Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Системы аналитического определения стереоспецифических соединений и их взаимодействий
1.1. Основные этапы развития методов иммуноанализа 19
1.2. Системы детекции в вариантах упрощенного иммуноанализа 39
1.3. Форматные аранжировки аналитических систем 55
1.4. Твердофазные реагенты как компоненты иммуноаналитических систем
Глава 2. Материалы и методы 72
Глава 3. Технология получения диагностических реагентов на основе углеродных наночастиц
3.1. Основные проблемы существующих систем детекции 78
3.2. Методические и технологические подходы к получению и оценке свойств частиц коллоидного углерода
3.2.1. Исследование возможных источников углеродных частиц 82
3.2.2. Методические подходы к исследованию оптических свойств углеродных суспензий
3.3. Разработка метода одноэтапного конъюгирования аффинных соединений с углеродной меткой
3.3.1. Разработка способа получения устойчивой водной суспензии углеродных частиц
3.3.2. Метод ультразвуковой дезинтеграции в процессе получения стабильного углеродного суспензоида. Подходы к формализации понятия «оптическая плотность» реагентов
3.3.3. Исследование условий, разработка метода и оценка эффективности синтеза детектирующих реагентов
3.3.4. Особенности синтеза углеродных конъюгатов с использованием поли- и моноклональных антител
3.3.5. Определение рабочей концентрации диагностических реагентов. Расчет титра (рабочего разведения) синтезируемых конъюгатов
3.3.6. Исследование размеров частиц полученных конъюгатов 102
3.3.7. Исследование стабильности углеродных диагностикумов при хранении
Глава 4. Иммуноаналитические системы на основе G белка, конъюгированного с наночастицами углерода
4.1. Твердофазные реагенты. Способы конструирования, защиты и стабилизации
4.1.1. Способ защиты и стабилизации твердофазных реагентов на основе пористых материалов
4.1.2. Способ защиты и стабилизации твердофазных реагентов на основе непористого материала
4.2. G белок как универсальный анти-лиганд универсальных систем детекции
4.2.1. Прямое определение IgG 113
4.2.2. Определение антител к ВИЧ-1 и 2 в варианте сэндвич-анализа методом иммунноблотинга
4.2.3. Определение антител к стрептококку группы А (СГА) 120
4.2.4. Универсальный набор для определения IgG 122
Глава 5. Иммунохроматографические, иммунофильтрационные идот-форматные системы на основе углеродных наночастиц, конъюгированных с антителами
5.1. Иммуноаналитические системы определения хорионического гонадотропина человека (ХГЧ)
5.1.1. Иммунохроматографическое определение ХГЧ 125
5.1.2. Иммунофильтрационное определение ХГЧ 129
5.1.3. Дот-форматная аранжировка аналитической процедуры полуколичественного определения ХГЧ
5.2. Иммуноаналитическое определение стрептококка группы А 135
5.2.1. Прямое дот-иммуноаналитическое определение стрептококка группы А
5.2.2. Дот-иммуноаналитическое определение стрептококка гр. А в варианте сэндвич-анализа
5.3. Иммуноаналитическое определение белков фетоплацентарного комплекса
5.3.1. Дот-иммуноаналитическое определение АФП и ТБГ в сыворотке крови беременных женщин
5.4. Полуколичественная оценка уровня сероконверсии в ходе получения специфических антител
Глава 6. Биотин-стрептавидиновые взаимодействия в иммунодиагностике
6.1. Определение столбнячного и ботулинического анатоксинов на непористой твердой фазе
6.2. Универсальность системы биотин-стрептавидиновой детекции 150
6.3. Возможности усиления чувствительности биотин-стрептавидиновой детекции
6.4. Дот-гибридизационное определения ДІЖ фага лямбда 155
Обсуждение 157
Выводы 166
Практические рекомендации 168
Список литературы 169
- Системы детекции в вариантах упрощенного иммуноанализа
- Методические и технологические подходы к получению и оценке свойств частиц коллоидного углерода
- Способ защиты и стабилизации твердофазных реагентов на основе пористых материалов
- Иммунохроматографическое определение ХГЧ
Введение к работе
Актуальность проблемы. В современной аналитической практике разработан ряд методов иммуноанализа, каждый из которых условно можно разделить на три стадии: формирование специфического комплекса антиген-антитело, введение в него метки и ее регистрация тем или иным способом. К таким методам можно отнести радиоиммунологический анализ [Yallow, Berson, 1959], иммуноферментный анализ [Engvall, Perlmann, 1971, 1972, Weemen, Schuurs, 1971, Rubinstein et al., 1972], био- и хемилюминесцентные иммуноанализы [Woodhead, Weeks, 1985, Ullman et al., 1996], флюориметрический анализ [Frank, 1978, Frengen et al., 1993] и его микрообъемные модификации [Swartzmann et al., 1999, Zuck et al., 1999, Martens et al., 1999], анализ проточной цитометрией [Fulwyler, 1976, Cook, Irving, 1989, Frengen et al., 1993, McHugh, 1994]. Все перечисленные методы обладают рядом положительных качеств: универсальностью, т.е. позволяют определять любое соединение, против которого возможно получить специфические антитела, избирательностью и специфичностью, высокой чувствительностью. Однако наряду с достоинствами, у них есть некоторые недостатки. В частности, опасность для здоровья, связанная с использованием изотопных меток в радионммунолопіческих исследованиях (РИА), токсичные и канцерогенные свойства хромогенных субстратов, применяемых в иммуноферментном анализе (ИФА). Кроме того, ряд методов зависит от сложной и дорогостоящей регистрирующей аппаратуры, обладает трудоемкостью и относительной длительностью исполнения (РИА, хемилюминесцентный и флуоресцентный анализы, проточная цитометрия).
К настоящему времени достаточно хорошо известны системы анализа с прямым мечением специфичных по отношению к определяемому веществу (лиганду) аффинных соединений (анти-лигандов) оптически плотными
частицами или цветными полимерами различной природы и размеров. Среди таких меток следует отметить латексы, в том числе цветные [Remington et al., 1983, Bangs, 1987, 1996, Lin You-chu et al, 1989, Gerber et al, 1990, Tarcha et al, 1990], эритроциты [Guesdon, Avrameas, 1980, Плаксин, 1986], неметаллические коллоиды серы, селена, теллура [Spallholz, 1982, Yost et al, 1989, Russel et al, 1989], оксиды металлов [Akzo, 1980, Zelikman, Hjerten, 1988], полимеризованные коллоидные красители, [Snowdcn, Hommel, 1991], гидрофобные красители [Gribnau et al., 1985, Anderson, 1988, Rounds, 1988], коллоидное золото [Moeremans et al., 1984, Egger, Bienz, 1987., Roth, Heitz, 1989, Chakraborty at al., 1990, Martin et al., 1990]. Использование данных меток позволяет визуально определять присутствие лиганда как в гомогенных системах анализа (без разделения реагирующих компонентов), так и в многочисленных гетерогенных системах. К первой группе можно отнести агглютинацию довольно крупных частиц (с размерами от 0,2 до нескольких микрометров) или изменение спектральных характеристик (цвета) специфически агглютинирующих коллоидов. Ко второй - системы, основанные на эритроиммуноадсорбции и, более широко, на седиментационно-адсорбционном (иммуно)анализе; дот-, Вестерн-, Саузерн-, Нозерн-блоттинге; иммуно- и гибридофильтрации (flow-through анализах), иммунохроматографии (иммуномиграции) и ряде других процедурных аранжировках, результат которых оценивают по окрашиванию зоны специфического связывания лиганда на непористом или пористом твердофазном носителе. Несмотря на возможность количественной регистрации с использованием простых калориметров, рефрактометров, денситометров, основным преимуществом перечисленных методов является прямое визуальное определение лиганда, что условно выделяет их в группу так называемых безинструментальных методов.
Основными недостатками отмеченных методов являются неудовлетворительная надежность систем анализа и плохая воспроизводимость результатов, обусловленные слабой стабильностью диагностических реагентов, а также относительно низкая чувствительность, связанная с невысокой хромофорностыо используемых в качестве меток частиц.
Первой реальной попыткой решить проблему увеличения чувствительности анализа за счет повышения хромофорности метки можно считать идею применения углеродных материалов [Адамов, Агафонов, 1969]. В середине 60-х годов прошлого столетия авторами была предпринята попытка получения суспензии различных цветных частиц, в том числе и углеродных. Антигены и антитела фиксировались на поверхности частиц методом простой пассивной адсорбции. Полученные таким образом комплексы использовали для определения соответствующих лигандов в реакциях, так называемой, агломерации, по сути - агглютинации. Но описанные работы не нашли своего продолжения и реализации в виде сконструированных систем анализа. Устойчивые в физиолопіческом растворе в течение некоторого времени суспензии частиц быстро деградировали даже при незначительных изменениях условий окружающей среды.
Решение перечисленных проблем, связанное с повышением надежности анализа и стабильности коныогатов, получило свою реализацию в работах, в которых в качестве меток детектирующих реагентов применили частицы коллоидного углерода [Плаксин и др., 1991, 1994, 1997]. Основным моментом этих разработок стала двухэтапная технологическая схема синтеза углеродных конъюгатов, предусматривающая ковалентное связывание аффинных соединений с частицами углерода. Решение коснулось сразу двух аспектов проблемы. Черный цвет углеродных частиц обеспечил максимальную из существующих в природе хромофорность меток, а ковалентный характер связи
аффинных соединений с ними - максимальную прочность структуры диапюстикума.
Важным результатом разработанной технологии явилось получение устойчивой гетерогенной системы, обладающей одновременно свойствами истинного раствора и суспензии, названной авторами «суспензоидом». Частицы углерода размерами 162 нм, обладающие реальной поверхностью и находящиеся в водной фазе, не оседали и не всплывали под действием обычной гравитации.
Однако двухэтапный метод конъюгирования отягощен рядом технологических сложностей. В первую очередь это касается необходимости проведения двух хроматографических процедур: освобождение от избытка сорбируемого полимера и бифункционального реагента на первом этапе, и, как следствие, необходимость концентрирования, за которым вновь следует процедура хроматографического удаления несвязавшихся молекул анти-лиганда. Подобная многоэтапность не только удлиняет описанный способ, но и делает его трудоемким, мало технологичным, затратным. Кроме того, использование в качестве сорбируемого с целью пептизации поверхности углеродных частиц инертного белка - бычьего сывороточного альбумина (БСА) ограничивает количество связываемого аффинного соединения, что, в конечном итоге, накладывает ограничения на уровень чувствительности стереоспецифического анализа, проводимого с использованием таких конъюгатов.
Вместе с тем, сконструированные модели тест-систем на основе полученных реагентов в полной мере продемонстрировали перспективные возможности применения углеродных конъюгатов для создания аналитических систем, пригодных для диагностического тестирования.
Цель настоящей работы - разработка универсальной технологии одноэтапного синтеза диагностических реагентов с использованием углеродных наночастиц и конструирование на ее основе систем безинструментального иммуноанализа.
Основные задачи исследования:
1. Разработать технологию синтеза углеродных диапюстикумов,
предусматривающую одноэтапное конъюгирование аффинных соединений с
наночастицами коллоидного углерода. Изучить стабильность полученных
конъюгатов.
Обосновать универсальную систему диагностического тестирования, основанную на определении иммуноглобулинов класса G с использованием в качестве аффинного соединения белка G стрептококка и оценить ее основные аналитические параметры.
Обосновать системы иммуноаналитического определения различных лигандов в различных процедурных аранжировках.
Разработать методы аналитического тестирования на основе биотин-стрептавидинового взаимодействия.
Научная новизна и теоретическая значимость исследования. Впервые разработана одноэтапная технологическая схема ковалентного конъюгирования аффинных соединений с гидрофобными наночастицами коллоидного углерода, пригодная для промышленного внедрения, позволившая химически инертному углероду стать прочно связанным с биологическими макромолекулами. Компактность и универсальность разработанной технологии, подбор оптимальных параметров синтеза и технологических приемов позволили в условиях использования лабораторной модели технологической установки получить объем диагностических реагентов, обеспечивающий проведение до 300000 определений в год. Технологический процесс можно легко
масштабировать, не опасаясь негативных последствий, которыми, как правило, сопровождаются любые действия, связанные с переносом лабораторной схемы в условия реального производства.
Впервые предложен и апробирован оригинальный и эффективный способ получения углеродных частиц с высокой степенью стандартизации по размерам. Полученные данные дополняют современный биотехнологический арсенал методов принципиально новой технологией, позволяющей получать устойчивые водные суспензии гидрофобных напочастиц, поверхность которых может быть надежно модифицирована практически любыми соединениями, имеющими в своей структуре хотя бы одну свободную аминогруппу. Технология синтеза диапюстикума и способы анализа с использованием синтезируемых углеродных реагентов защищена патентами РФ № 2089212 от 10.09.1997, № 2268471 от 20.01.2006, № 2283131 от 10.10.2006, № 2302424 от 10.07.2007. Кроме того, получены положительные решения о выдаче патентов на изобретения по заявкам № 20051128104/15(031560) от 05.02.2007, № 2007103808/15(004097) от 30.10.2007 и № 2007100406/15(000429) от 09.10.2007.
Использование разработанной технологии позволило получить устойчивые диагностические реагенты, которые характеризуются стабильностью в течение длительного времени, даже в условиях значительного отклонения от оптимальных параметров хранения. Это составило основу надежности тест-систем, конструируемых с использованием углеродных коныогатов.
Привлекательные с позиций надежности и стабильности характеристики полученных реагентов позволили существенно упростить процедурное оформление анализов без ущерба для аналитических параметров готовых тест-систем.
Разработка технологии одноэтапного синтеза углеродных конъюгатов позволила повысить чувствительность определения различных лигандов в разных форматных аранжировках анализа.
Впервые на углеродных конъюгатах продемонстрированы преимущества систем анализа, эксплуатирующих уникальные свойства биотин-стрептавидинового взаимодействия, как в аспекте универсальности детекции, так и в возможности амплифнцнровапного усиления результата аналитического исследования, повышающего чувствительность определения. Практическая значимость исследования.
Разработанные методические подходы в сфере конструирования неинструментальных аналитических систем могут служить основой для создания широкого спектра разнообразных наборов, пригодных для диагностического тестирования. Это могут быть системы анализа для клинико-лабораторных исследований, для экспресс диагностики в кабинете врача по принципу «один пациент - один тест», для скрининговых исследований в чрезвычайных ситуациях, для работы бригад скорой помощи, домашние тесты, полевые - в условиях экспедиционных отрядов и армейских подразделений. Быстрые и надежные, а вместе с тем, чрезвычайно простые в использовании, тесты могут найти свое применение в пищевой промышленности, в криминалистике, в ветеринарии и растениеводстве для оснащения не только контрольных лабораторий, но и фермерских хозяйств и т.д. В условиях исследовательских лабораторий наличие подобных диагностических инструментов может обеспечить возможность самостоятельного конструирования актуальных тест-систем. Например, достаточно иметь конъюгат белка G с углеродом, чтобы при необходимости сконструировать систему обнаружения и идентификации любых иммуноглобулинов. Это бывает весьма актуально там, где проводятся работы, связанные с выделением и
очисткой белковых соединений из различных биологических материалов. То же касается и стрсптавидинового конъюгата, как универсального детектирующего реагента, способного обнаружить любой лиганд при одном лишь условии -наличии соответствующего биотинилированного анти-лиганда.
Внедрение в практику. Результаты работы используются в практической деятельности лаборатории экологической иммунологии Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН при оценке иммуноглобулиновой контаминации препаратов выделяемых белков фетоплацентарного комплекса, при оценке уровня сероконверсни в период иммунизации экспериментальных животных, в экспериментально-производственной работе филиала ФГУП НПО «Микроген» «Пермский НПО «БИОМЕД», в работе Института новых медицинских технологий (г.Краснокамск), в учебном процессе на биологическом факультете Пермского госуниверситета.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Разработанная технология одноэтапного конъюгирования различных
аффинных соединений с частицами коллоидного углерода позволяет получать
детектирующие реагенты прочной ковалентной структуры за счет
единовременного процесса пептизации, активации и связывания всех
компонентов диагностикума. Получаемые конъюгаты устойчивы при хранении
в течение длительного времени даже в условиях отклонения температуры
окружающей среды от оптимальной.
2. Получение стабильных конъюгатов на основе углеродных наночастиц дает
возможность конструировать широкий спектр систем анализа, как с высокой
степенью универсальности, так и с узко направленными задачами определения
конкретных лигандов, отвечающих основным требованиям, предъявляемым к
диагностическим системам: высокие чувствительность и специфичность,
воспроизводимость, надежность, простота, оперативность.
3. Использование в конструкции аналитических систем уникальных свойств биотин-стрептавидинового взаимодействия приводит к существенному усилению чувствительности определения при создании широкого спектра диагностических тест-систем на основе наночастиц углерода.
Связь работы с крупными программами. Работа проводилась в течение 1991-2007 гг. в соответствии с планом НИР ИЭГМ УрО РАН (номер госрегистрации темы НИР 01.9.00.017989), а также в рамках федеральной программы «Старт 05».
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на LXII сессии общего собрания Академии медицинских наук СССР, Москва, 1991, на Международном симпозиуме «Проблемы загрязнения окружающей среды, токсикология», Пермь-Москва, 1991, на Всероссийской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии», Пермь, 1994, на Международном симпозиуме «Загрязнение окружающей среды, токсикология и эпидемиология», Москва-Пермь, 1993, на Международной конференции по иммунореабилитации, Сочи, 1994, на Международном симпозиуме ICACI XV-EAACI'94, Стокгольм, Швеция, 1994, на Международной конференции по нейроиммунным взаимодействиям и загрязнению окружающей среды (ICONE'95), Санкт-Петербург, 1995, на ХШ-м Ленсфилдском международном симпозиуме по стрептококку и стрептококковым заболеваниям, Париж, Франция, 1996, на Выставке достижений Российской биотехнологии, Берлин, Германия, 1996, на 4-м Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарства», Москва, 1997, на Международной конференции AAAAI/AAI/CIS, Сан-Франциско, США, 1997, на Конгрессе FASEB, США, 1998, на Международной конференции по загрязнению окружающей среды (1СЕР'98), Москва, 1998, на Ежегодном собрании профессиональных ученых, Экспериментальная биология 98, Сан-
Франциско, Калифорния, США, 1998, на Международном семинаре «Научно-
технический потенциал Западного Урала в конверсии военно-промышленного
комплекса», ISTC, Perm, Russia, 2001, на I-II конференциях иммунологов Урала,
Екатеринбург, 2001, Пермь, 2002, на Всероссийском съезде иммунологов
России, Екатеринбург, Россия, 2004, на IX Всероссийском научном Форуме с
международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в
Санкт-Петербурге. Молекулярные основы иммунорегуляции,
иммунодиагностики и иммунотерапии», 2005, на Всероссийском научном симпозиуме «Цитокины, стволовая клетка, иммунитет», Новосибирск, 2005, на IV, V и VI конференциях иммунологов Урала, Уфа, 2005, Оренбург, 2006, Ижевск, 2007, на Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия», Курск, Россия, 2006, на 2-й Республиканской конференции «Иммунология репродукции: теоретические и клинические аспекты», Сочи, 2007.
Публикации. Материалы диссертации обобщены в 64 печатных работах, из них: 13 статей, в том числе 5 статей в журналах по перечню ВАК Минобрнауки РФ, рекомендованных для докторских диссертаций, 4 патента РФ на изобретение и 3 положительных решения о выдаче патентов РФ на изобретение.
Объем и структура работы. Работа изложена на 217 страницах, содержит 8 таблиц и 36 рисунков, состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов, 4 глав собственных исследований, обсуждения и выводов. Список литературы включает 419 источников, в том числе: 50 на русском и 369 на английском языках.
Кеворкову.
Автор выражает искреннюю благодарность всем участникам работы, чей вклад адекватно отражен в совместных публикациях. Глубокую благодарность и безграничную признательность автор выражает своему Учителю -профессору, заслуженному деятелю науки РФ, д.м.н. Николаю Николаевичу
Особую признательность и благодарность автор выражает своему первому руководителю, автору идеи и инициатору темы углеродных конъюгатов, к.м.н. Дмитрию Юрьевичу Плаксину, без которого бы эта работа
не состоялась.
19 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Системы детекции в вариантах упрощенного иммуноанализа
Анализ развития методов иммунологических исследований был бы не полон без освещения другого пути развития аналитических исследований, а именно, - инструментально независимых методов. Многочисленные агглютинационные тесты, в которых системой индикации служили эритроциты, явились основой для развития целого направления в аналитической иммунохимии, основным моментом которого является детекция стереоспецифических взаимодействий диапюстикумами, индикаторным элементом которых являются либо продукты цветных реакций, либо заведомо окрашенные элементы, визуализируемые невооруженным глазом.
Как уже отмечалось, системы упрощенного диагностического тестирования занимают весьма существенное место в общем объеме затрат на выпуск иммунодиапюстических систем. Разработка способов анализа в варианте «in site testing» и «in home testing» в настоящее время является одним из приоритетных направлений развития иммуноаналитических методов. Все они объединены одним общим признаком, а именно: для их осуществления не требуется ни инструментов, ни какой-либо регистрирующей аппаратуры. Эти методы предназначены для использования в практике аналитических исследований в биологии, медицине, сельском хозяйстве, криминологии, причем, не только в специализированных центрах, но и в небольших клинических лабораториях, врачебных кабинетах, домашних и полевых условиях. Развитие этих методов стимулируется, с одной стороны, - желанием медиков проводить быструю диагностику состояния здоровья пациента в его присутствии, с другой стороны, - желанием людей иметь возможность самоконтроля объективных параметров собственного здоровья в домашних условиях. Постоянно усиливается тенденция к осознанию важности проблемы здоровья, особенно в тех случаях, когда потенциальные заболевания связаны с образом жизни (ожирение, наркомания, алкоголизм, атеросклероз). Экономические тенденции также способствуют развитию производства аналитических систем для самодиагностики. Например, желание многих работающих женщин повременить с рождением ребенка, несомненно, стимулирует интерес к тестам для предсказания овуляции и раннего выявления беременности [Егоров, 1991, Lindstedt et aU 1982, Wang, Gemzell, 1982, Nielsen et al, 2001]. Кроме того, быстрые, альтернативные "плюс/минус", безинструментальные системы диагностики, в идеале, должны быть в арсенале клиник и бригад скорой помощи для случаев экстренного (главным образом, - прямого) переливания крови, особенно в условиях острых клинических и массовых эпидемических ситуаций.
Немалое значение в последнее время приобретает разработка методов иммуноаналитического тестирования, применяемых в ветеринарии и пищевой промышленности, причем, предназначенных не только для использования в специализированных ветлечебницах и лабораториях, но и в полевых условиях индивидуальных фермерских хозяйств. Здесь оказываются полезными те же технические новшества, что и применяемые в днапюстнке заболеваний человека [Anderton et aL, 1986, Jeffers et aL, 1991]. В основном выделяют три сферы приложения иммунодиапюстики в ветеринарии и пищевой промышленности: 1) оценка фертильності! (определение уровня прогестерона и сульфат эстрона в молоке коров [Laing, Heap, 1971, Sauer, Foulkes, 1981, Davies et aL, 1987, Saba, Hattcrslay, 1981., Hamon et aL, 1981]); 2) диапюстика инфекционных заболеваний (определение парвовирусной инфекции, возбудителей лейкоза и энтерита [Shen, 1979, Al-Yousif et aL, 2001, 2002]); 3) обнаружение токсинов и других вредных веществ в пищевых продуктах [Heathcote, Hillert 1978, Ministry of Agriculture U.K, 1980, Watanabe et aL, 2002, Zhou et aL, 2004, Zhang et aL, 2006].
История развития методов упрощенного иммуноанализа, процедура выполнения которых не отягощена зависимостью от аппаратного обеспечения, фактически повторяет тенденции совершенствования методов инструментально аранжированных иммуноаналитических систем. С одной стороны, - это модификация твердофазного реагента (иммуносорбента) либо с целью удельного увеличения количества сорбированного анти-лиганда, либо использование в качестве анти-лиганда соединения с более привлекательными связывающими свойствами, с другой, - совершенствование метода детекции, которое возможно либо за счет улучшения свойств аффинного соединения, связанного с меткой, либо за счет усиления её репортерных свойств, либо за счет увеличения количества метки, связываемой при детекции.
Очевидно, что применение радиоактивных изотопов в безинстру-ментальных методах, предназначенных для домашнего использования, невозможно как вследствие необходимости применения специальных методов репістрации активности, так и из-за прямой опасности радиоактивного загрязнения. В первой части то же можно отнести и к методам флуоресцентной, хемилюминесцентной детекции. Однако иммуноферментные системы детекции в рамках внелабораторного анализа нашли свое применение. Несмотря на то, что встречаются работы, в которых для детекции ферментной активности предлагается применение субстратов, образующих растворимые соединения [Davies et al, 1987], основное внимание все-таки уделяется субстратным системам, позволяющим получать нерастворимые окрашенные продукты. В качестве ферментных меток в таких системах использовали пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу и глюкозооксидазу.
Методические и технологические подходы к получению и оценке свойств частиц коллоидного углерода
Основу углеродного материала получали несколькими способами. 1. Таблетки коммерческого активированного угля (Tabulcttae Carbonis activati) производства Ирбитского химфармзавода, (Россия) тщательно гомогенизировали при помощи ножевого и пестикового гомогенизаторов, после чего полученный препарат отмывали многократной промывкой диметилформамидом, сушили под вакуумом и вновь гомогенизировали. 2. Коммерческий препарат «Карбоктин» производства ЗАО «Медисорб» (Россия) в виде мелкодисперсного порошка многократно отмывали диметилформамидом до отсутствия следов окрашивания в растворителе, сушили под вакуумом и гомогенизировали. 3. Учитывая тот факт, что при сгорании непредельных углеводородов в условиях ограниченного количества кислорода (на воздухе, например) выделяется большое количество сажи, была отработана методика получения аморфного углерода (в виде сажи) путем конденсирования из пламени горящего толуола на стеклянной или металлической поверхности. Полученный таким образом углерод при суспендировапии его в органических растворителях в ходе оценки качественных характеристик (цветность) давал очень высокий уровень фона, ввиду существенного загрязнения недоокисленными продуктами, образующимися при сжигании толуола. В связи с этим, была разработана технология очистки получаемого углерода от недоокисленных продуктов. Углерод суспендировали в 10-ти кратном по весу количестве толуола и кипятили в колбе с обратным холодильником в течение 30 минут, остужали, отфильтровывали на фильтре Шотта. Далее процедуру повторяли 5 раз без нагревания до полного исчезновения окраски в растворителе, после чего отфильтрованный углерод пятикратно отмывали при комнатной температуре диметилформамидом и гексаном. Подобная процедура приводила к полному обесцвечиванию протекающих через очищаемый углерод растворителей. Описанная схема очистки и последовательности использования указанных растворителей была наиболее эффективной по сравнению с другими схемами. Конечный продукт высушивали под вакуумом для освобождения от следов связанных органических растворителей и дополнительно прокаливали до постоянного веса в сухожаровом шкафу при 200-300С в течение 12-24 часов. Получаемый подобным способом чистый аморфный углерод представлял собой матово-черный лиофильный порошок, нерастворимый в доступных известных растворителях: толуол, гептан, гексан, ацетон, спирт, диметилформамид, диметил сульфоксид.
Таким же образом получали аморфный углерод при сжигании бензола и ксилола. Из пламени бензола конденсируется большее количество углерода по сравнению с толуолом, но в процессе очистки не удается полностью освободиться от примесей недоокисленных продуктов, даже при введении более широкого по сравнению с толуолом спектра органических растворителей и увеличении температуры обработки. В варианте с ксилолом препарат легко очищается от контаминации, но выход продукта существенно снижается. «Выход продукта» в данном случае - есть количество аморфного углерода, получаемого от сжигания определенного количества углеводорода.
Выбор материала, и, следовательно, источника получения частиц углерода осуществляли, учитывая сразу несколько параметров. Один из них, -взаимодействие получаемого материала с различными растворителями. Для дальнейшей работы, отбирали угольные порошки абсолютно нерастворимые в воде и водных растворах солей. С этой целью проводили серию экспериментов, в ходе которых наблюдали за поведением углеродного материала, полученного из различных источников, при контакте с водой, раствором хлорида натрия в концентрации 0,15 М, ЗФРТ, КББ, 0,1 М Трис-глициновым буфером (рН=2,8). Все исследуемые.материалы продемонстрировали абсолютную устойчивость к солюбилизации в указанных растворах.
Для качественного сравнения полученных образцов углеродных материалов готовили их 10% суспензии в гексане. Суспензии раститровывали с шагом 2 в планшете для иммунологических реакций (Costar, Великобритания) и измеряли величину светопропускания суспензий на планшетном фотометре Anthos Labtec НТЗ (США) при длине волны - 450 нм (рис.1). Оптические свойства реагентов оценивали по последней отличной от фона точке, согласно показаниям прибора.
Кроме описанной выше процедуры оптической оценки углеродных суспензий различных материалов, провели сравнительный анализ их визуальных свойств в варианте прямого дот-анализа на пористых мембранах. Для этого из суспензии водных растворов полученных материалов, взятых в равных концентрациях, делали 2-кратные разведения в фосфатном буферном растворе. По пять микролитров каждого разведения наносили на поверхность белой капроновой мембраны с размером пор 0,45 мкм.
Способ защиты и стабилизации твердофазных реагентов на основе пористых материалов
В работе использовали полоски нитроцеллюлозы (Bio-Rad, США) с размерами пор 0,45 мкм, на которые наносили в виде пятен IgG человека, выполняющие роль лигандов, из разведений кратных двум в 0,15 М фосфатном буферном растворе (рН=7,25), начиная с концентрации 1 мкг/мл в объеме 3 мкл. После полного высушивания полученных подобным образом ТР, их помещали в раствор сахарозы с концентрацией 30% в забуференный физраствор, содержащий 0,05% Твин 20 и 1% казеина (ЗФРТ-К). Присутствие в растворе казеина решало принципиально важную задачу блокирования нитроцеллюлозной мембраны от неспецифического связывания в дальнейшем. Инкубацию осуществляли при комнатной температуре на шейкере с качающейся платформой в течение 60 минут. Обработанные ТР извлекали из раствора сахарозы, сушили при 37С и помещали на хранение при температуре +4С и +22С в пластиковых пакетах.
Качество сохранности твердофазных реагентов проверяли через 3 месяца. Для этого образцы, хранимые при различных температурных условиях ТР, помещали в забуференный физраствор, содержащий 0,05% Твин 20 (ЗФРТ). Обработку вели на шейкере при комнатной температуре в течение 3-х минут с трехкратной сменой буфера. Затем, отмытые ТР помещали для визуализации на 15 минут в конъюгат белок G-углерод. После промывки ФБРТ наблюдали результаты анализа в местах сорбции лигандов. Параллельно осуществляли анализ свежеприготовленных ТР, не прошедших стадию обработки сахарозой и хранения. Аналогичные исследования проводили через 6, 9, 12 и 18 месяцев хранения.
Результатом проведения сравнительных экспериментов явилось определение 0,06 мкг/мл IgG человека в виде последней в ряду разведений визуализируемой точки во всех без исключения случаях.
В работе использовали планшеты для серийных разведений фирмы Linbro (США), на плоское дно лунок которых сорбировали в качестве лигандов IgG человека, из разведений кратных двум в 0,01 М карбонатно-бикарбонатном буферном растворе рН=9,6, начиная с концентрации 0,1 мг/мл каплями объемом 5 мкл. Сорбцию осуществляли во влажной камере при температуре 37С в течение 30 минут. Капли аспирировали, а в лунки после полного высушивания вносили раствор сахарозы с концентрацией 30% в ЗФРТ. Казеин не использовали ввиду того, что применяемый в качестве твердой фазы полистирол не давал фона за счет неспецифического связывания компонентов анализа и, в первую очередь, углеродного конъюгата. Инкубацию осуществляли при комнатной температуре на шейкере с качающейся платформой в течение 60 минут. Обработанные ТР освобождали от раствора сахарозы, сушили при 37С и помещали на хранение при температуре +4С и +22С в пластиковых пакетах.
Качество сохранности твердофазных реагентов проверяли через 3 месяца. Для этого в лунки, хранимых при различных температурных условиях ТР, вносили стандартный фосфатный буферный раствор, содержащий 0,05% Твин 20 (ФБРТ). Обработку вели на шейкере при комнатной температуре в течение 3-х минут с трехкратной сменой буфера. После чего в лунки отмытых ТР вносили для визуализации конъюгат белок G-углерод на 15 минут. После промывки ФБРТ наблюдали результаты анализа в виде черных пятен в местах сорбции лигандов. Параллельно осуществляли анализ свежеприготовленных ТР, не прошедших стадию обработки сахарозой и хранения. Аналогичные исследования проводили через 6, 9, 12 и 18 месяцев хранения.
Результатом проведения сравнительных экспериментов явилось определение 0,38 мкг/мл IgG человека в виде последней в ряду разведений визуализируемой точки во всех без исключения случаях.
Полученные результаты однозначно свидетельствуют о том, что использование предлагаемого способа эффективно позволяет защищать сенсибилизированные поверхности твердофазных реагентов. Тот факт, что хранение ТР в течение 18 месяцев при комнатной температуре (+22С) не влияет на качество анализа, позволяет определенно говорить о, как минимум, трехгодичном сроке успешной сохранности его при +4С. Ни один из существующих тест-наборов из категории твердофазных аналитических систем не обладает сроком хранения, превышающим 12 месяцев.
Отработанные методы получения твердофазных реагентов были использованы в дальнейшей работе при конструировании различных аналитических тест-систем. В начале 90-х годов были клонированы и секвенированы гены, кодирующие рецепторы стрептококков групп А, В, С и G, обладающих способностью связывать человеческие иммуноглобулины через Fc-фрагмент молекулы. Методами генетической инженерии был сконструирован штамм E.coli - суперпродуцент этих рецепторов. Оказалось, что один из них, названный G белком, способен связывать человеческий IgG всех подклассов, а2-макроглобулин и альбумин. Позднее был получен рекомбинантный G белок, специфичный только к IgG, причем не только человеческому, но и к IgG многих видов млекопитающих, вовлеченных так или иначе в научно-исследовательскую сферу деятельности человека [Гупалова Т.В. и др., 1996]. Это послужило основанием для создания ряда аффинных сорбентов для специфического выделения и очистки иммуноглобулинов класса G, что нашло свое применение в очистке антител, как одной из стадий реализации гибридомной технологии. Однако было бы совершенно неоправданно использовать уникальные свойства белка G лишь в препаративной работе. Не менее важно адаптировать их для целей лабораторной диагностики. Здесь необходимо подчеркнуть, что для самого G белка не играет никакой роли ни видовая принадлежность, ни способ получения, ни источник определяемых иммуноглобулинов. Он «видит» все, что оказывается в доступной для него близости, а углеродная метка способна визуализировать этот феномен.
Иммунохроматографическое определение ХГЧ
Иммунохроматографическое определение ХГЧ проводили, используя в качестве детектирующего реагента конъюгат углеродных частиц с моноклональными антителами к р-субъединице гормона. На твердой фазе, в качестве которой использовали нитроцеллюлозные пластинки размером 20x80 мм с диаметром пор 5,0 мкм, сорбировали в виде поперечных линий моноклональные антитела к а-субъединице гормона из раствора с концентрацией 1,0 мг/мл ЗФР и сам гормон в качестве внутреннего положительного контроля в концентрации 50000 МЕ/л. После полного высыхания нанесенных анти-лигандов полученный иммуносорбент блокировали в растворе ЗФРТ-К в течение 30 минут и подсушивали при 37С, промывали ЗФРТ и вновь высушивали. Подготовленные подобным образом иммуносорбенты наклеивали на прозрачный поливинилхлоридный толстый скотч. Верхнюю границу сенсибилизированной мембраны при помощи того же скотча плотно соединяли с впитывающим элементом (полоска толстой крупнопористой целлюлозной фильтровальной бумаги размером 40x80 мм), нижнюю - с таким же элементом, но размерами 10x80 мм, в качестве нижнего контактного элемента. Полученную конструкцию нарезали при помощи фоторезака на полоски шириной 4 мм.
За счет сил капиллярного всасывания раствор, содержащий гормон вместе с углеродным диагностикумом, поднимался по полоскам со скоростью около 1,5 см/мин. Через 2-3 минуты результаты анализа определяли визуально по наличию (положительный результат) или отсутствию (отрицательный результат) связывания суспензоидного конъюгата в зоне иммобилизации первых антител (черные полосы на светло-сером фоне). Приведенные результаты иммунохроматографического определения ХГЧ демонстрируют высокий уровень чувствительности за счет использования в качестве детектирующего реагента частиц коллоидного углерода, конъюгированных с антителами к ХГЧ. Об этом свидетельствует окрашивание в зоне иммобилизации первых антител к ХГЧ при исследовании пробы, содержащей гормон в концентрации 10 МЕ/л. О высокой специфичности анализа говорит отсутствие окрашивания на поверхности иммуносорбента в условиях отрицательного контроля. Сам по себе результат определения 10 МЕ/л говорит о чрезвычайно привлекательных аналитических характеристиках разработанной системы диагностики. Ни одна из представленных на нашем рынке систем определения ХГЧ, выполненных в аранжировке иммунохроматографии, не обладает чувствительностью выше 20-25 МЕ/л. Автором не ставилась задача исследовать аналитические параметры реализуемых на отечественном рынке систем экспрессной диагностики беременности. Выборка из аптечной сети была случайной.
В конце 80-х годов американская фирма Abbot Laboratories выпустила на рынок неинструменталыгую тест-систему для диагностики беременности, основанную на определении ХГЧ. Названная в народе «мыльница» за внешнее сходство, она недолго просуществовала. Ферментная детекция иммунного комплекса на твердой фазе и громоздкое процедурное оформление не позволили ей осуществить диагностическую «революцию» в тестировании беременности, но прогрессивность идеи не пропала даром. Практически параллельно появились иммунофильтрационные системы определения стрептококка группы А, основанные на применении ферментных конъюгатов. Одна из них, той же фирмы Abbot, продемонстрировав чувствительность от 62% до 92% н специфичность от 95,8% до 99,7% [Anhalt J.P. et al, 1992, Bourbeou P.P. et al, 1993, Heiter B.J. et al, 1993, Laubscher B. et al, 1995] не смогла удовлетворить требование, связанное с надежностью системы анализа. Другая, Confidot Plus фирмы Baker Diagnostics (США), просуществовала очень короткое время в виде рекламного продукта. Декларированные изготовителем чувствительность и специфичность равные 100% [Direction for use of Confidot Plus GroupA Strep Identification Test (Cat.№ 49-023-026-009), 1986], no результатам внутреннего тестирования на чистых культурах никоим образом не вдохновили пользователей на применение разработанных систем. Позднее фирма Clonatec (Франция) разработала достаточно эффективную иммуноферментную тест-систему в аранжировке иммунофильтрации, правда, для ВИЧ-1,2 диагностики (рис.19), но и она не нашла широкого применения. Основные проблемы оказались связанными с высоким уровнем неспецифического фона за счет несовершенства иммуносорбента и нестойкости конъюгата.
