое вирусного гепатита С у доноров крови СПК ДЗ г. Москвы за 2000-2008 гг. Рассчитал остаточный риск трансфузионно-трансмиссивной передачи вирусного гепатита С в период до и после внедрения исследования крови доноров на наличие РНК HCV. Автором проведена статистическая обработка и анализ полученных результатов.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 113 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и библиографического списка, включающего 113 отечественных и 63 иностранных источника. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 10 рисунками.
Потенциальные риски гемотрапсфузий
Заготовленная донорская плазма, форменные элементы и криопрсципитат поступают в лечебные учреждения для проведения гемотрансфузнй. Заключение об их вирусной безопасности делается на основе лабораторных анализов сыворотки крови доноров. Сами компоненты крови, вводимые человеку, не контролируются на отсутствие вирусных инфекций. В России принято считать, что мероприятий но врачебному контролю доноров и тестирования сыворотки доноров достаточно для предотвращения попадания в продукты донорской крови вирусных агентов. Введение требований GMP («Good manufacturing practice» - «Правила правильного производства») о входном контроле исходного сырья для производства препаратов крови и требований по контролю препарата «криопреципитат» показало, что отечественная система заготовки компонентов крови не обеспечивает их вирусную безопасность и, поэтому, требует обязательной модернизации. Опыт использования продуктов крови в клинической практике последних лет указывает на высокую вирусную опасность гемотрапсфузий, особенно для категорий больных, которым показаны длительные или частые введения компонентов крови. Оказалось, что при контроле препарата «плазма для фракционирования» (аналог свежезамороженной плазмы для переливаний) и препарата «криопреципитат», полученных по принятой в Российской Федерации технологии врачебного контроля и анализа сыворотки крови доноров в указанных продуктах крови определяются маркеры вирусных инфекций [27, 70].
При анализе ситуаций в Российской Федерации но обеспечению инфекционной безопасности продуктов донорской крови [38, 59] было установлено что наиболее вирусоопасным является препарат «криопреципитат». Его потенциальная вирусная опасность превышает опасность плазмы в 4 раза по отношению к гепатиту В и примерно в 1,5 раза по отношению к гепатиту С. Учитывая, что основное количество криопреципитата и свежезамороженной плазмы D РФ не проходит контроль готовой лекарственной формы и переливается лишь на основании результатов лабораторного обследования доноров, риск заражения вирусными инфекциями при переливании остается значительным. В 1 из 151 дозы криопреципитата возможно обнаружение маркеров гепатита В и в 1 из 184 доз маркеров гепатита С. Суммарный риск обнаружения маркеров одной из трех вирусных инфекций в случае криопреципитата примерно 2 раза выше, чем у свежезамороженной плазмы. Контроль плазмы для фракционирования в 2003 г. был проведен примерно для 60 000 доз (1,5% всей заготовленной крови). Это означает, что при объеме заготовок в Российской Федерации 4 млн доз в год в лечебную сеть и для производства препаратов крови поступает примерно 1620 доз, потенциально имеющих маркеры вируса ВИЧ-1/2, 13900 доз, имеющих маркеры вируса гепатита В и 21500 доз, имеющих маркеры вируса гепатита С. Возможно, эти данные объясняют высокий уровень зараженности вирусными инфекциями отдельных категорий больных, которым по жизненным показателям показано многократное переливание больших доз компонентов крови. Рассчитанные потенциальные риски обнаружения маркеров вирусных инфекций в продуктах крови не могут полностью соответствовать рискам заражения вирусными инфекциями при гемотраисфузиях, установленным по клиническим случаям, однако в значительной степени позволяют оценить инфекциошгую безопасность гемокомпоиетов. В то же время факт обнаружения маркеров вирусных инфекций в продуктах крови, вводимых человеку, является недопустимым, так как может привести к инфицированию пациента в результате проведения гемотрансфузин.
Гарантии безопасности, заложенные в современных технологиях бактериальной и вирусной инактивации крови и ее компонентов, глубокой переработки плазмы базируются на качественном отборе и использовании адекватных методов лабораторной идентификации образцов крови 11].
В России за последние годы произошли серьезные изменения в донорском движении. За последние 15 лет общее число доноров уменьшилось более, чем в два раза, в том числе за последние 10 лет на 40% [83, 84]. При этом отмечается троекратное увеличение числа активных доноров и 50-процентное сокращение количества доноров резерва. Из общего числа доноров (2,2 миллиона) активные доноры составляют 22,6%, доноры резерва -76,4%. Одной из важнейших причин роста риска артифициальной передачи гемоконтактных инфекций ряд российских и зарубежных авторов считает увеличение популяции платных доноров [14, 58, 132]. Резкому падению числа безвозмездных доноров в России способствует возрастающая денежная компенсация донорам за сданную кровь и ее компоненты. Учитывая, что денежная компенсация донорам составляет более 40% стоимости компонентов крови, увеличение компенсации донорам ведет к резкому удорожанию компонентов крови.
Рост числа платных доноров вызывает особую тревогу, так как именно среди этой категории нередко встречаются лица из социально неблагополучных слоев, страдающие хроническими гепатитами, ВИЧ-инфекцией и другими социальнозпачимыми заболеваниями [63]. Серьезные изменения произошли в группе доноров - родственников, в которой истинные родственники составляют 6-7%, а остальные - это посторонние лица, сдающие кровь по договоренности с близкими больного за денежное вознаграждение. Несмотря на денежные компенсации и прочие привилегии, предлагаемые донорам, ряд инфицированных лиц, будучи информированными о своей патологии, продолжают сдавать кровь. Тем самым данные лица подвергают риску потенциальных реципиентов. Законодательная база в отношении данной группы граждан недостаточно строга. Это приводит к снижению эф фективности принимаемых службой крови мер по обеспечению инфекционной безопасности гемотрансфузий, к дополнительному расходованию средстн на выявление данных субъектов и лечение зараженных реципиентов. Указанные выше лица негативно влияют на общий социальный статус донора.
Контроль качества при проведении исследования
Все лабораторные исследования были выполнены с соблюдением действующего законодательства по обеспечению контроля качества лабораторных исследований, в том числе:
1. Приказ Минзрава РФ от 07 февраля 2000г. № 45 «О системах мер по повышению качества клинических лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения Российской Федерации».
2. Приказ Комитета Здравоохранения г. Москвы от 24 марта 2000 г. № 118 «О системе мер по повышению качества клинических лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения г. Москвы».
3. Приказ Минздрава РФ от 26 мая 2003 г. № 220 «Правила проведения вігутрилабораторіюго контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований с использованием контрольных материалов».
Для проведения ретроспективного анализа заболеваемости доноров крови ВГС была использована база данных единого донорского центра СПК ДЗ г. Москвы.
Единый донорский центр (ЕДЦ) станции переливания крови Департамента здравоохранения г. Москвы в режиме реального времени получает информицию о донорах, их донациях и результатах лабораторных исследований крови доноров со станции переливания крови ДЗ г. Москвы, 15 отделений переливания крови лечебно-профилактических учреждений г. Москвы (ОПК) и отдела государственной регистрации заболеваний (ОГРЗ). Схема взаимодействия и обмела информацией структурных подразделений службы крови ДЗ г. Москвы представлена па рисунке 4.
Данные предоставлялись в виде общих отчетов за необходимый период наблюдения и карт доноров, содержащих информацию о дате и тиле проведенной донации, а также результаты лабораторных исследований.
Были проанализированы 341952 карты доноров за период с 01.01.2000 по 31.12.2008 г. В исследование включены только данные об аллогенных донациях цельной крови и процедурах тромбоцит- плазмафереза.
Расчет остаточного риска проводился по следующей схеме. Уровень инфицированности HCV на 1000 донаций был определен как отношение общего числа доноров с подтвержденным лабораторным диагнозом «положительная реакция на гепатит С» к общему числу донаций за анализируемый период. Уровни заболеваемости были отдельно рассчитаны для первичных и повторных доноров, которые во время первой донаций были здоровы. Уровень заболеваемости на 1000 человеко-лет был вычислен только с учетом повторных доноров, имевших 2 и более донаций за период наблюдения. Для всех доноров с отрицательной реакцией на гепатит С показатель человеко-годы рассчитывался как сумма всех временных промежутков между донациями за период наблюдения. Для доноров с подтвержденой положительной реакцией на гепатит С показатель человеко-годы рассчитывался как сумма всех междонационных периодов плюс половина серокон вереи онного периода.
Остаточный риск трансфузионно-трансмиссивной передачи вирусного гепатита С на 1 миллион донаций был рассчитан как произведение уровня заболеваемости и периода серологического окна, выраженное в годах.
Статистическая обработка результатов для оценки полученных данных проводилась общепринятыми методами с использованием программы Statistica 6.0 (Statsoft, США) [77] и статистического пакета программы Excel 2003 (MicrosoH, CUIA). Оценка достоверности результатов исследования проводилась следующими способами: 1. Определение ошибок репрезентативности средних величин и интенсивных показателей. 2. Определение доверительных границ средних величин и интенсивных показателей в генеральной совокупности. 3. Оценка достоверности разности между средними величинами и интенсивными показателями по критерию t (критерию Стьюдента) Вычисление параметров качественных признаков. Для описания распределения качественного номинального признака использовался показатель мода (Мо) - наиболее часто встречающееся на данной выборке, типичное для нее значение номинального признака. Для качественного номинального признака были вычислены абсолютные и относительные частоты. На основании анализа данных выборки были вычислены границы доверительных интервалов с учетом коэффициента доверительной вероятности 95%. При вычислении верхней и нижней границ доверительного интервала для относительной частоты бинарного признака использовалась приближенная формула: где Р- относительная частота события, выраженная в десятичном дробью, л- общее число объектов исследования в выборке, і - значение I-критерия, соответствующее объему исследуемой выборки и доверительною интервала (t=l,96 для 95% доверительный интервал), — - поправка на 2п непрерывность, компенсирующая ошибку, возникающую при аппроксимации биноминального распределения нормальным.
В России периодически отмечаются случаи инфицирования пациентов вирусным гепатитом С при проведении медицинских манипуляций, в частности, транефузионной терапии. Вероятность риска посттрансфузионного инфицирования реципиентов сохраняется. Создание нового алгоритма выявления доноров, зараженных вирусом гепатита С, который позволит снизить риск инфицирования реципиентов является важной государственной задачей, решение которой будет способствовать сохранению здоровья населения.
Основные задачи при обследовании доноров на вирусные инфекции -снижение вероятности инфицирования потенциальных реципиентов, сохранение кадровых доноров и максимальное использование крови и ее компонентов, полученных от здоровых доноров. Наличие «серологического окна», то есть промежутка времени» в течение которого антитела к вирусу гепатита С не определяются, а также получение сомнительных результатов лабораторного обследования, заставляет искать новые подходы и алгоритмы лабораторной диагностики.
Для оценки эффективности вновь предложенного алгоритма предполагается проанализировать эффективность процедуры серологического контроля доноров на выявление маркеров ВГС через 1-3 месяца, эффективность внедрения метода тестирования нуклеиновых кислот (ТНК) для раннего выявления РНК HCV в крови доноров и оценить остаточный риск посттрансфузионного инфицирования реципиентов вирусным гепатитом С до И после внедрения НОВОГО алгоритма лабораторной диагностики.
Процедура повторного серологического контроля
Данная процедура подразумевает повторное обследование доноров через промежуток времени» который в зависимости от ситуации составляет от 1 до 3 месяцев. Такой разброс сроков вызова донора на обследование обусловлен рядом факторов. За данный промежуток времени значительно возрастает вероятность появления антител к HCV у лиц с сомнительными результатами при первом скрининге. В то же время, большие трудности вызывает повторный вызов донора на обследование.
На повторное обследование направлялись доноры, у которых в исследуемом образце при первичном проведении ИФЛ ОП0б ОП ри1 - 0,2 ОПКр)Т, а подтверждающий тест с использованием ЛИА отрицательный или неопределенный. В исследуемую группу было включено 99 доноров. Проведенное повторное лабораторное обследование не выявило у 70 (70,7%) из обследованных доноров наличия антител к вирусу гепатита С, и лабораторный диагноз «вирусный гепатит С» был снят, указанные лица были возвращены в донорский контингент. Вместе с тем в сыворотке крови 5-ти (5,0%) допоров из исследуемой группы были обнаружены anti-HCV и поставлен лабораторный диагноз «вирусный гепатит С». От донорства данные лица были отстранены и направлены на клиническое обследование в гепатологический центр инфекционной клинической больницы № 1 Департамента здравоохранения города Москвы (ИКБ Ле 1). У 24 (24,2%) доноров при серологическом исследовании была получена неспецифическая реакция на anti-HCV, они также были отстранены от донорства и направлены в гепатологический центр инфекционной клинической больницы № 1 для клинического обследования. Эффективность внедрения повторного лабораторного обследования доноров на наличие маркеров вирусного гепатита
По информации единого донорского центра двум (8,3%) из 24 доноров с неспецифической серологической реакцией на anti-HCV в ИКБ №1 был поставлен клинический диагноз «вирусный гепатит С». Пять доноров (20,8%) проходят обследование в гепатологическом центре, их дальнейшая судьба не известна. У оставшихся 17 (70,8%) человек в донорских карточках значится лабораторный диагноз «неспецифическая реакция на ВГС».
Результаты лабораторного дальнейшего использования заготовленной Таким образом, семи донорам (7,1%) из 99 при динамическом наблюдении был поставлен диагноз «вирусный гепатит С» и заготовленная от них продукция была забракована, чем предупреждено инфицирование возможных реципиентов. Здоровые доноры в количестве 70 человек (70,7%) были восстановлены в донорстве (Рис.6). исследования определяют алгоритм гемопродукции. Из всех компонентов крови наибольшим сроком годности отличается свежезамороженная плазма.
Данные повторного серологического контроля через 3 месяца (от 7.05.2007). Первая постановка ИФА: 0 =0,45 при ОП» = 0,3. Вторая постановка ИФА: ОПобр=0,4 при ОП ркт 0,3. Результаты линейного иммунохимического анализа положительные.
При лабораторном исследовании 20.02.2007г. в первой постановке ИФА выявлено значение оптической плотности исследуемого образца в границах «20% серой зоны». Во второй постановке ИФА получен отрицательный результат на anti-HCV. Подтверждающий тест отрицательный. Полученные данные могут быть интерпретированы двояко. Во-первых, возможно получен ложноположительный результат при первой постановке ИФА, вторая постановка ИФА и конфирматорный тест подтверждают это предположение. С другой стороны, возможно, титр антител к вирусу гепатита С в крови доноров находится на границе диагностической чувствительности используемых в исследовании тест-систем. В целях обеспечения безопасности гемотрансфузии все не подлежащие карантинизации компоненты крови этого донора были утилизированы, а плазма крови карантинизироваиа до момента получения результатов серологического контроля донора через 1-3 месяца. По результатам проведенного 17.05.2007г. лабораторного обследования, донору N был поставлен лабораторный диагноз «вирусный гепатит С». Данный диагноз был позднее подтвержден клинически в гепатологическом центре ИКБ №1,о чем имеется запись в карте донора единого донорского центра.
Резюмируя приведенные сведения, следует отметить, что внедрение процедуры серологического контроля позволило в 2007 году возвратить в донорский контингент 70 человек у которых был получен отрицательный результат в ходе обследования на an(i-HCV, Что составило 0,19 % ОТ общего числа (37250) доноров плазмы и крови. Плазма крови этих доноров была карантинизироваиа и в дальнейшем реализована.
В то же время, положительная реакция на anii-1-lCV была получена в 5-ти случаях, то оставило 0,013% от общего числа (37250) доноров плазмы и крови. Эти доноры получили абсолютный отвод от донорства, а все компоненты крови были утилизированы.
Согласно процедуре лабораторной диагностики, которая использовалась до 2002 г, и была регламентирована приказами Минздрава РФ, каранти низи ро ванные компоненты крови этих доноров, а также компоненты, не подлежащие карантинизации могли быть использованы для потенциальных реципиентов.
Таким образом, введение повторного серологического контроля через 1-3 месяца крови доноров, у которых в исследуемом образце при первом проведении ИФА ОПобр находится в области сомнительных значений, при втором проведении ИФА отрицательный на anti-HCV, а подтверждающий тест отрицательный или неопределенный, позволяет на 0,013% (р 0,05, п=37250) снизить риск инфицирования реципиентов при применении компонентов крови, и на 0,19% (р 0,05, п=37250) уменьшает абсолютный отвод от донорства столь ценных в наши дни доноров.
Выявляемость маркеров вирусного гепатита
Для оценки результативности методов детекции вирусного гепатита С было проведено ретроспективное исследование по изучению выявляемости маркеров вирусного гепатита С у доноров станции переливания крови ДЗ г. Москвы. Следует отметить, что с эпидемиологической точки зрения, для службы крови показатель выявляемости вирусных инфекций идентичен показателю инцидентности, поскольку при расчете учитываются только впервые выявленные случаи заболевания. Это возможно благодаря использованию базы данных ЕДЦ и ОГРЗ. Проанализированы 341952 карты доноров за период с 01.01.2000г. по 31.12.2008 г. В исследование включены только данные об аллогенных донациях цельной крови, процедурах плазма- и тромбоцитафереза. Изучено распределение годовых показателей инцидентности вирусного гепатита С у доноров СПК ДЗ г. Москвы. Уровни инцидентности ВГС у доноров крови в период с 2000 по 2008 гг. представлены а в таблице 5 и графически отражены на рисунке 7. Как видно из иллюстрационного материала, в период с 2000 по 2002 год отмечался рост показателя вывляемости ВГС у доноров крови, который достиг уровня 34,08 0,0194 на 1000 доноров.
Начиная с 2003 года показатель выявляемости ВГС начал снижаться и в 2008 году составил 10,37 0,0009 на 1000 доноров. Таким образом, показатель инцидентности ВГС к 2008 году снизился в 3,2 раза по сравнению с 2002 годом.
Изменение тенденции инфицированности доноров вирусным гепатитом С соответствуют, в основном, тенденциям заболеваемости (инцидентности) ВГС населения Российской Федерации в целом за период наблюдения (Рисунок 8) 161,621 Снижение показателя инцидентности связано как с общим уменьшением заболеваемости ВГС населения РФ, так и совершенствованием методов лабораторной диагностики ВГС. За период времени с 2000 по 2008 гг. для выявления у доноров ВГС менялись тест-системы для ИФЛ, а также добавлялись новые методы исследования (таблица 6). В таблице 6, кроме методов, использованных в разные годы, указан период «серологического окна». «Серологическое окно» или диагностическое окно это период между заражением и возможностью выявления вируса современными методами лабораторной диагностики. Для каждой диагностической системы данный период определяется разработчиком путем анализа сероконверсионных панелей. Данные по периоду серологического окна разработчик приводит в инструкции по применению набора.
Как видно из таблицы 6, в 2000 и 2001гг. для диагностики ВГС лаборатория СПК ДЗ г. Москвы использовала ИФА тест-системы 2-го поколения. В настоящий момент на рынке лабораторной диагностике представлены ИФА тест-системы 4-го поколения для диагностики anli-HCV.
В первом поколении тест-систем в качестве антигена использовали белки кодированные зоной NS3 и NS4 РНК HCV, данные тест-системы основывались на обнаружении антител К вирусному антигену с 100 (анти-сЮО) (Таблица 7) (139]. Однако анти-сЮО могут появляться через много лет после инфицирования ВГС, при этом наблюдается высокая частота ложноположительных результатов в популяциях низкого риска, таких как доноры [106, 134].
Во втором поколении тест-систем ИФА к белкам, использованным в диагностикумах первого поколения, дополнительно добавлены белки, кодированные С - зоной РНК HCV (с22), а также зоной NS3 (с200 и сЗЗс) [114]. Тем самым тест-системы второго поколения являются более чувствительными [152]. Антитела к данным антигенам обнаруживаются чаше, чем анти-ЫОО, и появляются в более ранние сроки. Тест-системы второго поколения могут использоваться в диагностике как острой, так и хронической ВГС-инфекции.
В соответствии с процедурой лабораторной диагностики ВГС, действовавшей в лаборатории в 2000-2001 п\ постановка лабораторного диагноза «положительная реакция на гепатит С» производилась но результатам двух постановок ИФА на наличие anti-HCV. Вторая постановка ИФА проводилась в тот же день при получении положительных или сомнительных результатов на anti-HCV с целью исключить техническую ошибку анализа и увеличения надежности результата.
Положительной реакция считалась при получении оптической плотности в исследуемой сыворотки ОП0(ф ОПкрт-0,1 ОПкр„г, с учетом 10% «серой зоны», то есть зоны сомнительных результатов, в соответствии с рекомендациями производителя реагентов. С 2002г. для диагностики ВГС стали использоваться ИФА тест-системы 3 поколения. Помимо белков, применяемых в диагностикумах второго поколения, в диагностический препарат третьего поколения введен белок, информация о котором находится в NS5 зоне РНК HCV. На вопрос о необходимости введения этого белка в диагностические препараты нет однозначного ответа. По мнению некоторых исследователей, отсутствие образцов сывороток крови с наличием изолированных антител к белкам, кодированных зоной NS5, делает ненужным его использование в диагностическом препарате. Третье поколение тест-систем ИФА широко используется для скрининга донорской крови, является более чувствительным и специфичным по сравнению с тест-системами ИФА предыдущих поколений [118, 143] и дает высокую гарантию предотвращения заражения реципиентов донорской крови. Применение диагностикумов третьего поколения позволило сократить время первого выявления anti-HCV в процессе острой инфекции [157]. Если с помощью диашостикумов первого и второго поколений первый позитивный результат регистрировали на 16 и 10 неделе заболевания, с диагностикумами последующих поколений - начиная с 2-3 недели. Их внедрение в службу переливания крови позволило резко сократить число случаев поеттранфузионного гепатита С. Частота выявления anti-HCV среди РНК HCV позитивных образцов при помощи диагностикумов первого, второго и третьего поколений соответственно составляет 70—80%; 92-95% и 97%. По расчетам американских исследователей риск инфицирования гепатитом С при переливании крови в США составляет 1:103000. Столь высокий уровень предотвращения контаминации крови вирусом гепатита С обеспечивается высокой чувствительностью применяемых для выявления ВГС диагностических тест-систем. Вместе с тем некоторое количество сывороток крови, содержащих вирус гепатита С, НС удается выявить самыми современными ИФЛ диагностикумами, применяемыми для выявления anli-HCV.
С целью улучшения скрининга на основании анализа работы лаборатории предыдущих лет серая зона при постановке ИФЛ была расширена до 20%. Положительными на наличие маркеров ВГС считались образцы, дающие положительную реакцию в двух постановках ИФЛ со значениями ОПоГ р ОПкр1-0,2ОПкрП.. Расширение размера «серой зоны» было введено для обеспечения безопасности гемокомпонентов, не подлежащих карантинизации. Расширение размера «серой зоны» привело к незначительному увеличению ложноположительных результатов, которые трактовались как «положительная реакция» для выбраковки гемолродукции, но не использовались для постановки лабораторного диагноза и отвода донора от донорства. Данные действия привели к увеличению выявляемости ВГС у доноров в 2002 году, что не коррелирует с общей тенденцией по данному показателю в стране (Рисунок 7).
Вместе с тем, именно эти действия позволили предотвратить инфицирование реципиентов гемопродуктами. Как показал проведенный ретроспективный анализ, у восьми доноров с первично сомнительными результатами, то есть попавшими в 20% «серую зону» при проведении иммуноферментного анализа на наличие anli-MCV, впоследствии были выявлены маркеры вирусного гепатита С. В серую зону, в основном попадают пациенты имеющие низкий уровень антител в соответствии с серологическим окном и пациенты у которых возникает перекрестная реакция с другими антигенами.
