Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 11
1.1 Влияние физических упражнений на экспрессию генов раннего ответа 13
1.2 Роль рибонуклеопротеидных комплексов в экспрессии генов 22
1.3 Механизм сплайсинга 26
1.4 Сборка сплайсосомы 27
1.5 Регуляция сплайсинга 31
1.6 Заболевания, связанные с нарушениями сплайсинга 35
1.7 Нарушения альтернативного сплайсинга при миотонической дистрофии 43
Глава II. Организация, материалы и методы исследования 50
I этап 50
II этап 52
III этап 59
IV этап 63
Уэтап 63
Буферы 64
Глава III. Изменение экспрессии мРНК сплайсосомальных белков под влиянием фактора физической нагрузки 66
3.1 Нагрузочное тестирование 66
3.2 Анализ изменения экспрессии мРНК сплайсосомальных белков 68
3.3 Схема участия выявленных генов в инициации сплайсинга 74
Глава IV. Изменение профиля фосфорилирования сплайсосомальных белков в ответ на физическую нагрузку 78
4.1 Предсказание антител 79
4.2 Очистка и проверка антител 87
4.3 Выделение лейкоцитов 95
4.4 Анализ соотношения фосфорилированных /нефосфорилированных форм сплайсосомальных белков 98
Глава V. Модель нарушения альтернативного сплайсинга экзонагена инсулинового рецептора при миотонической дистрофии 101
Глава VI. Заключение 107
Выводы ПО
Практические рекомендации 111
Список литературы
- Роль рибонуклеопротеидных комплексов в экспрессии генов
- Заболевания, связанные с нарушениями сплайсинга
- Анализ изменения экспрессии мРНК сплайсосомальных белков
- Анализ соотношения фосфорилированных /нефосфорилированных форм сплайсосомальных белков
Введение к работе
Одной из важнейших задач современной спортивной медицины является изучение адаптации организма к физическим нагрузкам. Физическая активность является комплексным стрессорным фактором и вызывает широкий спектр биофизических и биохимических процессов, таких как увеличение концентрации свободных радикалов, локальную гипертермию, изменение электролитного баланса, повышение концентрации свободных жирных кислот и лактата, изменение уровня гормонов, цитокинов и катехоламинов (Radom-Aizik S., 2008).
Главную роль в активации фенотипической адаптации организма спортсмена на физические нагрузки играют, так называемые, гены раннего ответа (ГРО), основной характеристикой которых является быстрое, кратковременное изменение транскрипции в ответ на стимуляцию. Было показано, что экспрессия ГРО - ключевой фактор, запускающий процессы белкового неосинтеза и последующую экспрессию генов позднего ответа (Buttner Р., 2007), Сахаров Д. 2009).
Известно, что большинство эукариотических генов транскрибируются в виде пре-мРНК, которая затем сплайсируется в мРНК. Сплайсинг — это двухстадийный процесс, в ходе которого путем последовательных трансэтерефикационных реакций некодирующие последовательности — интроны, вырезаются, а кодирующие — экзоны, соединяются вместе. Сплайсосома представляет собой сложный макромолекулярный комплекс, в состав которого на разных этапах входят 5 малых ядерных РНК (мяРНК), около 70 белков малых ядерных рибонуклеопротеидных комплексов
(мяРНП) и более 100 прочих белков. Важным механизмом регуляции всех взаимодействий внутри сплайсосомы является фосфорилирование (Wahl М.С., 2009).
Значимость пре-мРНК сплайсинга была недавно подтверждена результатами исследований по секвенированию генома человека, которые показали, что более 90% генов сплайсируются, из них 80% -альтернативно, образуя несколько сплайсформ, что и объясняет то, как при таком сравнительно небольшом числе генов формируется такое белковое разнообразие.
В ходе последних изучений было обнаружено, что более 50% заболеваний, связанных с мутациями, вызываются нарушениями альтернативного сплайсинга, классические примеры - это спинная мышечная атрофия, таупатия, миотоническая дистрофия и рак (Orengo J.P., 2008).
Однако, несмотря на глобальную вовлеченность сплайсинга в процессы жизнедеятельности организма, исследования влияния интенсивных физических нагрузок на функционирование и регуляцию сплайсинга до сих пор не были проведены. Лучшее понимание приспособительных механизмов организма, связанных с ответом на физическую нагрузку может обеспечить основу для предотвращения перетренированности, синдрома хронической усталости, для варьирования тренировочного режима в соответствии с индивидуальными особенностями организма спортсмена.
Гипотеза:
Предполагается, что интенсивные физические нагрузки приводят к запуску процессов срочной адаптации организма спортсмена —
происходит увеличение экспрессии генов раннего ответа. Как следствие, возрастает активность сплайсинга: меняется профиль экспрессии генов сплайсосомальных белков и происходит изменение регуляции сплайсинга. Определение экспрессии мРНК и профиля фосфорилирования сплайсосомальных белков позволит оценивать эффекты физических нагрузок на генном уровне.
Цель исследования:
Оценка влияния физических нагрузок максимальной аэробной мощности на изменение экспрессии мРНК генов регуляторов сплайсинга, а также на возможные изменения профиля фосфорилирования сплайсосомальных белков в процессах срочной адаптации.
Задачи исследования:
Исследовать изменение экспрессии мРНК генов раннего ответа у высококвалифицированных спортсменов в ответ на работу максимальной аэробной мощности;
Изучить влияние работы максимальной аэробной мощности на экспрессию мРНК генов регуляторов сплайсинга, белков мяРНП и сплайсосомальных комплексов в лейкоцитах крови спортсменов;
Разработать методику предсказания потенциальных эпитопов в сплайсосомальных белках, получить поликлональные антитела против предсказанных пептидов;
4. Проанализировать изменения в фосфорилировании
сплайсосомального белка SF3M55 у спортсменов до и после
нагрузочного тестирования.
Объект исследования:
Молекулярно-биологические механизмы адаптации
высококвалифицированных спортсменов к работе максимальной аэробной мощности.
Предмет исследования:
Комплекс структурных и регуляторных белков сплайсосомы человека и экспрессия их мРНК при физических нагрузках.
Научная новизна:
Впервые у спортсменов высшей квалификации, до и после работы максимальной аэробной мощности было проведено исследование экспрессии мРНК генов белков, вовлеченных в сплайсинг. Выявлены потенциальные регуляторы процессов адаптации сплайсосомы при физических нагрузках, которые принимают участие в начальной стадии сборки сплайсосомы, при распознавании интронов и при переходе от пре-каталитической к активированной форме.
Впервые показано, что ускорение сборки сплайсосомы и/или переход к альтернативным сплайс-сайтам являются основными путями раннего приспособления организма к физическим нагрузкам.
Разработан новый алгоритм предсказания линейных В-клеточных эпитопов, основанный на частоте встречаемости аминокислотных пар, не уступающий описанным в литературе методам.
Впервые произведен анализ изменения в профиле фосфорилирования сплайсосомы в зависимости от физических нагрузок. Было показано, что в ответ на работу максимальной мощности происходит резкое увеличение соотношения
фосфорилированных и нефосфорилированных форм белка SF3M55, являющегося маркером каталитически активной сплайсосомы.
Теоретическая значимость:
Данная работа направлена на изучение фундаментальных основ процессов клеточной жизнедеятельности, функционирования первичных механизмов приспособления клеток человека к физиологическому стрессу, вызванному кратковременными высокоинтенсивными физическими нагрузками.
В условиях нагрузочного тестирования выявлены потенциально ключевые факторы регуляции инициации сплайсинга. Предложена модель, отражающая их участие в адаптации сплайсосомы к стрессу, вызванному физическими нагрузками.
Разработанные методики анализа фосфорилирования сплайсосомальных белков позволят понять механизмы воздействия физического стресса на процессы сплайсирования, разработать системы компенсаций его негативных последствий на самом раннем этапе их проявления, что в свою очередь востребовано в рамках современной восстановительной медицины.
Практическая значимость:
Практическая значимость работы заключается в разработке высокочувствительного метода оценки развития клеточного стресса в результате нагрузки высокой интенсивности. Метод основан на измерении соотношения фосфорилированных и нефосфорилированных форм белка SF3M55 в экстракте лейкоцитов крови спортсменов до и после нагрузочного тестирования.
Разработанный метод предсказания линейных эпитопов может быть использован в дальнейшем для разработки тест-систем определения биомаркеров утомления и физиологического стресса.
Результаты исследования внедрены в работу кафедры спортивной медицины ФГУ РГУФКСиТ и кафедры физического воспитания и спорта МГУ имени М.В. Ломоносова, что подтверждено актами внедрения.
Основные положения, выносимые на защиту:
Работа максимальной аэробной мощности приводит к увеличению экспрессии иРНК генов сплайсосомальных белков в лейкоцитах крови у спортсменов высшей квалификации;
В условиях высокоинтенсивных физических нагрузок максимальное изменение экспрессии происходит у генов регуляторов инициаторной стадии сплайсинга;
После нагрузочного тестирования у спортсменов соотношение фосфорилированных и нефосфорилированных форм белка SF3bl55 в крови увеличивается, что может служить высокочуствительным ранним маркером стресса.
Структура и объем диссертации:
Диссертация изложена на 128 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, 3 глав собственных исследований, итогового заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Последний включает 120 источников. Диссертация иллюстрирована 24 рисунками и 9 таблицами.
Роль рибонуклеопротеидных комплексов в экспрессии генов
Несмотря на значительные различия в химических свойствах, нуклеиновые кислоты и белки выполняют схожие функциональные роли. Например, выступая в качестве биологических катализаторов или разнообразных оснований для связывания. РНК-белковая кооперация служит фундаментом для множества ферментативных процессов, необходимыми для нормального клеточного развития.
Основную роль рибонуклеопротеидные комплексы (РНП) играют в экспрессии генов и ее регуляции. Жизненный цикл типичной эукариотической мРНК состоит из следующих этапов. Синтез мРНК происходит в форме прекурсора (пре-мРНК) во время транскрипции в ядре. Там же она подвергается ряду модификации, прежде чем экспортируется в цитоплазму, где служит матрицей для белового синтеза и где она впоследствии деградирует. Всегда без исключений
РНК существует в виде РНП, чей белковый состав меняется на каждом этапе жизни РНК. Например, разнообразные гетерогенные ядерные РНП (гяРНП) белки ко-транскрипционно связываются с РНК, часть этих белков затем уходит, другие связываются на следующих этапах мРНК процессинга, ядерного экспорта и трансляции. Конкретный белковый репертуар представленный на каждом этапе жизненного цикла и расположение белков на пре-мРНК или мРНК определяют судьбу каждой отдельной молекулы РНК. U7, соответственно). Малые ядрошковые РНП и малые РНП в составе телец Кахаля являются посредниками в созревании РНК компонентов РНП, таких как рибосомальные РНК (транскрибируемые РНК полимеразой I) и мяРНП, соответственно. Теломераза востанавливает концевые последовательности хромосом, поддерживая генетическую стабильность.
РНП управляют множеством клеточных процессов связанных с пре-мРНК или мРНК. Уридин-богатые малые ядерные РНК служат в качестве основных структурных компонентов сплайсосомы, большого РНП комплекса, осуществляющего сплайсинг. U7 мяРНП направляют процессинг 3 конца безинтронных гистон-кодирующих пре-мРНК. Белковый синтез управляется другим большим РНП комплексом -рибосомой, которая направляет трансляцию мРНК с помощью координированного взаимодействия своих большой и малой субъединиц. Затем рибосома взаимодействует с SRP РНП, ответственной за транслокацию синтезирующихся белков в эндоплазматический ретикулум. Белковый биосинтез также может регулироваться с помощью микроРНП, содержащих маленькие некодирующие РНК, которые обычно узнают З1 нетранслируемую область целевой мРНК и в зависимости от степени комплиментарности или подавляют трансляцию, или деградируют ее.
РНК-белковые комплексы также участвуют в биогенезе РНК, включая РНК компоненты РНП комплексов, в частности малые ядрышковые РНП метилируют 2 -гидроксильные группы и превращают уридиновые остатки в псевдоуридиновые в рибосомальных РНК. Такие же модификации в мяРНК, осуществялют РНП входящие в тельца Кахаля. Созревание транспортных РНК, необходимых для белковой трансляции, требует участия RNase Р РНП, который формирует зрелый конец тРНК. Таким образом, РНП играют большую роль в жизни клетки, и даже поддержание стабильности генома и регуляция состояния хроматина требует участия РНП, таких как теломераза и RITS комплекса (Bergkessel М., 2009; Carthew R.W., 2009; Voinnet О., 2009; Wahl М.С., 2009).
Рибосома, во-многих отношениях, является типичным представителем РЬШ комплексов. Концепция рибосомы как макромолекулярной машины наиболее очевидна на стадии элонгации, когда аминокислоты добавляются к растущей цепи в ходе последовательной полимеризационой реакции. Следует отметить, что за исключением ассоциации/диссоциации факторов элонгации состав рибосомы остается постоянным, также декодирующий и пептидил-трансферазные центры уже полностью собраны в малой и большой рибосомальных субъединицах, соответственно (Korostelev А., 2008; Steitz Т.А., 2008). Однако, в случае сплайсинга, процесса в ходе которого из пре-мРНК вырезаются некодирующие последовательности (интроны), а кодирующие (экзоны) соединяются в мРНК, наблюдаются значительные отличия в функционировании РНП.
Заболевания, связанные с нарушениями сплайсинга
Большое разнообразие в путях регуляции ведет к увеличению альтернативных путей сплайсинга. Развитый механизм альтернативного сплайсинга позволяет клетке гибко подстраивать свой транскриптом и протеом в ответ на всевозможные сигналы. Как уже было сказано ранее, каждый интрон определяется 3 консервативными последовательностями в 5 , 3 сплайс сайтах и точке ветвления, в свою очередь выбор между экзонами в-основном определяется относительно короткими (примерно 6 нуклеотидов) последовательностями, расположенными как внутри экзонов, так и интронов, с которыми связываются сплайсинг усиливающие и заглушающие белки регуляторы (Lim L.P., 2001). Кроме этого, последние исследования демонстрируют, что регуляторные решения принимаются и на более поздних этапах сплайсинга, например при переходе от кросс-экзонного А подобного комплекса к кросс-интронному В комплексу и даже после первой трансэтерефикационной реакции (Bonnal S., 2008). Более того, было показано, что сплайсосома ответственна за созревание 3 конца теломеразной РНК, который формируется после отрезания от пре мРНК в ходе реакции, схожей с первым каталитическим шагом сплайсинга (Box J.A., 2008). При этом, второй шаг не происходит, что свидетельствует о наличии путей отрицательной регуляции сплайсосомы даже на поздних стадиях. Однако, зависимость сплайсинга от сложной сети РНК-РНК, РНК-белковых и белок белковых взаимодействий увеличивает вероятность появления мутаций, которые могут нарушать регуляцию и вызывать многие заболевания. В настоящее время, считается что более 50% генетических болезней обусловлены нарушениями в функционировании и регуляции сплайсосомы (Cartegni L., 2002а). Наиболее характерными примерами являются спинная мышечная атрофия, миотонические дистрофии первого и второго типа, пигментный ретинит, амиотрофный боковой склероз и т.д. (Cooper Т.А., 2009).
Интересно отметить, что хотя сплайсосома состоит из множества белков и 5 мяРНП, было найдено всего несколько мутаций в ядре сплайсосомы, приводящие к заболеваниям. Можно предположить, что такие мутации несовместимы с жизнью на клеточном уровне или во время раннего развития. Выявленные мутации в 4 генах (PRPF31, PRPF8, PRPF3, RP9), связанные с нарушениями в основе сплайсосомального механизма, вызывают одну и туже аутосомную доминантную форму пигментного ретинита. По всей видимости, нарушения в чувствительности фоторецепторов отражают неспособность клеток процессировать достаточное количество мРНК с увеличенной экспрессией, как например, гена родопсина (Mordes D., 2007).
Таким образом, большая часть заболеваний вызванных отклонениями в сплайсинге связано с изменениями проявляющимися на уровне пре-мРНК. Мутации в наиболее изученных консервативных интрон-определяющих последовательностях отвечают за 9-10% всех генетических заболеваний вызванных точечными мутациями (Cartegni L., 2002а; Wang G.S., 2007). С другой стороны, влияние мутаций во вспомогательных последовательностях, с которыми связываются белки регуляторы, определена лишь частично. Хотя значительная часть образованной ими сети взаимодействий уже расшифрована, все еще невозможно определить, исходя из генетической последовательности, будут ли мутации, связанные с болезнями, нарушать сплайсинг. Дополнительные трудности вносит тот факт , что роль синонимичных (по отношению к аминокислотному коду) замен на развитие патогенных процессов в настоящее время малоизучены, хотя было
показано, что до 25% молчащих мутаций могут разрушать сплайсинг, так же эффективно как и не синонимичные замены или терминирующие кодоны (Pagani F., 2005). Среди множества задокументированных экзонных мутаций, приводящих к отклонениям в сплайсинге, можно выделить несколько наиболее изученных, которые впервые стали лечить с использованием РНК-связанных методов.
Ярким примером того, к чему может привести точечная замена в экзонной регуляторной области является мутация в гене SMN (СМН2), которая вызывает спинную мышечную атрофию (СМА) (Lefebvre S., 1995). СМН - этот белок, экспрессируемый в клетках всех тканей, играет важную роль в биогенезе мяРНП и является ключевым для жизнеспособности клеток эукариот (Neuenkirchen N., 2008). СМА - это распространенное, обычно смертельное дегенеративное заболевание двигательных нейронов и основная, среди генетических, причина детской смертности (Wirth В., 2006). Тяжесть СМА связана со степенью дефицита СМН белка. У человека есть два СМН гена (СМН1 и СМН2), которые кодируют одинаковую одинаковую рамку считывания. У подавляющего большинства больных есть только СМН2, к тому же имеющий функциональные недостатки, вызванные одиночной нуклеотидной заменой С на Т в положении 6 экзона 7. Эта мутация, хотя и не меняет закодированную аминокислоту, значительно влияет на профиль сплайсинга СМН2 пре-мРНК, приводя к частому исключению экзона 7, и как следствие образование нестабильной формы белка, у которой отсутствуют последние 16 аминокислот (Wirth В., 2006).
Анализ изменения экспрессии мРНК сплайсосомальных белков
Испытуемые выполняли нагрузочное тестирование на беговой дорожке "до отказа", время тестирования составляло 13-16 мин, что достаточно для активации системы генов раннего ответа (10 мин), соизмеримо с известной кинетикой сплайсинг реакции in vitro (6-8 мин инициация, формирование пре-каталитической сплайсосомы, 10-15 мин образование продукта), однако не достаточно для запуска вторичных адаптационных механизмов, которые могли бы повлиять на результаты исследования.
Необходимо также отметить, что сплайсинг - это фундаментальный процесс, проходящий во всех клетках организма, что в рамках данного исследования позволяет пренебречь возможными тканеспецифичными эффектами и считать изменения экспрессии в лейкоцитах достоверными.
В образцах крови спортсменов определяли следующие биохимические показатели: общий белок, альбумин, общий холестерин, триглицериды, мочевина, креатинин, мочевая кислота, креатинфосфокиназа (КФК), аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (ACT) и глюкоза.
Известно, что при обезвоживании повышается концентрация как общего белка, так и альбумина. Нагрузочное тестирование не вызвало значимой потери жидкости в результате потоотделения, что подтверждается отсутствием значимых различий между уровнями этих показателей до и после нагрузки.
Уровни мочевины, креатинина и мочевой кислоты говорят об отсутствии активных катаболических процессов в организме спортсменов. Активность цитоплазматических ферментов (АЛТ, ACT) находилась в пределах среднефизиологических значений до нагрузки, что говорит об отсутствии повреждений мышечных волокон (скелетная мускулатура и миокард) и гепатоцитов. Значимое повышение
представлен нескольким олигонуклеотидами. На чип наносят образцы меченных кРНК, которые взаимодействуют с комплиментарными партнерами, после чего детектируют флуоресцентный сигнал, интенсивность которого пропорциональна количеству транскрипта. Метод позволяет проводить одновременный широкий генетический скрининг множества образцов, полученных при разных условиях и/или из разных тканей.
Спортсмены, участвующие в нагрузочном тестировании, для получения более достоверных результатов были разделены на две группы (Таб. 1).
Образцы мРНК спортсменов первой группы (4 чел) в целях оценки воспроизводимости результатов были проанализированы в двух повторениях. Полученные результаты использовали для отбора дифференциально экспрессируемых генов-кандидатов.
Полученные с помощью Affymetrix Command Console интенсивности проб были импортированы в среду R и обработаны с помощью библиотеки xps. Экспрессия мРНК была рассчитана с помощью реализованного в xps алгоритма суммирования RMA с использованием квантильной нормализации и преобразована в логарифмический масштаб. Используя информацию из записи GO:0000398 базы данных Gene Ontology (145 генов) и данные литературы (271 ген), был сформирован список из 303 связанных со сплайсингом генов, присутствующих на чипе.
Данные по образцам были использованы для расчета моделируемой парной t-статистики по выбранным 303 генам. Расчет проводился в среде R с помощью библиотеки limma. Данные с дублирующихся чипов были представлены как технические копии. При выбранном уровне достоверности /К0.05 было получено 26 генов-кандидатов.
Образцы мРНК второй группы спортсменов (7 чел, Таб. 1) анализировали - и результаты использовали для верификации дифференциальной экспрессии полученных генов-кандидатов.
Используя данные образцов из второй группы, значения "до" и "после" каждого из 26 генов сравнивались парным критерием Вилкоксона. Значения вероятностей были скорректированы поправкой Хоммеля. При р 0.05 было получено 5 генов со статистически значимым изменением экспрессии (Рис. 13).
Анализ соотношения фосфорилированных /нефосфорилированных форм сплайсосомальных белков
Перед нанесением образцов на ПААГ мы объединяли образцы полученные из мононуклеаров разных спортсменов перед нанесением из на ПААГ, так как количество крови, которое можно отобрать у одного спортсмена без ущерба для его состояния и количество выделяемого белка в образцах до нагрузки может оказаться недостаточным. После гель-электрофореза белки из геля переносили на ПВДФ мембрану стандартным образом. Места возможного неспецифического связывания и иммуноблотинг проводили аналогично контрольным экспериментам с ядерным экстрактом. до после
Из представленных рисунков видно, что в случае aHTH-Snull4 антител в обоих случаях сигналы примерно одинаковой интенсивности, это подтверждает соизмеримое количество белка нанесенного на ПААГ в составе тотального лизата. В случае же aHTH-SF3bl55 антител распределение полос меняется. Появившиеся в обоих случаях неспицифические сигналы видимо объясняются кроссреакцией с какими-то цитоплазматическими белками и/или частичной деградацией самого белка в ходе лизиса. Основное же отличие между двумя образцами в следующем: в образце полученном после нагрузки большинство SF3M55 представлено в фосфорилированной форме (сигнал от немодифицированного белка выделен на рисунке красным).
По всей видимости это объясняется резко возросшей активностью сплайсинга после начала физических нагрузок. Увеличившаяся скорость инициации приводит к тому, что в первые минуты развития стресса практически весь имеющийся в клетках белок включается в состав каталитически-активных сплайсосом.
Обозначим доли пре-мРНК гена IR, связавшейся с энхансером и супрессором сплайсинга соответственно как qE и qs. Известно, что: а) белки MBNL необходимы для экспрессии изоформы IR-B вне зависимости от концентраций CUG-BP и hnRNP Н; б) повышение уровня CUG-BP или hnRNP Н в здоровых клетках снижает уровень экспрессии изоформы IR-B; в) Сайт связывания белков MBNL отличен от сайта связывания CUG-BP и hnRNP Н. Следовательно, супрессоры и энхансеры скорее всего независимо влияют на соотношение изоформ, и можно рассматривать qE и qs их как вероятности независимых событий «запрета» и «разрешения» включения экзона 11. Вероятность выработки изоформы IR-B в таком случае можно представить как совместную вероятность событий с вероятностями qE и (І-qs), равную p=qE-(l-qs).
Взаимодействие энхансера MBNL и супрессоров GUG-BP и hnRNP Н с пре-мРНК гена IR можно описать кинетической моделью (1), где Si— концентрация мРНК, свободной от MBNL; S2 — концентрация мРНК, свободной от hnRNP Н и CUG-BP; М — концентрация свободного MBNL; SjM — концентрация комплекса пре-мРНК и MBNL, С— концентрация свободного CUG-BP; S2C — концентрация комплекс пре-мРНК и CUG-BP; S2H— концентрация комплекса пре-мРНК и hnRNP Н; НМ— концентрация комплекса hnRNP Н и MBNL; k+N, k.N — скорости прямых и обратных реакций.
Подставив первые пять уравнений в оставшиеся четыре, решая систему (3) относительно [SjM], [S2C], [HM],[S2H] можно найти вероятность включения экзона р = [S{M]- ([S0]- [S2C])/[S0f.
При создании модели были приняты следующие допущения:
l.He учитывался аллостерический характер связывания MBNL с сайтом мРНК IR (константа Хилла 1.4). Предполагалось, что все вещества имеют один центр связывания.
2.Различные белки группы MBNL рассматривались как один белок. Для верификации модели были использованы данные работы [7], где приведены результаты сравнения соотношения изоформ IR-A и IR-В в нормальных и МД1 линиях миобластов и фибробластов с различными комбинациями воздействий на уровень экспрессии РНК-связывающих белков малыми интерферирующими РНК и рекомбинантными аденовирусными векторами.
Константы диссоциации были приняты равными Kdi=0.02 мкМ, Kd2=0.6 мкМ, Kd3=0.02 мкМ, Kd4=0.6 мкМ. Общая концентрация пре-мРНК была принята равной S0=0.4 мкМ, общая концентрация MBNL рассматривалась в диапазоне М0П(0;1) мкМ, общие концентрации CUG-BP и MBNL считались равными и рассматривались в диапазоне Н0=С0П(0;0.5) мкМ. Константы выбирались из соображений обеспечения наибольшего соответствия модели литературным данным. Было рассчитано значение р в указанных диапазонах концентраций РНК-связывающих белков. Сравнение литературных данных (столбцы «Норма» и «ДМ») с результатами моделирования (столбцы «Норма-модель» и «ДМ-модель») сведены в таблицу 9.
![Влияние санаторно-курортных факторов на состояние эндотелиальной регуляции сосудистого тонуса у больных с метаболическим синдромом [Электронный ресурс]](/i/i/4611/197232.png "Влияние санаторно-курортных факторов на состояние эндотелиальной регуляции сосудистого тонуса у больных с метаболическим синдромом [Электронный ресурс] Вовк Лариса Ивановна")
![Влияние регуляции микроэкологических нарушений кишечника на течение затяжных конъюгационных гипербилирубинемий [Электронный ресурс]](/i/i/4470/196295.png "Влияние регуляции микроэкологических нарушений кишечника на течение затяжных конъюгационных гипербилирубинемий [Электронный ресурс] Ковалева Оксана Васильевна")